花婧等

摘要：大小蠹屬昆蟲(chóng)是重要的林木害蟲(chóng)，大部分種類(lèi)是檢疫性有害生物，我國(guó)口岸有多次截獲記錄。為加強(qiáng)對(duì)大小蠹屬害蟲(chóng)的檢疫鑒定，通過(guò)線粒體DNA細(xì)胞色素氧化酶C亞基Ⅰ基因（COⅠ）867 bp片段序列對(duì)大小蠹屬17個(gè)種類(lèi)進(jìn)行序列分析，結(jié)果表明，線粒體COⅠ基因可作為大小蠹屬昆蟲(chóng)分類(lèi)的依據(jù)；DNA條形碼是生物系統(tǒng)分類(lèi)分子水平上的依據(jù)。

關(guān)鍵詞：大小蠹屬；線粒體基因；遺傳距離；COⅠ基因

中圖分類(lèi)號(hào)： S763.380.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2014）03-0030-03

目前，世界范圍內(nèi)已報(bào)道大小蠹屬（Dendroctonus）昆蟲(chóng)19種[1-2]，作為鞘翅目中最進(jìn)化的1個(gè)類(lèi)群，其危害范圍較廣，是重要的森林害蟲(chóng)。大小蠹屬為樹(shù)皮小蠹類(lèi)[3-4]，全部種類(lèi)均侵食樹(shù)干，成蟲(chóng)時(shí)初入侵韌皮部，后筑母坑道于形成層與邊材之間。一般情況下，大小蠹屬只危害活的直立木和由于年齡、干旱或其他生物學(xué)因素導(dǎo)致的衰弱木，在盛發(fā)期也危害茁壯的健康樹(shù)，寄主包括松屬、云杉屬、黃杉屬和落葉松屬等經(jīng)濟(jì)樹(shù)種。

目前，昆蟲(chóng)鑒定以傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定為主，該方法存在一定的缺陷，表型可塑性（phenotypic plasticity）和遺傳可變性（genetic variability）容易造成鑒定結(jié)果不正確，無(wú)法鑒定許多群體中普遍存在的隱存分類(lèi)單元，受生物性別和發(fā)育階段的限制，很多生物無(wú)法被鑒定?，F(xiàn)代交互式鑒定系統(tǒng)是昆蟲(chóng)鑒定的一個(gè)很大進(jìn)步，但它要求專(zhuān)業(yè)技術(shù)很高，操作不正確就易導(dǎo)致鑒定錯(cuò)誤[5]。快速準(zhǔn)確的物種鑒定是深入開(kāi)展行為學(xué)、生態(tài)學(xué)以及生理學(xué)等相關(guān)研究的必要前提和基礎(chǔ)[6]。

國(guó)內(nèi)外大小蠹研究多集中于形態(tài)學(xué)分類(lèi)，有關(guān)該類(lèi)群分子鑒定技術(shù)的研究報(bào)道尚少。本研究通過(guò)對(duì)大小蠹屬COⅠ基因片段序列進(jìn)行比對(duì)，對(duì)同源序列堿基多樣性及系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行分析，以期利用DNA條形碼技術(shù)快速、準(zhǔn)確地鑒定大小蠹種類(lèi)，為進(jìn)一步研究小蠹科昆蟲(chóng)分子鑒定技術(shù)提供理論依據(jù)和實(shí)踐基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 昆蟲(chóng)種類(lèi)及序列信息

本研究以大小蠹屬17個(gè)種類(lèi)作為研究對(duì)象（表1），序列均從GenBank下載。

1.2 分析方法

應(yīng)用MEGA5.05軟件進(jìn)行序列比對(duì)、拼接和剪切，基于Kimura 2-parameter模型，計(jì)算各分類(lèi)單元之間的遺傳距離及其標(biāo)準(zhǔn)差、序列堿基組成、保守位點(diǎn)、變異位點(diǎn)、轉(zhuǎn)換/顛換比值等[7]。應(yīng)用MEGA5.05軟件，使用鄰接法（NJ）構(gòu)建分子系統(tǒng)樹(shù)，1 000次循環(huán)估計(jì)系統(tǒng)樹(shù)中節(jié)點(diǎn)的自舉置信水平，堿基轉(zhuǎn)換和顛換賦予相同的加權(quán)值，查看系統(tǒng)樹(shù)[8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 mtDNA COⅠ基因序列組成和變異

應(yīng)用MEGA 5.05軟件對(duì)17個(gè)大小蠹COⅠ基因序列比

對(duì)剪齊后保留了869 bp的序列，其中第1個(gè)堿基為第1個(gè)氨基酸密碼子的啟示位點(diǎn)，為分析方便，共保留867 bp進(jìn)行序列分析。結(jié)果表明，在867個(gè)位點(diǎn)中沒(méi)有插入和缺失現(xiàn)象，其中保守位點(diǎn)、變異位點(diǎn)和簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)分別為525個(gè)、342個(gè)和248個(gè)，在867個(gè)位點(diǎn)中分別占60.6%、39.4%和286%；A、T、C、G平均含量分別為30.2%、37.9%、16.8%、15.1%，A+T含量較高，為68.1%。另外，雖然不同密碼子的A、T、C、G含量不相同，但都表現(xiàn)出明顯的A+T含量偏向性，特別是在密碼子的第3位，A+T含量高達(dá)83.1%，與典型的昆蟲(chóng)線粒體DNA堿基組成一致。密碼子第3位點(diǎn)G含量較少，只有4.6%，并且在不同種間差異較大（2.1%～74%），C含量在不同種群間差異也很大（6.4%～20.9%）。

2.2 堿基替換分析

采用MEGA5.05軟件對(duì)所測(cè)基因序列替換數(shù)進(jìn)行估計(jì)，由表2可見(jiàn)，17種大小蠹COⅠ基因867個(gè)核苷酸序列中，核苷酸替換多為同義替換（ii）。全組數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換與顛換的平均比值為1.79，在第1、2、3位點(diǎn)的比值分別為3.63、1.68、1.58，轉(zhuǎn)換較為頻繁，這是昆蟲(chóng)mtDNA的一個(gè)普遍特點(diǎn)；轉(zhuǎn)換發(fā)生以CT為主（73.0%），顛換以AT為主（933%）。轉(zhuǎn)換與顛換主要發(fā)生在密碼子第3位點(diǎn)上，轉(zhuǎn)換58個(gè)，其頻率為總數(shù)的77.3%，顛換37個(gè)，其頻率為總數(shù)的881%；第2位點(diǎn)最少，只有2個(gè)位點(diǎn)發(fā)生了轉(zhuǎn)換，1個(gè)位點(diǎn)發(fā)生了顛換，這與第3位點(diǎn)承擔(dān)較小的遺傳壓力有關(guān)。

2.3 遺傳距離分析

在分子進(jìn)化過(guò)程中，多重替換的存在嚴(yán)重干擾了序列之間真正的遺傳距離估算，很難直接從已對(duì)準(zhǔn)的序列中計(jì)算出真正的遺傳距離。要解決這個(gè)問(wèn)題，就需要對(duì)多重替換影響下的序列進(jìn)行校正?，F(xiàn)在有一些方法對(duì)序列進(jìn)化過(guò)程作出了不同的假設(shè)，在這些假設(shè)條件下來(lái)估計(jì)序列上核苷酸的替換數(shù)目。參數(shù)越多，對(duì)進(jìn)化過(guò)程的描述就越具體和詳細(xì)，相對(duì)計(jì)算也越復(fù)雜。

基于Kimura 2-parameter，采用MEGA5.05軟件分析大小蠹屬17種昆蟲(chóng)之間的遺傳距離[9]，并采用Bootstrap重抽樣1 000次進(jìn)行檢驗(yàn)。由表3可見(jiàn)，大小蠹屬17種昆蟲(chóng)平均遺傳距離為0.145，屬間遺傳距離介于0.083～0.191之間（>2%）。雖然大小蠹屬各物種之間的親緣關(guān)系十分接近，但可以達(dá)到分子水平不同種的鑒定要求。

2.4 大小蠹屬NJ系統(tǒng)發(fā)育重建

以楝星天牛（Anoplophora horsfieldi）為外群，采用MEGA5.05構(gòu)建大小蠹屬17個(gè)種的NJ分子系統(tǒng)樹(shù)，從構(gòu)建的NJ樹(shù)（圖1）來(lái)看，華山松大小蠹、杰松大小蠹、山松大小蠹聚為1支，科羅大小蠹、西部松大小蠹、間大小蠹、墨西哥大小蠹、南部松大小蠹聚為1支，黃杉大小蠹和落葉松大小蠹聚為1支，根大小蠹、紅脂大小蠹、黑脂大小蠹聚為1支，剩余幾種聚為1支，形成5大支格局。其中，華山松大小蠹、杰松大小蠹、山松大小蠹一支分化最快，依次為南部松大小蠹所在支、黃杉大小蠹和落葉松大小蠹所在支、根大小蠹所在支，云杉大小蠹所在支分化最慢，這與形態(tài)學(xué)分類(lèi)相一致。如山松大小蠹與杰松大小蠹、黃杉松大小蠹和落葉松大小蠹在形態(tài)學(xué)上相似，在分子系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)上也同樣關(guān)系相近，且從遺傳距離（表2）看，兩者的遺傳距離分別為0.083和0.092（>2%），說(shuō)明該段序列能夠作為分子鑒定的依據(jù)。

3 小結(jié)與討論

Hebert等對(duì)包括脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物界的COⅠ基因序列比較分析，得出除腔腸動(dòng)物外、98%物種的種內(nèi)遺傳距離差異為0%～2%的結(jié)論。本研究各種大小蠹昆蟲(chóng)間的遺傳距離表明，該片段在種間平均距離為0.145，可以較好區(qū)分大小蠹屬的不同種類(lèi)。同時(shí)，基于Kimura 2-parameter雙參數(shù)模型構(gòu)建的NJ樹(shù)結(jié)果與形態(tài)學(xué)分類(lèi)結(jié)果基本一致，能滿足種類(lèi)鑒定的需要。

本研究利用NCBI中已公開(kāi)的部分大小蠹COⅠ序列，通過(guò)線粒體COⅠ基因序列比較，分析各種間遺傳距離及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建，發(fā)現(xiàn)利用該段序列能夠較好地區(qū)分近緣種，且與形態(tài)學(xué)分類(lèi)相似度高，證實(shí)了基于線粒體COⅠ基因的DNA條形碼技術(shù)在小蠹科大小蠹屬昆蟲(chóng)分子鑒定上具有可行性，既能夠解決植物檢疫中截獲的大小蠹幼蟲(chóng)或殘缺成蟲(chóng)的鑒定問(wèn)題，又能為小蠹科昆蟲(chóng)DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)的構(gòu)建提供理論依據(jù)及實(shí)踐基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1]Wood S L. The bark and ambrosia beetles of north and central America（Coleoptera：Scolytidae），a taxonomic monograph[M]. Prove：Brigham Young University，1982.

[2]殷惠芬，黃復(fù)生，李兆麟. 中國(guó)經(jīng)濟(jì)昆蟲(chóng)志 第29冊(cè)：鞘翅目小蠹科[M]. 北京：科學(xué)出版社，1984：56-58.

[3]Diaze E，Cisnerosr R，Zunigag G，et al. Comparative anatomical and histological study of the alimentary canal of Dendroctonus parallelocollis，D. rhizophagus，and D. valens（Coleoptera：Scolytidae）[J]. Annals of Entomological Society of America，1998，91（4）：479-487.

[4]Hopkins A D. Contributions toward a monograph of the scolytid beetles[M]. USDA：Bureau of Entomology Technical Bulletin，1909.

[5]劉 勇，宋 毓，李曉宇. 基于線粒體COⅠ基因的DNA條形碼技術(shù)在昆蟲(chóng)分子鑒定中的應(yīng)用[J]. 植物檢疫，2010，24（2）：46-50.

[6]Dayrat B. Towards integrative taxonomy[J]. Biol J Linn Soc，2005，85（3）：407-415.

[7]蔣 青，梁憶冰，王乃揚(yáng)，等. 有害生物危險(xiǎn)性評(píng)價(jià)的定量分析方法研究[J]. 植物檢疫，1995，9（4）：208-211.

[8]田 鵬，劉占林. 分子系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建的簡(jiǎn)易方法[J]. 生物信息學(xué)，2009，7（3）：232-233.

[9]李 培. 緣蝽科昆蟲(chóng)線粒體COⅠ基因的分子系統(tǒng)學(xué)研究（半翅目：異翅亞目）[D]. 西安：陜西師范大學(xué)，2007：1-57.

3 小結(jié)與討論

Hebert等對(duì)包括脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物界的COⅠ基因序列比較分析，得出除腔腸動(dòng)物外、98%物種的種內(nèi)遺傳距離差異為0%～2%的結(jié)論。本研究各種大小蠹昆蟲(chóng)間的遺傳距離表明，該片段在種間平均距離為0.145，可以較好區(qū)分大小蠹屬的不同種類(lèi)。同時(shí)，基于Kimura 2-parameter雙參數(shù)模型構(gòu)建的NJ樹(shù)結(jié)果與形態(tài)學(xué)分類(lèi)結(jié)果基本一致，能滿足種類(lèi)鑒定的需要。

本研究利用NCBI中已公開(kāi)的部分大小蠹COⅠ序列，通過(guò)線粒體COⅠ基因序列比較，分析各種間遺傳距離及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建，發(fā)現(xiàn)利用該段序列能夠較好地區(qū)分近緣種，且與形態(tài)學(xué)分類(lèi)相似度高，證實(shí)了基于線粒體COⅠ基因的DNA條形碼技術(shù)在小蠹科大小蠹屬昆蟲(chóng)分子鑒定上具有可行性，既能夠解決植物檢疫中截獲的大小蠹幼蟲(chóng)或殘缺成蟲(chóng)的鑒定問(wèn)題，又能為小蠹科昆蟲(chóng)DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)的構(gòu)建提供理論依據(jù)及實(shí)踐基礎(chǔ)。

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[9]李 培. 緣蝽科昆蟲(chóng)線粒體COⅠ基因的分子系統(tǒng)學(xué)研究（半翅目：異翅亞目）[D]. 西安：陜西師范大學(xué)，2007：1-57.

3 小結(jié)與討論

Hebert等對(duì)包括脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物界的COⅠ基因序列比較分析，得出除腔腸動(dòng)物外、98%物種的種內(nèi)遺傳距離差異為0%～2%的結(jié)論。本研究各種大小蠹昆蟲(chóng)間的遺傳距離表明，該片段在種間平均距離為0.145，可以較好區(qū)分大小蠹屬的不同種類(lèi)。同時(shí)，基于Kimura 2-parameter雙參數(shù)模型構(gòu)建的NJ樹(shù)結(jié)果與形態(tài)學(xué)分類(lèi)結(jié)果基本一致，能滿足種類(lèi)鑒定的需要。

本研究利用NCBI中已公開(kāi)的部分大小蠹COⅠ序列，通過(guò)線粒體COⅠ基因序列比較，分析各種間遺傳距離及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建，發(fā)現(xiàn)利用該段序列能夠較好地區(qū)分近緣種，且與形態(tài)學(xué)分類(lèi)相似度高，證實(shí)了基于線粒體COⅠ基因的DNA條形碼技術(shù)在小蠹科大小蠹屬昆蟲(chóng)分子鑒定上具有可行性，既能夠解決植物檢疫中截獲的大小蠹幼蟲(chóng)或殘缺成蟲(chóng)的鑒定問(wèn)題，又能為小蠹科昆蟲(chóng)DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)的構(gòu)建提供理論依據(jù)及實(shí)踐基礎(chǔ)。

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[8]田 鵬，劉占林. 分子系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建的簡(jiǎn)易方法[J]. 生物信息學(xué)，2009，7（3）：232-233.

[9]李 培. 緣蝽科昆蟲(chóng)線粒體COⅠ基因的分子系統(tǒng)學(xué)研究（半翅目：異翅亞目）[D]. 西安：陜西師范大學(xué)，2007：1-57.