宋玉民 李文娟 楊美玲

(西北師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，蘭州730070)

稀土元素是21世紀(jì)具有戰(zhàn)略地位的元素，憑借其獨(dú)特的光、電、磁等物理化學(xué)特性，廣泛應(yīng)用于國(guó)民經(jīng)濟(jì)和國(guó)防工業(yè)的各個(gè)領(lǐng)域。被稱為“21世紀(jì)新材料的寶庫(kù)”[1]。在最近幾年，稀土元素由于其重要的生物活性和藥理學(xué)作用，越來(lái)越受到人們的關(guān)注[2-3]。全反式維甲酸(retinoic acid，ATRA)又稱維生素A酸，是維生素A(retinol)的衍生物，更是機(jī)體正常發(fā)育和各種生理功能所必須的物質(zhì)。維生素甲類化合物(簡(jiǎn)稱維甲類化合物，Retinoid)在腫瘤防治上的潛力已經(jīng)引起了廣泛的注意。李海燕等報(bào)道了全反式維甲酸對(duì)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞侵襲能力的影響[4]，探討了ATRA對(duì)人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721遷移侵襲能力的影響，為ATRA應(yīng)用于臨床的肝癌治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。戴洪海等報(bào)道了9-順維甲酸(RA)誘導(dǎo)肺癌組織RARβ轉(zhuǎn)錄的研究[5]，探討了RA的抑瘤分子機(jī)制，為臨床應(yīng)用RA治療肺癌提供了某些理論依據(jù)。胡寶光等報(bào)道了全反式維甲酸對(duì)人結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞化療藥物敏感性及Survivin基因表達(dá)的影響[6]，探討ATRA對(duì)其化療藥物敏感性的影響，并通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Survivin的表達(dá)情況分析產(chǎn)生這些作用的可能機(jī)制，為進(jìn)一步臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。這些研究為維甲類化合物在醫(yī)藥衛(wèi)生方面的應(yīng)用拓寬了道路。但由于維甲酸類化合物具有一定的毒副作用，長(zhǎng)期大量服用可引起嚴(yán)重中毒，因此限制了其在藥理上的應(yīng)用。氨基酸是生物體內(nèi)大量存在的一類生物大分子，是蛋白質(zhì)、酶等的基本結(jié)構(gòu)單元，也是生命體存在的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，許多氨基酸的金屬配合物具有抗菌，抗炎，抗癌和拮抗作用等生物活性，其衍生物已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥方面[7]。以鄰菲啰啉作為第一配體和以天冬氨酸，蛋氨酸，亮氨酸等作為第二配體的稀土三元配合物目前已有研究報(bào)道[8]。何其莊等[9]發(fā)表了稀土天冬氨酸鄰菲咯啉三元配合物的合成、表征及其生物活性研究，探索了該類稀土三元配合物的抗癌活性，為該類配合物在殺菌抗癌藥物、分子生物學(xué)、生物工程技術(shù)及其他相關(guān)領(lǐng)域的應(yīng)用提供了一定的依據(jù)，對(duì)于設(shè)計(jì)合成出具有應(yīng)用價(jià)值的低毒、抗菌、抗癌藥物有十分重要的指導(dǎo)意義。李小慧[10]等發(fā)表了稀土-L-亮氨酸-鄰菲啰啉的配合物合成及其抑菌活性，這為考察稀土配合物的生物活性和進(jìn)一步探索新型、高效、低毒、副作用小的稀土抑菌藥物提供參考，它們對(duì)生態(tài)環(huán)境和人類健康,有著重要意義。為降低維甲酸分子在作為藥物使用時(shí)的毒副作用和增加生物所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，本文報(bào)道了稀土離子 (Nd3+、Eu3+、La3+、Sc3+)-全反式維甲酸-精氨酸三元配合物的合成表征和其抗腫瘤活性進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果。表明配合物的抗腫瘤活性基本強(qiáng)于配體全反式維甲酸、L-精氨酸鹽酸鹽和相應(yīng)的金屬硝酸鹽。稀土配合物對(duì)3種癌細(xì)胞株生長(zhǎng)的抑制作用也基本上隨配合物濃度的增大而增強(qiáng)。為了解配合物的抗腫瘤作用的原因，采用光譜方法和粘度法對(duì)配合物與DNA之間的相互作用方式進(jìn)行了考察，為研究配合物的生物活性與DNA作用方式之間的聯(lián)系提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)[11]，也為進(jìn)一步探索新型、高效、長(zhǎng)效、安全、穩(wěn)定、副作用小的抗腫瘤藥物提供了參考。目前關(guān)于維生素甲酸抗腫瘤研究國(guó)內(nèi)已有報(bào)道,但全反式維甲酸與稀土和精氨酸配合物的合成及其抗腫瘤活性報(bào)道較少。

圖1 全反式維甲酸的分子結(jié)構(gòu)Fig.1 Molecular structure of all-trans retinoic acid

圖2 L-精氨酸鹽酸鹽的分子結(jié)構(gòu)Fig.2 Molecular structure of L-arginine acid hydrochloride

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

TJ270230型紅外光譜儀 (DIGILAB公司)；RF-540熒光分光光度計(jì)(日本島津公司)；UV-3400紫外分光光度計(jì)(日本島津公司)；TB285型恒溫器(日本島津公司)；LDZX4OCI型立式自動(dòng)壓力蒸汽滅菌鍋(上海中安醫(yī)療器械廠)；DHG9070A型電熱恒溫干燥箱(上海益恒實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；數(shù)顯智能控溫磁力攪拌器 (鞏義市英峪予儀器廠)；R-1002旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)；二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱 (力康heal force hf90/hf240)；酶標(biāo)儀(Bio-Rad,model 550)。

全反式維甲酸C20H28O2(鄭州天健生物技術(shù)有限公司)；L-精氨酸鹽酸鹽 C6H14N4O2·HCl(生化試劑，北京醫(yī)藥站)；稀土硝酸鹽用氧化物制備；溴化乙錠(EB)購(gòu)自華美生物工程公司，其它試劑均為分析純，水為二次蒸餾水，Tris-HCl緩沖溶液(pH=7.34)。

1.2 配合物的合成

稱取2 mmol全反式維甲酸于圓底燒瓶中，加10 ml無(wú)水乙醇，在60℃水浴下加熱攪拌使其全部溶解，分別向該溶液中先后加入含1 mmol六水合稀土硝酸鹽水溶液和含1 mmol L-精氨酸鹽酸鹽(LArg)水溶液。滴加完畢后，用濃NH3·H2O調(diào)節(jié)pH=6.0～7.0。在 60℃恒溫下持續(xù)加熱攪拌回流 7 h，35℃水浴下旋蒸得粉末狀粗產(chǎn)物。用二次蒸餾水和無(wú)水乙醇洗滌粗產(chǎn)物3次，置于30℃烘箱中烘干，即得到稀土-全反式維甲酸-精氨酸三元配合物。

配體及其配合物用無(wú)水乙醇和Tris-HCl緩沖溶液溶解，配制成1 mmol·L-1的溶液待用。

1.3 配合物抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，并置于37℃，5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中，細(xì)胞呈單層貼壁生長(zhǎng)，用倒置的顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況和貼壁形態(tài)，并取指數(shù)生長(zhǎng)期的腫瘤細(xì)胞(HepG2、A549 和 Hela)用于實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 配合物溶液配制

用高壓滅菌過(guò)的2 mL塑料小試管稱取一定量的三元配合物，用少量DMSO溶解之后，再用PBS緩沖溶液稀釋至 10-8～10-3mol·L-1。

1.3.3 細(xì)胞活力的測(cè)試

將細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板 (細(xì)胞密度1×104mL-1)中，待貼壁后分別加入不同濃度的三元配合物20 μL(含 0.1 μL 的 DMSO)和 180 μL 的培養(yǎng)基，對(duì)照組加等體積的1640培養(yǎng)基，每組6復(fù)孔，平行4復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后，每孔加MTT溶液10 μL，培養(yǎng)箱中孵育4 h后終止培養(yǎng)，棄去上清液后每孔加入150 μL的DMSO，振蕩5 min后用酶標(biāo)儀(波長(zhǎng)560 nm)測(cè)定其吸光度值，計(jì)算細(xì)胞的生長(zhǎng)存活率。用只加培養(yǎng)液而不加細(xì)胞的孔調(diào)零[12]。細(xì)胞存活率按下列公式計(jì)算：

細(xì)胞存活率%=實(shí)驗(yàn)組A570/對(duì)照組A570×100%，抑制率%=1-細(xì)胞存活率%。

1.4 配合物與DNA作用的研究

1.4.1 熒光光譜與紫外光譜

1.4.1.1 DNA 對(duì) 4 種配合物熒光光譜的影響

取濃度為 1×10-4mol·L-1的配合物溶液 3 mL，在激發(fā)波長(zhǎng)為425 nm條件下掃描其熒光光譜。在該溶液中加入DNA(1 mmol·L-1)的溶液，搖勻靜置0.5 h后在上述條件下掃描配合物-DNA體系熒光發(fā)射譜圖。

1.4.1.2 配合物對(duì)EB-DNA體系熒光強(qiáng)度的影響

在 EB-DNA 體系溶液中(cEB/cDNA=12.5)，加入配合物溶液，0.5 h后，在上述條件下掃描其熒光發(fā)射譜圖。

1.4.1.3 EB 對(duì)配合物-DNA 體系熒光強(qiáng)度的影響

在配合物-DNA(c配合物/cDNA=2.5)體系中，加入不同量的 EB(1.25 mmol·L-1)，0.5 h 后，在給定的條件下掃描其熒光發(fā)射譜圖。

1.4.1.4 配合物-DNA 體系的紫外光譜

以緩沖溶液為參比，掃描配合物溶液 (4×10-4mol·L-1)、DNA 的溶液 (4×10-4mol·L-1)、 配合物與DNA的混合溶液在200～500 nm的紫外光譜。

1.4.2 粘度研究

取 DNA(1 mmol·L-1)溶液 7.5 mL，加入不同量的配合物和緩沖溶液，溶液的總體積為15mL，混合后1、48、96 h測(cè)其粘度。采用同樣的方法測(cè)EBDNA溶液粘度，以DNA溶液為參比得相對(duì)粘度。

2 結(jié)果與討論

2.1 配合物的表征

2.1.1 配合物的組成及一般性質(zhì)

合成得到的 4 種稀土(Nd3+、Eu3+、La3+、Sc3+)-全反式維甲酸-精氨酸的配合物分別為深黃色、橙色、深橙色、和土黃色粉末狀固體，產(chǎn)率為71%左右。較易溶于無(wú)水乙醇和DMSO，難溶于水，其溶解性不同于單獨(dú)的稀土鹽、全反式維甲酸和L-精氨酸鹽酸鹽，經(jīng)洗滌和重結(jié)晶可提純。配合物的元素分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果與理論值基本吻合，結(jié)合熱重分析測(cè)試結(jié)果推測(cè)配合物的化學(xué)組成為REL2L′Cl·nH2O。元素分析結(jié)果如表1。

2.1.2 紅外光譜

以KBr壓片，在400～4 000 cm-1范圍內(nèi)測(cè)定了配體及各種配合物的紅外光譜。圖3和圖4分別為配體全反式維甲酸和L-精氨酸鹽酸鹽以及4種配合物的紅外圖譜。從圖中可以看出，配合物和配體的紅外光譜圖有較大的區(qū)別，而配合物的譜圖之間卻極為相似，說(shuō)明各配合物的組成和結(jié)構(gòu)相似。配合物與配體相比，配體某些特征吸收峰在配合物中發(fā)生了明顯的位移，強(qiáng)度也有著相應(yīng)的變化，說(shuō)明全反式維甲酸、精氨酸與稀土離子發(fā)生了配位。

表1 配合物的元素分析Table 1 Elemental analysis of complexes

圖3 配體全反式維甲酸和L-精氨酸鹽酸鹽紅外圖譜Fig.3 IR spectra of ligands

圖4 4種配合物的紅外圖譜Fig.4 IR spectra of complexes

全反式維甲酸分子的羧酸中的羰基振動(dòng)峰出現(xiàn)在1 685.78 cm-1，O-H的面外變形振動(dòng)吸收峰出現(xiàn)在 1 050～950 cm-1；精氨酸鹽酸鹽在 1 683.33 cm-1處有一羰基振動(dòng)峰，O-H的面外變形振動(dòng)吸收峰出現(xiàn)在950～900 cm-1。而配合物中的羰基峰出現(xiàn)在1 650.92 cm-1，1 656.31 cm-1，1 662.52 cm-1，1 660.54 cm-1，1 100～900 cm-1范圍無(wú)吸收，推測(cè)2種配體的羧酸失去質(zhì)子，羧基的羥基氧和羰基氧與稀土離子（Ⅲ）發(fā)生了配位作用 。在 741.51 cm-1，738.24 cm-1，739.54 cm-1，760.25 cm-1左右出現(xiàn)的 RE-O 振動(dòng)吸收峰進(jìn)一步說(shuō)明了全反式維甲酸、精氨酸與稀土離子發(fā)生了配位。配合物分別在 3 424.81 cm-1，3 424.01 cm-1，3 424.96 cm-1，3 412.06 cm-1處的一寬峰是配合物中水分子羥基的對(duì)稱和反對(duì)稱伸縮振動(dòng)，說(shuō)明在配合物中存在水分子。

游離的L-精氨酸鹽酸鹽在2 930.63 cm-1出現(xiàn)了NH3+的對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰，此峰仍然出現(xiàn)在配合物的紅外吸收?qǐng)D譜中，由此排除了L-精氨酸中氮原子配位的可能性[10]。圖中(L=全反式維甲酸，ATRA)；L′=L-精氨酸陽(yáng)離子，L-Arg)。

2.1.3 配合物的熱分解性質(zhì)

以α-Al2O3作為參比，在升溫速率10℃·min-1的N2氣氛中，掃描配合物從室溫到700℃的熱重-差熱(TG-DTA)曲線，數(shù)據(jù)列于表2。

圖5 配合物NdL2L′Cl的熱重-差熱譜圖Fig.5 TG-DTA curve of complex(NdL2L′Cl)

表2 配合物的TG-DTA數(shù)據(jù)Table 2 TG-DTA data of complexes

圖5為NdL2L′Cl·8H2O配合物的熱重-差熱譜圖，可以看出，室溫～200℃出現(xiàn)第一個(gè)失重臺(tái)階(失重率 14.1%)，200～450 ℃出現(xiàn)第二個(gè)失重臺(tái)階(失重率 57.8%)，450～550 ℃出現(xiàn)第三個(gè)失重臺(tái)階(失重率15.9%)，分別對(duì)應(yīng)著失去的 8 個(gè)水分子(結(jié)晶)，2 個(gè)維甲酸分子和1個(gè)精氨酸分子。1個(gè)吸熱峰和2個(gè)放熱峰分別出現(xiàn)在 80～120℃、200℃、500～510℃。到650℃左右時(shí)，熱重曲線趨于恒定 (總失重率為87.8%)，配合物最終分解產(chǎn)物為稀土氧化物，經(jīng)過(guò)計(jì)算與理論值基本相符。幾種配合物之間的熱譜圖相似，說(shuō)明它們的結(jié)構(gòu)也相似[13]。維甲酸在150℃出現(xiàn)失重開(kāi)始分解，并伴隨有吸熱峰產(chǎn)生，在250～260℃出現(xiàn)氧化放熱峰，600℃分解完全，總失重率為100%。精氨酸鹽酸鹽在240～250℃出現(xiàn)一個(gè)失重臺(tái)階，并伴隨有大的尖銳的吸熱峰出現(xiàn)，失重率16.1%，為 HCl分子的氣化，250～600 ℃出現(xiàn)第二個(gè)失重臺(tái)階，為精氨酸的骨架斷裂和氧化分解失重所致，吸熱峰出現(xiàn)在250～260℃，放熱峰出現(xiàn)在380～400℃，700℃分解完全。對(duì)照維甲酸和精氨酸鹽酸鹽中的骨架斷裂峰溫，可以發(fā)現(xiàn)，所形成配合物的骨架斷裂峰溫升高,這表明配合物的穩(wěn)定性大于游離配體。

2.1.4 配體及配合物的光譜性質(zhì)

圖6 配體及配合物的紫外-可見(jiàn)光譜圖Fig.6 UV-Vis absorption spectra of ATRA and complexes

圖6為配體全反式維甲酸和配合物的紫外-可見(jiàn)光譜圖。由圖可知，在相同濃度條件下 (1×10-4mol·L-1)，配合物的吸收峰略有紅移，但配合物溶液的吸收強(qiáng)度高于配體。其中Nd和La配合物的紫外吸收強(qiáng)度大大增加。由于全反式維甲酸中共軛雙鍵的π→π*躍遷產(chǎn)生了對(duì)光的吸收，配合物的紫外-可見(jiàn)吸收峰的位移和強(qiáng)度的變化，可能是由配體中的氧原子與稀土離子形成配位鍵后，配位原子的電子云向稀土離子的空軌道轉(zhuǎn)移，配體中共軛電子的離域化程度增加，電子躍遷的能級(jí)差有所減小，導(dǎo)致配合物對(duì)紫外光的吸收作用增強(qiáng)并產(chǎn)生了紅移。精氨酸鹽酸鹽在250～500 nm范圍無(wú)吸收。圖7為室溫條件下，以λex=425 nm為激發(fā)波長(zhǎng)，維甲酸(1×10-5mol·L-1)與配合物(1×10-5mol·L-1)的熒光光譜圖。由圖可知，維甲酸在λem=450 nm附近有熒光發(fā)射峰，配合物在λem=470 nm附近有熒光發(fā)射峰，熒光峰位置的變化，說(shuō)明稀土離子和配體發(fā)生了配位作用。而配合物的熒光發(fā)射峰強(qiáng)度均比配體的熒光發(fā)射峰強(qiáng)度低。熒光強(qiáng)度的變化，說(shuō)明稀土金屬離子和配體發(fā)生了配位作用。

圖7 配體及配合物的熒光光譜圖Fig.7 Emission spectra of ATRA and complexes

2.2 抗腫瘤實(shí)驗(yàn)

采用MTT法測(cè)試了稀土硝酸鹽、配體全反式維甲酸和L-精氨酸鹽酸鹽以及三元配合物的抗腫瘤活性，陽(yáng)性對(duì)照藥為順鉑，測(cè)試的細(xì)胞株種類為體外培養(yǎng)的人肝癌細(xì)胞HepG2、人肺癌細(xì)胞A549和人宮頸癌細(xì)胞Hela。表3為稀土鹽類、配體和配合物對(duì)不同腫瘤細(xì)胞瘤株的IC50值。

表3 稀土鹽、配體和配合物對(duì)不同腫瘤細(xì)胞瘤株的IC50值Table 3 IC50 values of compounds on different tumor cells

2.2.1 配體和配合物對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2的抑制作用

圖8為配體和4種配合物在濃度為10-8～10-3mol·L-1的范圍內(nèi)對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2增殖的抑制作用。由表3和圖8可以看出：(1)金屬 (Nd、La和Sc)配合物對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2半數(shù)抑制濃度均為10-3mol·L-1，且Sc和 Nd配合物的抑制率高達(dá)90%以上，而Eu配合物對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2半數(shù)抑制濃度為10-4mol·L-1，這意味著Eu配合物在較低濃度時(shí)對(duì)HepG2有明顯的抑制作用；(2)當(dāng)c≥10-4mol·L-1時(shí)，4種配合物對(duì)HepG2的抑制率都大于金屬硝酸鹽(20.04%～33.47%)和它們的兩種配體，在濃度為10-8～10-3mol·L-1范圍內(nèi)，配合物對(duì) HepG2的抑制率始終大于配體精氨酸；(3)La配合物對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制率在測(cè)試的濃度范圍內(nèi)始終低于其它配合物；(4)從總體趨勢(shì)來(lái)看，隨著配合物濃度的逐漸增加，配合物的抗腫瘤活性也隨之而增加。

圖8 配合物與配體對(duì)HepG2細(xì)胞的抑制率Fig.8 HepG2 inhibition rate of complexes and ligands

2.2.2 配體和配合物對(duì)人肺癌細(xì)胞A549的抑制作用

圖9為配體和4種配合物在濃度為10-8～10-3mol·L-1的范圍內(nèi)對(duì)人肺癌細(xì)胞A549增殖的抑制作用。由表3和圖9可以看出：(1)金屬配合物NdL2LCl、EuL2L′Cl和 LaL2L′Cl對(duì)人肺癌細(xì)胞 A549的抑制作用在10-8～10-3mol·L-1都隨濃度的增大而增強(qiáng)，而 ScL2L′Cl在 10-8～10-6mol·L-1時(shí)抑制率隨著濃度的增加而增大，10-6～10-5mol·L-1時(shí)抑制率隨著濃度的增加而減小，隨后又繼續(xù)增大，且增幅較大；(2)當(dāng)濃度為 10-5～10-3mol·L-1時(shí)，配合物對(duì)A549的抑制作用明顯大于金屬硝酸鹽 (4.79%～28.37%)和兩種配體；(3)10-4mol·L-1為 LaL2L′Cl和ScL2L′Cl的半數(shù)抑制濃度，10-3mol·L-1為 NdL2L′Cl、EuL2L′Cl的半數(shù)抑制濃度，說(shuō)明此種癌細(xì)胞的增殖對(duì) LaL2L′Cl和 ScL2L′Cl配合物較為敏感；(4)金屬配合物在濃度為10-3mol·L-1時(shí)抑制率最高，ScL2L′Cl的抑制率高達(dá)87.64%。

圖9 配合物與配體對(duì)A549細(xì)胞的抑制率Fig.9 A549 inhibition rate of complexes and ligands

2.2.3 配體和配合物對(duì)人宮頸癌細(xì)胞Hela的抑制作用

圖10 配合物與配體對(duì)Hela細(xì)胞的抑制率Fig.10 Hela inhibition rate of complexes and ligands

圖10為配體和4種配合物在濃度為10-8～10-3mol·L-1的范圍內(nèi)對(duì)人宮頸癌細(xì)胞Hela增殖的抑制作用。由表3和圖10可以看出：(1)配合物在相對(duì)較小的濃度(10-6mol·L-1)時(shí)已經(jīng)超過(guò)了對(duì)細(xì)胞半數(shù)抑制濃度，配合物對(duì)此種癌細(xì)胞的抑制作用強(qiáng)于其它 2種癌細(xì)胞；(2)在測(cè)試濃度為 10-8～10-3mol·L-1的范圍內(nèi)，配合物對(duì)Hela增殖的抑制作用始終大于 2 種配體及其稀土硝酸鹽 (11.02%～34.17%)；(3)幾種配合物對(duì)Hela增殖的抑制作用隨著濃度的增加而逐漸增大，當(dāng)濃度增大到10-3mol·L-1時(shí)，每種配合物對(duì)Hela增殖的抑制作用也達(dá)到最大值，EuL2L′Cl的抑制率高達(dá) 80.36%，ScL2L′Cl的抑制率高達(dá) 83.20%；(4)在濃度為 10-8～10-5mol·L-1的范圍內(nèi)，LaL2L′Cl對(duì)Hela增殖的抑制作用始終大于其它配合物。

由以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，配合物對(duì)所測(cè)試的3種腫瘤細(xì)胞株的抑制率一般強(qiáng)于金屬硝酸鹽、配體全反式維甲酸和L-精氨酸鹽酸鹽。這是因?yàn)閹в蟹辑h(huán)基團(tuán)的金屬配合物可通過(guò)嵌插作用插入到細(xì)胞的DNA分子內(nèi)堿基對(duì)之間，通過(guò)破壞堿基堆積力，從而影響DNA分子的內(nèi)部構(gòu)型，來(lái)抑制DNA分子的進(jìn)一步復(fù)制和遺傳；稀土離子與配體螯合生成配合物以后，正電荷部分轉(zhuǎn)移到配體上，使螯合環(huán)上的電子產(chǎn)生離域效應(yīng)，導(dǎo)致稀土離子極性降低，這樣就增強(qiáng)了配合物的脂溶性，以致配合物能更好地穿透微生物細(xì)胞膜的類脂層，這種增強(qiáng)的穿透作用破壞了細(xì)胞膜的通透性，也可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡；另外配合物中存在金屬離子，能使蛋白質(zhì)立體構(gòu)象發(fā)生變化以致蛋白質(zhì)變性，使得配合物對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用強(qiáng)于配體，發(fā)揮了配體與金屬的協(xié)同作用[14-15]。一般認(rèn)為配體和配合物的相對(duì)生物活性大小隨濃度變化的原因與配體和配合物分子的性質(zhì)、穩(wěn)定性及在某些濃度范圍內(nèi)的存在形式(聚合、解離)有關(guān)。本論文中合成的配合物依金屬原子的不同呈現(xiàn)不同的抗腫瘤活性，可能與稀土離子各自的半徑、所帶的有效核電荷有關(guān)。在濃度為10-3mol·L-1時(shí)，ScL2L′Cl配合物對(duì) 3 種腫瘤細(xì)胞的抑制最強(qiáng)，抑制率在80%以上，其它3種配合物的抑制率超過(guò)60%，說(shuō)明ScL2L′Cl配合物有較大的潛在藥物使用價(jià)值。

2.3 配合物與DNA的相互作用

為了解配合物抗腫瘤作用的機(jī)理，對(duì)配合物和生物大分子DNA之間的相互作用方式進(jìn)行了研究考察。

2.3.1 配合物與DNA作用的熒光光譜

2.3.1.1 DNA 對(duì)配合物熒光強(qiáng)度的影響

配合物NdL2L′Cl的熒光光譜圖如圖11所示。由圖11可以看出，在DNA的存在下，配合物的熒光發(fā)射峰位沒(méi)有發(fā)生變化，熒光強(qiáng)度有較大增加，產(chǎn)生了明顯的增色效應(yīng)。增色效應(yīng)是由于DNA堿基與嵌入其間的小分子產(chǎn)生電子相互作用引起的[16-17]。DNA的加入引起配合物熒光強(qiáng)度增加的現(xiàn)象，和已知的一些嵌入試劑在DNA存在時(shí)熒光強(qiáng)度增加的現(xiàn)象是一致的[18-19]，由此可初步推測(cè)，配合物可能嵌入到DNA堿基對(duì)中。

圖11 DNA對(duì)配合物熒光強(qiáng)度的影響Fig.11 Emission spectra(excited at 425 nm,5 mL NdL2L′Cl solution)

2.3.1.2 配合物對(duì)EB-DNA體系熒光強(qiáng)度的影響

溴化乙錠(EB)本身的熒光很弱，但嵌入DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)后熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)。如果在EB-DNA體系中加入的有機(jī)小分子M也能與DNA發(fā)生類似于EB的嵌入作用，這個(gè)小分子就會(huì)與EB競(jìng)爭(zhēng)同DNA的結(jié)合位點(diǎn)，使EB-DNA體系的熒光強(qiáng)度減弱。一般認(rèn)為當(dāng)EB-DNA體系的熒光強(qiáng)度減弱50%，且cM/cDNA＜100時(shí)，M與DNA發(fā)生了類似于EB的嵌入作用[20-21]。NdL2L′Cl配合物對(duì)EB-DNA體系熒光強(qiáng)度影響的結(jié)果如圖10所示，在不同量的配合物存在下，EB-DNA體系的最大發(fā)射波長(zhǎng)沒(méi)有發(fā)生移動(dòng)，其熒光強(qiáng)度隨(cNd/cDNA)的比值R的增大而減小(EB-DNA體系的熒光強(qiáng)度減弱至50%時(shí)，cNd/cDNA=12.5)，結(jié)果見(jiàn)圖12。這就說(shuō)明配合物發(fā)生了類似于EB的嵌入作用。

圖12 NdL2L′Cl對(duì)EB-DNA體系熒光強(qiáng)度的影響Fig.12 Emission spectra(excited at 425 nm,5 mLsolution)

2.3.1.3 EB 對(duì) NdL2L′Cl-DNA 體系熒光強(qiáng)度的影響

為了進(jìn)一步考察配合物與DNA的作用方式，在 NdL2L′Cl-DNA(c配合物/cDNA=2.5)體系中加入了 EB，結(jié)果如圖13所示。當(dāng)加入EB時(shí)，發(fā)現(xiàn)配合物-DNA體系的熒光強(qiáng)度隨EB的增加而下降。而在600 nm處出現(xiàn)了EB-DNA體系的熒光發(fā)射峰，峰強(qiáng)度隨著EB濃度的增加而迅速增大。加入EB使得NdL2L′Cl-DNA體系熒光強(qiáng)度降低，說(shuō)明EB分子可能取代了NdL2L′Cl-DNA體系中部分配合物分子，形成EBDNA復(fù)合物體系，導(dǎo)致了NdL2L′Cl-DNA體系熒光強(qiáng)度的降低和標(biāo)志EB-DNA新體系形成的新峰的出現(xiàn)。EB能使配合物-DNA體系在470 nm處的熒光產(chǎn)生猝滅現(xiàn)象，而且猝滅程度隨EB濃度的增加而加大，由此推斷，配合物與DNA的作用方式與EB與DNA作用方式應(yīng)該是相似的，均為嵌入方式[22]。

圖13 EB對(duì)NdL2L′Cl-DNA體系熒光強(qiáng)度的影響Fig.13 Emission spectra(excited at 425 nm,5 mL solution)

2.3.2 配合物與DNA作用的紫外光譜

DNA 溶液 (4×10-4mol·L-1)、NdL2L′Cl(4×10-4mol·L-1) 溶液、DNA-NdL2L′Cl體系的紫外光譜如圖14所示。NdL2L′Cl在350 nm處有吸收峰，DNA在260～280 nm處有吸收峰，當(dāng)在DNA溶液中加入NdL2L′Cl配合物時(shí)，DNA 在 260～280 nm 處的吸收峰的強(qiáng)度明顯降低，而且出現(xiàn)了一定的紅移現(xiàn)象。減色效應(yīng)和紅移現(xiàn)象說(shuō)明配合物確實(shí)與DNA發(fā)生了相互作用而引起了配合物或DNA紫外光譜的變化。因?yàn)樵谧贤馕展庾V中所反映的減色效應(yīng)是由于DNA的堿基與嵌入其間的有機(jī)小分子產(chǎn)生的相互作用而引起的[16,23]，而有機(jī)小分子與DNA相互作用程度的大小與小分子距DNA堿基對(duì)之間的距離的三次方成反比[23]，較大的減色效應(yīng)意味著配合物與DNA堿基對(duì)之間的距離小，所以小分子就容易嵌入到DNA堿基對(duì)中[24]。因此在配合物或DNA的紫外吸收?qǐng)D譜上的減色效應(yīng)以及紅移或紫移現(xiàn)象說(shuō)明了配合物與DNA之間的作用可能是嵌入式的，可初步推斷NdL2L′Cl嵌入到DNA堿基對(duì)中。破壞了芳環(huán)的堆積作用，使得DNA分子的局部結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，影響了細(xì)胞中DNA分子的復(fù)制，使得配合物對(duì)腫瘤細(xì)胞有一定的抑制作用。

圖14 DNA-NdL2L′Cl體系紫外光譜圖Fig.14 UV spectra of(a)DNA,(b)DNA-NdL2L′Cl,(c)NdL2L′Cl

2.3.3 EB和配合物對(duì)DNA粘度的影響

為進(jìn)一步確定配合物與DNA的作用方式，用烏貝路德粘度計(jì)在20℃測(cè)定了DNA在EB、NdL2L′Cl配合物存在時(shí)的粘度變化，結(jié)果列于表4。

表4 DNA相對(duì)粘度(ηr)的變化Table 4 Variation of the relative viscosity of DNA

由表4可以看出，DNA的相對(duì)粘度隨著EB和配合物NdL2L′Cl濃度的增加而增大，說(shuō)明配合物NdL2L′Cl與DNA的作用方式確實(shí)類似于EB與DNA的作用方式，為嵌入式[25]。這和NdL2L′Cl配合物與EB競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合DNA的熒光法試驗(yàn)結(jié)果是一致的。

3 結(jié) 論

本文用稀土離子(Nd3+、Eu3+、La3+、Sc3+)的硝酸鹽、具有一定抗腫瘤作用的全反式維甲酸和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)L-精氨酸鹽酸鹽合成了4種稀土配合物，推測(cè)其化學(xué)組成為 RE(ATRA)2(L-Arg)Cl·nH2O，其結(jié)構(gòu)可能為：

抗腫瘤實(shí)驗(yàn)表明，在一定的濃度范圍內(nèi)，配合物的抗腫瘤活性優(yōu)于金屬硝酸鹽、配體全反式維甲酸和L-精氨酸鹽酸鹽，當(dāng)配合物濃度為1 mmol·L-1時(shí)，ScL2L′Cl配合物對(duì)3種腫瘤細(xì)胞的抑制最強(qiáng)，抑制率在80%以上，其它3種配合物的抑制率超過(guò)60%，說(shuō)明ScL2L′Cl配合物有較大的潛在藥物使用價(jià)值。

通過(guò)研究配合物與DNA的相互作用方式，初步說(shuō)明配合物分子嵌入DNA堿基對(duì)之間，是配合物具有抗腫瘤活性的原因之一。

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