孫 潔，王 婉，周 翎，阮小蕾，饒雪琴，李華平

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源環(huán)境學(xué)院，廣東 廣州510642)

香蕉廣泛種植于熱帶亞熱帶地區(qū)，在進出口貿(mào)易中占有很重要的位置．植物病毒病是影響香蕉繁殖和種質(zhì)資源交流的重要因素，在世界很多香蕉種植區(qū)均有報道黃瓜花葉病毒Cucumber mosaic virus(CMV)引起的香蕉花葉心腐病對香蕉生產(chǎn)造成重大損失［1-2］．在黃瓜花葉病毒侵染的葉片上，特別是嫩葉，出現(xiàn)黃綠相間的花葉狀條紋或褪綠的梭狀斑，葉緣有輕微卷曲［3］．CMV 屬于雀麥花葉病毒科Bromoviridae 黃瓜花葉病毒屬Cucumovirus，是典型的三分體單鏈正義RNA 病毒．研究［4-6］發(fā)現(xiàn)CMV 外殼蛋白(Coat protein，CP)與病毒粒子組裝和蚜蟲傳播相關(guān);CP 序列的遺傳多樣性分析表明CMV 主要有2 個亞組．目前對CMV 尚未形成一套安全、高效、穩(wěn)定的病毒防控技術(shù)，因此有必要對此進行研究．

香蕉中CMV 的檢測方法主要有ELISA、斑點雜交法、RT-PCR、免疫捕獲RT-PCR［7-10］、核酸分子雜交［11］、基因芯片技術(shù)［12］及RT-LAMP［13］等，這些方法在檢測速度、靈敏度及特異性等方面有一定的局限性．目前，基于PCR、熒光標記和激光技術(shù)［14］的定量PCR，靈敏度高、特異性強、重復(fù)性好，在植物病毒檢測中已得到廣泛的運用［15-17］．利用熒光定量方法檢測花卉、桃蚜中的CMV 雖有報道［18-19］，但香蕉中CMV 的熒光定量檢測方法鮮見報道．本研究根據(jù)CMV CP 基因保守序列設(shè)計了熒光定量PCR 特異性探針及引物，建立了香蕉中CMV 的熒光定量PCR 檢測方法．

1 材料與方法

1．1 樣品、儀器與試劑

感染CMV、BSV、BBTV 的香蕉植株采自華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)場和云南省保山市．

Ex Taq DNA 聚合酶、dNTPs、pMD18-T 載體、質(zhì)粒純化試劑盒、PrimeScriptTMRT Master Mix(Perfect Real Time)、Premix Ex TaqTM、實時熒光定量PCR 儀(Thermal Cycler Dice)均購于TaRaKa 公司．大腸埃希菌JM109 由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病毒室提供．核酸蛋白分析儀(Nanophotometer，產(chǎn)自IMPLEN)．

1．2 試驗方法

1．2．1 引物與探針的設(shè)計 根據(jù)GenBank 上已登錄的CMV CP 基因序列(登錄號:AY965892．1)設(shè)計引物和探針，MF1:5'-CGATAAGAAGCTTGTTTCGCG-3'，CMV-R:5'-CGGCGTACTTTCTCATGTCAC-3'，探針P:5'-ROX-CGTTACCGCCATCTCTGCTATGTTCGCBHQ2-3'，引物和探針均由TaRaKa 公司合成．

1．2．2 模板RNA 的提取及cDNA 的制備 按照王玉成等［20］方法進行RNA 抽提，放于－20℃保存．根據(jù)PrimeScriptTMRT Master Mix(Perfect Real Time)說明進行RNA 的反轉(zhuǎn)錄以合成cDNA．反應(yīng)體系:5×Prime-Script RT Master Mix 2 μL，RNA 2 μL，RNase-free ddH2O 6 μL．反應(yīng)條件為:37 ℃15 min，85 ℃5 s．

1．2．3 質(zhì)粒標準品的制備 以抽提出的RNA 為模板進行RT-PCR，反應(yīng)體系為:PrimeScript 1 step Enzyme Mix 1 μL，2×step Buffer 12.5 μL ，MF1、CMVR 各1 μL(10 μmol·L－1)，加RNase-free ddH2O 至25 μL．反應(yīng)條件為:50 ℃30 min;95 ℃5 min，95 ℃30 s，59 ℃1 min，72 ℃1 min，35 個循環(huán);72 ℃延伸10 min．反應(yīng)得到目的大小片段后，用切膠回收試劑盒回收PCR 產(chǎn)物．依試劑盒說明說將目的片段連接至pMD18-T 載體，并轉(zhuǎn)化至JM109 感受態(tài)細胞中．涂板，挑出白色菌落進行搖菌，用質(zhì)粒抽提試劑盒抽提質(zhì)粒，并測序．經(jīng)鑒定正確的作為陽性質(zhì)粒，用核酸蛋白儀測定其質(zhì)量濃度，然后計算拷貝數(shù):

拷貝數(shù)=［6.02×1023×ρ］÷［堿基數(shù)×660×10－3］．

經(jīng)計算本試驗所得質(zhì)粒DNA 拷貝數(shù)為4.2×1010μL－1，以10 倍梯度稀釋，作為絕對定量的標準品．

病毒拷貝數(shù)的計算:將未知樣品的Ct值代入所得標準曲線中，即可得到未知樣品的病毒拷貝數(shù)．其中，Ct值是指每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)．

1．2．4 熒光定量PCR 反應(yīng)條件的優(yōu)化與標準曲線的制作 以制備的標準品為模板，對實時熒光定量的引物與探針的濃度及退火溫度進行優(yōu)化，確立最佳反應(yīng)體系．25 μL 反應(yīng)體系:Real-time 2×Taq 12.5 μL，MF1、CMV-R 各1 μL(10 μmol·L－1)，P(10 μmol·L－1)0.5 μL，模板2 μL，加滅菌的ddH2O 25 μL．最佳反應(yīng)條件為:95 ℃10 s;95 ℃5 s，59 ℃30 s，72 ℃30 s，40 個循環(huán)．以10 倍梯度稀釋的標準品為模板，建立25 μL PCR 反應(yīng)體系，根據(jù)優(yōu)化的反應(yīng)條件，熒光定量PCR 儀擴增．反應(yīng)結(jié)束后，儀器自動生成標準曲線．

1．2．5 熒光定量PCR 靈敏性、特異性和重復(fù)性試驗以制備的CMV 標準品按10 倍梯度稀釋為模板，進行熒光定量PCR 和普通PCR 試驗，根據(jù)各模板的Ct值確定檢測下限．以4.2×107μL－1為模板，重復(fù)7次，進行統(tǒng)計分析，根據(jù)變異系數(shù)確定該體系的可重復(fù)性．以感染BBTV、BSV 的香蕉植株DNA，及CMV的cDNA 為模板，進行熒光定量PCR，進行熒光定量特異性試驗．

PCR 體系:Taq 酶0.2 μL，MF1、CMV-R 各1 μL(10 μmol·L－1)，10×Buffer 2.5 μL，dNTPs(2.5 mmol·L－1)2.0 μL，模板1 μL，加滅菌的ddH2O 至25 μL．反應(yīng)條件:95 ℃5 min;95 ℃30 s，59 ℃1 min，72 ℃1 min，35 個循環(huán);72 ℃延伸10 min．

1．2．6 熒光定量PCR 的實際應(yīng)用 采集不同香蕉植株葉片抽提的RNA 反轉(zhuǎn)錄的cDNA 為模板，進行熒光定量PCR．此外，還抽提了同一感染CMV 的香蕉植株不同部位的RNA，包括只有葉片和含葉脈的葉片，各0.1 g，以確定植株的不同部位的病毒含量是否存在差異．

2 結(jié)果與分析

2．1 質(zhì)粒標準品的制備

以抽提的香蕉RNA 為模板，應(yīng)用MF1、CMV-R 進行RT-PCR，獲得了與目的片段大小一致的擴增產(chǎn)物，經(jīng)測序比對，與GenBank 中的CMV 序列具有高度相似性，表明已成功構(gòu)建了CMV 重組質(zhì)粒標準品．

2．2 標準曲線的構(gòu)建

以梯度稀釋的CMV 質(zhì)粒DNA 為模板，進行熒光定量PCR，得到CMV 的標準曲線(圖1)．標準品模板拷貝數(shù)在4.2×102～4.2×107μL－1范圍內(nèi)，與Ct值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系(本試驗中Ct值＞35 視為陰性)．

圖1 熒光定量PCR 檢測黃瓜花葉病毒標準曲線Fig．1 Standard curve of the real-time PCR of CMV detection

2．3 熒光定量PCR 的特異性

以感染BBTV 、BSV 的香蕉植株DNA 及CMV 的cDNA 進行熒光定量PCR，除CMV 的cDNA 之外，其他均為陰性，表明該方法具有良好的特異性(圖2)．

圖2 黃瓜花葉病毒熒光定量PCR 特異性試驗Fig．2 Specificity of real-time PCR of CMV detection

2．4 熒光定量PCR 重復(fù)性和靈敏性檢測

重復(fù)擴增試驗所得Ct值(17.84～19.06)的變異系數(shù)小于1.04%，表明本試驗建立的熒光定量PCR 檢測方法重復(fù)性好．

以梯度稀釋的標準品為模板，進行熒光定量PCR 和普通PCR，結(jié)果表明，熒光定量PCR 檢測標準品的靈敏度為4.2×102μL－1(Ct值為33.37)，普通PCR 檢測的靈敏度為4.2×104μL－1(圖3a)．對感染CMV 的香蕉葉片進行RNA 抽提，反轉(zhuǎn)錄成cDNA 后，進行稀釋，分別以稀釋后的cDNA 為模板進行熒光定量PCR 和普通PCR，結(jié)果表明，熒光定量PCR 檢測cDNA 的靈敏度為104(Ct值為33．25)，普通PCR 檢測cDNA 的靈敏度為103(圖3b)．

圖3 黃瓜花葉病毒PCR 電泳圖Fig．3 Electrophoresis analysis of CMV by PCR

2．5 熒光定量PCR 的應(yīng)用

采集田間香蕉樣品共14 份，抽提RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA 后進行熒光定量PCR，結(jié)果顯示，5 份樣品與陽性對照一樣有明顯的擴增曲線，且Ct值為19.85～25.62，其余樣品同陰性對照相同，無擴增曲線．

用熒光定量PCR 檢測感病香蕉植株不同部位的CMV，結(jié)果表明，0.1 g 香蕉葉片中約含有5.14×107個病毒拷貝，0.1 g 葉片與葉脈混合物中約含有1．1×108個病毒拷貝．由試驗結(jié)果可知相同質(zhì)量的香蕉組織，葉脈和葉片混合樣中CMV 含量高于葉片．

3 討論

本研究根據(jù)CMV 的CP 基因的保守序列設(shè)計了熒光定量PCR 的探針及引物，保證了所擴增基因的特異性，且所建立的CMV 熒光定量PCR 檢測方法具有重復(fù)性和可靠性．然而熒光定量PCR 在檢測過程中，相同模板不同重復(fù)間Ct值常存在差異，這可能是由于加樣時人為誤差造成的，或是PCR 儀的邊緣效應(yīng)造成的［21］．王芳等［22］建立的煙草CMV 的SYBR熒光定量檢測法，未對其重復(fù)性、靈敏度及特異性進行探討．有研究［23］表明，TaqMan 探針法比SYBR 染料法特異性更強，靈敏度更高．

在靈敏度比較試驗中，筆者分別以CMV 質(zhì)粒DNA 及cDNA 為模板進行熒光定量PCR 與普通PCR，以質(zhì)粒DNA 為模板時，熒光定量PCR 靈敏度是普通PCR 的100 倍，而以cDNA 為模板時，其靈敏度是普通PCR 的10 倍．不同模板間靈敏度的差異可能是由于質(zhì)粒DNA 經(jīng)過處理后純度較cDNA 高，而cDNA 中所含的反轉(zhuǎn)錄酶、酚等可能影響了PCR 擴增的原因［24-25］．在同一香蕉植株中，葉脈與葉片混合物中CMV 病毒含量高于葉片，可能與CMV 在香蕉中的運輸特性相關(guān)［26］，這將為田間香蕉樣品的采樣提供一定的依據(jù)．

本研究建立的TaqMan 熒光定量PCR 檢測方法，可檢測香蕉中CMV 并可對其進行絕對定量，也可用于研究CMV 在植株體內(nèi)的運動、抗病種質(zhì)資源的篩選、寄主－病毒－介體間相互作用等．

［1］HOOKS C R R，WRIGHT M G，KABASAWA D S，et al．Effect of banana bunchy top virus infection on morphology and growth characteristics of banana［J］．Ann Appl Biol，2008，153(1):1-9．

［2］JERIDI M，ESCOUTE J，F(xiàn)ONDI E，et al．Homoeologous chromosome pairing between the A and B genomes of Musa spp．revealed by genomic in situ hybridization［J］．Ann Bot，2011，108(5):975-981．

［3］AYO-JOHN E I，EKPO E J A，ODEDARA O O，et al．Virus symptom expressions on Musa landraces in 1999，2000 and 2004 in Southern Nigeria:Cucumber mosaic virus(CMV)disease incidence and subgroup differentiation［J］．Arch Phytopathol Plant Protect，2011，44(6):547-557．

［4］JACQUEMOND M．Cucumber mosaic virus:Vol．84［M］．Montfavet:Adv Virus Res，2012:439-504．

［5］ROOSSINCK M J．Cucumber mosaic virus，a model for RNA virus evolution［J］．Mol Plant Pathol，2001，2(2):59-63．

［6］王達新，郭剛，殷曉敏，等．黃瓜花葉病毒研究進展［J］．現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2013(3):121-123．

［7］黃孟群，廖志松．檢測香蕉花葉心腐病病原CMV 的PAS-ELISA 方法的改進［J］．生物工程學(xué)報，1996，12(3):335-339．

［8］HU Jinsheng，LI Huaping，BARRYK，et al．Comparison of dot blot，ELISA，and RT-PCR assays for detection of two Cucumber mosaic virus isolates infecting banana in Hawaii［J］．Plant Dis，1995，79(9):902-906．

［9］劉志昕，潘俊松，鄭學(xué)勤．香蕉花葉心腐病的血清學(xué)診斷及檢測方法的建立［J］．熱帶作物學(xué)報，1994(S1):19-26．

［10］金羽，文景芝．植物病毒檢測方法研究進展［J］．黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005(3):37-40．

［11］覃佐東，徐燕慧，李峰，等．核酸分子雜交檢測黃瓜花葉病毒［J］．湖南文理學(xué)院學(xué)報:自然科學(xué)版，2007，19(1):69-71．

［12］賈慧，王艷輝，王進忠，等．基因芯片技術(shù)檢測黃瓜花葉病毒、煙草花葉病毒和馬鈴薯Y 病毒［J］．華北農(nóng)學(xué)報，2011，26(1):83-86．

［13］PENG Jun，SHI Minjing，XIA Zihao，et al．Detection of Cucumber mosaic virus isolates from banana by one-step reverse transcription loop-mediated isothermal amplification［J］．Arch Virol，2012，157(11):2213-2217．

［14］伊鋆，蔡雪鳳．TaqMan 熒光探針技術(shù)在食源性致病菌檢測中的應(yīng)用［J］．食品工業(yè)科技，2013(7):374-377．

［15］ABRAHAMIAN P E，JAWDAH Y．Detection and quantitation of the new world Squash leaf curl virus by TaqMan realtime PCR［J］．J Virol Methods，2013，191(1):76-81．

［16］WANG Yawen，LI Yiping，YANG Cuiling，et al．Development and application of a universal TaqMan real-time PCR for quantitation of duck hepatitis B virus DNA［J］．J Virol Methods，2013，191(1):41-47．

［17］WACHARAPLUESADEE S，TEPSUMETHANON，SUPAVONWONG P，et al．Detection of rabies viral RNA by TaqMan real-time RT-PCR using non-neural specimens from dogs infected with rabies virus［J］．J Virol Methods，2012，184(1/2):109-112．

［18］WEI T，LEBAS B S M，SHILLER J B，et al．Detection of five viruses infecting dormant bulbs by TaqMan-based realtime RT-PCR［J］．Australasian Plant Pathol，2012，41(1):93-98．

［19］WANG Fenglong，YANG Jinguang，ZHAI Xilun，et al．A real-time reverse transcription PCR assay for detection of Cucumber mosaic virus in individual peach aphid(Myzus persicae)［J］．ICIEA，2011(3):2624-2627．

［20］王玉成，張國棟，姜靜．一種適用范圍廣的總RNA 提取方法［J］．植物研究，2006，26(1):85-88．

［21］鄭衛(wèi)東，袁仕偉．熒光定量PCR 儀的邊緣效應(yīng)與實驗誤差分析［J］．醫(yī)療衛(wèi)生裝備，2013(2):113-115．

［22］王芳，高正良，周本國，等．利用Real-time RT-PCR 法檢測抗病毒活性物質(zhì)對CMV 復(fù)制的影響［J］．煙草科技，2011(1):70-73．

［23］袁亞男，劉文忠．實時熒光定量PCR 技術(shù)的類型、特點與應(yīng)用［J］．中國畜牧獸醫(yī)，2008，35(3):27-30．

［24］SCHEFE J H，LEHMANN K E，BUSCHMANN I R，et al．Quantitative real-time RT-PCR data analysis:Current concepts and the novel“gene expression's CTdifference”formula［J］．J Mol Med，2006，84(11):901-910．

［25］WINTZINGERODE F，GOBEL U B，STACKEBRANDT E．Determination of microbial diversity in environmental samples:Pitfalls of PCR-based rRNA analysis［J］．FEMS Microbiol Rev，1997，21(3):213-229．

［26］MORENO I M，THOMPSON J R，GARCIA-ARENAL F．Analysis of the systemic colonization of cucumber plants by Cucumber green mottle mosaic virus［J］．J Gen Virol，2004，85(Pt3):749-759．