李 博，趙吉祥，陳杖榴，路文華，韓可可，徐 維，陳 紅

(華南農(nóng)業(yè)大學 獸醫(yī)學院/國家獸藥殘留基準實驗室，廣東 廣州510642)

三氮脒是用于家畜的抗血液原蟲藥，主要治療錐蟲病、巴貝斯梨形蟲病、泰勒梨形蟲病和馬媾疫錐蟲病等.我國屬錐蟲病疫區(qū)［1-3］，家畜錐蟲病較為常見，三氮脒在臨床治療中有重要的應用價值.錐蟲的宿主特異性不嚴格［4］.近幾十年隨著世界范圍內(nèi)養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，有關豬感染、發(fā)生錐蟲病的報道逐漸增多［5-13］，使用三氮脒治療豬錐蟲病的報道也有增加.但是國內(nèi)有關三氮脒的藥理學和毒理學研究較少.從已有的報道來看，本藥的藥動學特征在不同動物種屬間有較大差異，安全范圍小，耐受劑量在種屬間和個體間差異大，臨床常見中毒反應，一般為副交感神經(jīng)興奮樣癥狀［14］.因此，以豬為靶動物開展藥理學和毒理學研究，是獸醫(yī)臨床安全有效用藥、有利于消費者的健康安全的重要基礎研究.在牛、羊、犬的研究顯示，三氮脒的血漿蛋白結合率較高［14-16］.藥物與機體蛋白質(zhì)結合，形成可逆的藥物-蛋白復合物，對藥物的跨膜轉運、發(fā)揮治療作用或是引起不良反應和體內(nèi)代謝過程都有重要影響.藥物的血漿蛋白結合情況與動物種屬間遺傳上的差異有關.研究藥物在特定動物的蛋白結合情況可以解釋一些藥動學特征(如排泄緩慢);也可以預測當非蛋白結合型(游離)藥物濃度增加時(由機體蛋白質(zhì)代謝異常、競爭性結合的存在或者用藥量過高導致的)，可能出現(xiàn)較強的治療作用或中毒反應驟增的現(xiàn)象.

1 材料與方法

1．1 儀器與試劑

高效液相色譜儀:美國Dionex 公司，Ultimate 3000 系列，配備自動進樣器，四元泵，在線脫氣泵，柱溫箱，色譜工作站軟件.色譜分析柱:Hypersil BDS C18，5 μm，250 mm×4.6 mm，美國Thermo 公司.離心機:Mach 1.6 R 冷凍型，美國Thermo 公司.超濾管:Millipor，UFC501024，0.5 mL.

三氮脒標準品為Sigma 公司產(chǎn)品，質(zhì)量分數(shù)為90%(以C14H15N7·2C4H7NO3計).乙腈、甲醇為色譜純，Mallinckrodt Bater 公司產(chǎn)品.冰乙酸、三乙胺、辛烷磺酸鈉均為國產(chǎn)分析純試劑.三氮脒粉針劑:批號12083，三氮脒質(zhì)量分數(shù)為100%(采用HPLC 法，與三氮脒標準品比較，測得實際質(zhì)量分數(shù)為96%)，蘭州正豐制藥有限責任公司產(chǎn)品.

1．2 溶液配制

三氮脒標準儲備液:準確稱取三氮脒標準品(C14H15N7·2C4H7NO3)101.9 mg 于50 mL 棕色容量瓶中，用超純水溶解并定容至刻度，搖勻即得1 000 μg/mL 的三氮脒標準儲備液(以C14H15N7計)，密封，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫行? 個月，臨用前以超純水稀釋成系列標準工作溶液.0.005 mol/L 辛烷磺酸鈉溶液:稱取1.08 g 的辛烷磺酸鈉，于1 000 mL容量瓶內(nèi)用超純水溶解定容;此溶液轉移至1 L 試劑瓶中，添加1 mL 三乙胺，用冰乙酸調(diào)節(jié)pH 至3.2，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過濾后備用.三氮脒注射液:取適量三氮脒粉針劑，用滅菌生理鹽水配成70 mg/mL 的注射液，臨用現(xiàn)配.

1．3 血漿中游離藥物分離方法

取0.5 mL 血漿樣品，加人到Millipor 超濾管中，在37 ℃以2 700 r/min 離心20 min，取50 μL 超濾液用高效液相色譜-紫外法(HPLC-UV)分析藥物含量.

1．4 藥物含量的HPLC-UV 分析法

紫外檢測波長372 nm.流動相V(乙腈)∶V(pH 3.2 的0.005 mol/L 辛烷磺酸鈉溶液)=30∶70;流速1.000 mL/min.柱溫:24.0 ℃，進樣量50 μL.外標法標準曲線定量.

游離三氮脒血藥濃度標準曲線制備:取適量pH7.4 磷酸鹽緩沖溶液，稀釋不同質(zhì)量濃度的三氮脒系列工作溶液，使三氮脒的質(zhì)量濃度分別為0.01、0.02、0.05，0.10、0.20 、0.50、1.00、2.00 μg/mL.按前述HPLC-UV 條件分析.以藥物響應信號的峰面積為x，以相應藥物質(zhì)量濃度為y 作直線回歸，求得標準曲線方程和相關系數(shù).

1．5 血漿藥物總濃度(蛋白結合型藥物與游離型藥物之和)的測定

參考趙吉祥［17］建立的豬血漿樣品三氮脒濃度測定的高效液相色譜法，用乙二胺四乙酸二鈉溶液稀釋豬血漿樣品，用SEP-PAK-C18固相萃取小柱富集全部藥物(包括蛋白結合型藥物和游離型藥物)，再以含有離子對試劑的乙腈洗脫.以氮氣吹干洗脫液，流動相復溶后取50 μL 按“1.4”HPLC-UV 法測定藥物含量.外標法標準曲線定量.

三氮脒血藥濃度標準曲線制備:取適量空白豬血漿樣本，添加不同質(zhì)量濃度的三氮脒系列工作溶液適量，按前述方法處理后，按“1.4 ”HPLC-UV 法測定藥物含量.以藥物響應信號的峰面積為x，以相應藥物質(zhì)量濃度為y 作直線回歸，求得標準曲線方程和相關系數(shù).豬血漿中三氮脒質(zhì)量濃度在0.01～40.0 μg/mL 范圍內(nèi)可準確定量;血漿中三氮脒質(zhì)量濃度為0.05、0.50、10.00 μg/mL 時，相對回收率≥89.09%，變異系數(shù)在0.41%～0.81%之間.豬血漿中三氮脒的定量限為5 ng/mL，檢測限為2 ng/mL.

1．6 體外測定豬血漿三氮脒－蛋白結合率的方法

空白豬全血樣本采自臨床健康、未使用任何藥物和飼料添加劑的大三元雜交豬，經(jīng)抗凝和離心后，即為空白豬血漿樣品.

參照宋粉云［18］的方法，取適量的三氮脒標準工作液加入空白豬血漿中，混勻，制得藥物質(zhì)量濃度為0.05、0.50、10.00 μg/mL 的3 個不同質(zhì)量濃度血漿樣品，每個質(zhì)量濃度樣品各5 份.樣品在37 ℃避光孵育1 h 后，取0.5 mL，加人Millipor 超濾管中，在37℃以2 700 r/min 離心20 min，取超濾液50 μL 按“1.4”HPLC-UV 法分析藥物含量.

按照公式(1)計算藥物的血漿蛋白結合率:

1．7 動物給藥試驗

6 頭健康的杜洛克×長白×約克夏雜交豬，公母各半，約10 周齡，體質(zhì)量(23.5 ±2.2 )kg，購自廣東省良種豬場.常規(guī)飼養(yǎng)，自由飲水和采食.試驗前觀察2 周，臨床健康.隨機分成2 組，按體質(zhì)量分別以7和14 mg/kg 肌內(nèi)注射三氮脒注射液.給藥后，分別在3、5、15、60 min 經(jīng)前腔靜脈采血.按隨機交叉進行不同劑量給藥，時間間隔為10 d.

全血樣品經(jīng)肝素抗凝、離心分離血漿.血漿樣品分別按“1.3”、“1.4”和“1.5”處理并測定游離藥物質(zhì)量濃度和血漿藥物總質(zhì)量濃度，按照公式(1)計算三氮脒-血漿蛋白結合率.不同給藥劑量間的藥物-血漿蛋白結合率數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計學軟件SPSS 分析.

2 結果與分析

2．1 樣品處理和HPLC-UV 方法的特異性

試驗獲得的色譜圖見圖1～圖4.對比圖1～圖3可見，在“1.4”的色譜條件下，三氮脒的保留時間是5.2 min，在目標藥物峰附近無雜質(zhì)干擾，血漿樣本的內(nèi)源性雜質(zhì)與三氮脒信號分離良好.

圖1 空白血漿超濾液的色譜圖Fig.1 Chromatogram of the blank swine plasma pretreated by ultrafiltration

圖2 0.50 μg/mL 三氮脒標準溶液的色譜圖Fig.2 Chromatogram of diminazene standard solution 0.50 μg/mL

圖3 空白血漿添加三氮脒至0.50 μg/mL 的超濾液色譜圖Fig.3 Chromatogram of the blank swine plasma spiked with diminazene at 0.50 μg/mL，pretreated by ultrafiltration

圖4 以7 mg/kg 劑量給藥60 min 后豬血漿樣品超濾液色譜圖Fig.4 Chromatogram of swine plasma sample after administration at 7 mg/kg，60 min，pretreated by ultrafiltration

2．2 豬血漿三氮脒－蛋白結合率

體外測定三氮脒-血漿蛋白結合率為74.68%～95.90%，詳見表1.

動物給藥試驗獲得的豬體內(nèi)藥物-血漿蛋白結合率見表2.豬以7 和14 mg/kg 劑量肌內(nèi)注射三氮脒，體內(nèi)的藥物蛋白結合率分別為84.11%～89.69%和82.96%～88.65%.

藥物的蛋白結合率在體內(nèi)、體外試驗中都很高.但高劑量組(14 mg/kg)，注射后5 min(接近達峰時間tmax)血漿樣品的蛋白結合率卻顯著低于相同時間點低劑量組樣品，差異極顯著(P＜0.01).

表1 體外測定的三氮脒－血漿蛋白結合率1)Tab．1 Diminazene-protein binding rate tested in vitro

表2 豬以7 和14 mg/kg 劑量給藥后三氮脒－血漿蛋白結合率1)Tab．2 Diminazene-protein binding rate at two dosages(7，14 mg/kg)tested in vivo %

3 討論與結論

3．1 血漿中結合型藥物和游離藥物的分離方法

宋粉云等［18］認為，采用超濾法時，離心時間應盡量短，溫度也對結果產(chǎn)生影響，超濾過程一般應選擇接近恒溫動物體溫的37 ℃.本試驗結合超濾管的使用說明，對離心時間、轉速(離心力)等進行了比較，最后選擇了37 ℃以2 700 r/min 離心20 min 的超濾方法.

3．2 動物給藥試驗的劑量選擇

目前，我國2010 版《獸藥使用指南》僅規(guī)定了牛、羊、馬等動物的劑量和給藥方案.國外有人對臨床感染發(fā)病豬采用不同劑量治療的療效作了比較.如Jibike 等［19］用劑量7 mg/kg 的三氮脒治療豬錐蟲病，給藥后17 d 豬錐蟲病復發(fā).Waiswa［7］分別用7 和14 mg/kg 2 個劑量的三氮脒來治療臨床豬錐蟲病病例，發(fā)現(xiàn)經(jīng)7 mg/kg 劑量治療的病豬在病情好轉后有復發(fā)現(xiàn)象，而以14 mg/kg 治療的病豬完全治愈.本研究結合國內(nèi)外報道的臨床治療用量，將試驗劑量確定為7 和14 mg/kg 2 個劑量水平進行觀察比較.

3．3 三氮脒在家畜血漿中與血漿蛋白的結合率

Aliu 等［15］報道了羊靜脈注射2 mg/kg 三氮脒后，藥物與羊血漿蛋白結合率為65%～85%.Miller等［16］研究三氮脒在犬體內(nèi)的藥動學過程中發(fā)現(xiàn)，給犬肌內(nèi)注射4.2 mg/kg 三氮脒1 h 后，三氮脒與血漿蛋白的結合率為75%.血漿蛋白結合率高的藥物通常消除緩慢，體內(nèi)的平均滯留時間較長，這與報道［14］中的半衰期較長相符.

本試驗發(fā)現(xiàn)，三氮脒在體內(nèi)和體外與豬血漿蛋白的結合率也很高.以較高劑量(14 mg/kg)給藥后，采自5 min(接近達峰時間tmax)的血漿樣品蛋白結合率為82.96%，比低劑量組相同時間點的蛋白結合率低，差異極顯著(P＜0.01).據(jù)此推測，三氮脒與蛋白質(zhì)的結合可能存在飽和現(xiàn)象.雖然豬體內(nèi)各類藥物結合蛋白的研究報道較少，難以進一步求得結合常數(shù)等精確數(shù)據(jù)，但已可以預測，飽和后體液內(nèi)游離的藥物分數(shù)增加，將提高抗蟲效果，同時也會使不良反應的程度加劇.從根本意義上看，為保障療效和安全性，設置劑量時應考慮到其他競爭結合物的存在，以及錐蟲感染可能會導致的體內(nèi)蛋白質(zhì)變化.

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