黃靚 熊文昊 王漢群 鄒飛燕 唐志晗 張弛

鬼箭羽水溶成分抑制氧化型低密度蛋白誘導(dǎo)的THP-1 源性巨噬細(xì)胞炎癥因子表達(dá)

黃靚 熊文昊 王漢群 鄒飛燕 唐志晗 張弛

目的 探討鬼箭羽水溶成分對(duì)氧化型低密度脂蛋白 (ox-LDL)誘導(dǎo)的 THP-1 源性巨噬細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響。方法 將 THP-1 源性巨噬細(xì)胞分為五個(gè)組 , 即對(duì)照組、ox-LDL 組、鬼箭羽 1 組、鬼箭羽 2 組、鬼箭羽 3 組。MTT (噻唑藍(lán) )比色法檢測(cè) THP-1 細(xì)胞活力 , 酶聯(lián)免疫吸附法 (ELISA)檢測(cè)細(xì)胞上清液中腫瘤壞死因子 α(TNF-α)、白細(xì)胞介素 6(IL-6)的含量。結(jié)果 鬼箭羽能明顯改善 ox-LDL 作用下 THP-1 源性巨噬細(xì)胞的細(xì)胞活力 , 抑制 ox-LDL 誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥因子分泌 , 并且呈現(xiàn)濃度依賴性 , 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)。結(jié)論 鬼箭羽水溶成分抑制氧化型低密度脂蛋白誘導(dǎo)的 THP-1 源性巨噬細(xì)胞炎癥因子表達(dá)有關(guān)。

鬼箭羽 ；氧化型低密度脂蛋白 ；THP-1 源性巨噬細(xì)胞 ； 細(xì)胞活力 ；炎癥因子

近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn) , 動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中不僅有脂質(zhì)沉積 , 還有大量的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn) , 這說(shuō)明炎癥在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起著重要作用。泡沫細(xì)胞的形成是動(dòng)脈硬化早期主要的病理特征 , 氧化型低密度脂蛋白 (oxidized LDL, ox-LDL)對(duì)泡沫細(xì)胞的形成發(fā)揮著舉足輕重的作用。血液中的單核細(xì)胞在內(nèi)膜下轉(zhuǎn)化為巨噬細(xì)胞 , 繼而通過(guò) A 型清道受體不斷吞噬大量 ox-LDL, 導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)堆積 ,最終形成泡沫細(xì)胞。鬼箭羽是一種主產(chǎn)于我國(guó)北部的中藥材 , 它是衛(wèi)矛科植物衛(wèi)矛的具有翅狀物的枝條或翅狀附屬物 , 其功效在《本經(jīng)》的載述主要是破血、止痛、通經(jīng)、瀉下、殺蟲(chóng)等；最近的研究表明 , 鬼箭羽具有降低血糖、調(diào)節(jié)血脂、以及抗動(dòng)脈粥樣硬化等作用。

1 材料與方法

1. 1 藥物與試劑 鬼箭羽藥材購(gòu)自衡陽(yáng)市藥材公司 , 經(jīng)專家鑒定為衛(wèi)矛科植物的嫩枝和翅狀附屬物。取鬼箭羽藥材500 g加 6倍水 , 2 h/次 , 煎煮 2次 , 濃縮至 3.0 g/ml生藥 , 浸膏待用 ；THP-1細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)與細(xì)胞生 物學(xué)研究所 細(xì) 胞中心 ；RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自 Gibco公司 ；佛波酯購(gòu)自 sigma公司 ；TNF-α 酶聯(lián)免疫吸附試劑盒、IL-6酶聯(lián)免疫吸附試劑盒均購(gòu)自美國(guó) R&D公司。

1. 2 脂蛋白的分離、氧化修飾及鑒定 健康人血漿購(gòu)自衡陽(yáng)市中心血站 , 采用超速離心法制備低密度脂蛋 (LDL), 然后用 含 10 μmol/L CuSO4 的 PBS溶 液 將 LDL氧化修 飾 成 ox-LDL, 4℃ 保存。

1. 3 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 THP-1細(xì)胞用含有 10% 小牛血清RPMI 1640培養(yǎng)液 , 在 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中靜置培 養(yǎng)。培養(yǎng)基中加 HEPES 10 mmol/L, 在每次實(shí)驗(yàn)前用 160 nmol/L佛波酯處理 24 h, 使其誘導(dǎo)分化成巨噬細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)共分五組 ：①對(duì)照組 , 不加 ox-LDL處理 ；② ox-LDL組 50 mg/L ox-LDL處理 24 h組 ；③鬼箭羽 1組 ：3 μg/ml 鬼箭羽和 50 mg/L ox-LDL共處理 24 h組 ；④鬼箭羽 2組 ：10 μg/ml 鬼箭羽和 50 mg/L ox-LDL共處理 24 h組 ；⑤鬼箭羽 3組 ：30 μg/ml 鬼箭羽和50 mg/L ox-LDL共處理 24 h組。

1. 4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)該研究的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)的分析 , 計(jì)量資料以均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差 ( x-±s)表示 ,組間比較采用方差分析和 t檢驗(yàn) , P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2 .1 不同濃度鬼箭羽對(duì) ox-LDL作用下 THP-1巨噬細(xì)胞活力的影響 ,見(jiàn)表1。

與對(duì)照組比較 , ox-LDL 組細(xì)胞活力明顯受損 (P＜0.01),不同濃度鬼箭羽組細(xì)胞活力較 ox-LDL 組有不同程度的增強(qiáng) ,且呈現(xiàn)濃度依賴性。

2. 2 鬼箭羽對(duì) ox-LDL 作用下 THP-1 巨噬細(xì)胞炎癥因子分泌的影響

圖 1 鬼箭羽減少 ox-LDL所致的 THP-1細(xì)胞 TNF-α 的釋放

圖 2 鬼箭羽減少 ox-LDL所致的 THP-1細(xì)胞 IL-6的釋放

THP-1 細(xì)胞經(jīng) 50 mg/L ox-LDL 處理 2 h 后 , 細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的 TNF-α、IL-6 濃度增加 , 與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì) 學(xué) 意 義 (P＜0.05), 而 ox-LDL+ 不 同 濃 度 (3、10、30 μg/ml)的鬼箭羽處理 2 h 后 , TNF-α、IL-6 濃度顯著降低 , 與 ox-LDL 組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05), 且呈現(xiàn)出濃度依賴性。

3 討論

動(dòng)脈硬化是一種炎癥性疾病 , 炎癥反應(yīng)貫穿了動(dòng)脈硬化發(fā)生發(fā)展的全過(guò)程 , 大量的炎癥因子參與到這個(gè)過(guò)程中 , 對(duì)動(dòng)脈硬化的形成與發(fā)展發(fā)揮了重要的作用。TNF-α 是一種由單核細(xì)胞分泌的炎癥與免疫調(diào)節(jié)因子 , 在 AS 病變中的表達(dá)明顯增高 , 提示其與 AS 及 CHD 的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。IL-6 是一種多功能的前炎癥因子 , 能加速肝臟合成 C- 反應(yīng)蛋白 , 促使血管內(nèi)皮細(xì)胞的活化和血管平滑肌細(xì)胞的增生。IL-6 可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子的表達(dá)與釋放 , 促使巨噬細(xì)胞對(duì) LDL 的攝取 , 促進(jìn)動(dòng)脈硬化的形成［1］。

鬼箭羽以衛(wèi)矛之名始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》, 現(xiàn)有的研究證明 , 鬼箭羽提取物主要通過(guò)降低急性缺血模型大鼠血清 CK、CK-MB、AST、LDH 和 MDA 水 平 , 提 高 大 鼠 血 清SOD、NO 含量來(lái)改善心肌細(xì)胞耐缺氧的能力 , 從而發(fā)揮防治心肌缺血的作用；另外鬼箭羽的提取物能夠顯著降低糖尿病小鼠的空腹血糖 , 從而改善糖尿病小鼠由于血糖增高所引起的糖代謝紊亂。韓國(guó)學(xué)者研究報(bào)道 , 鬼箭羽通過(guò)抑制 IKKβ來(lái)減弱 LPS 誘導(dǎo)的 RAW264.7 細(xì)胞 NF-κB 的活化 , 從而抑制 iNOS 的表達(dá)和 NO 的產(chǎn)生 , 發(fā)揮抗炎的作用。鬼箭羽的提取物還具有清除活性氧自由基的作用 , 可防止生物膜的脂質(zhì)過(guò)氧化。在本研究中 , 首次發(fā)現(xiàn)鬼箭羽能夠顯著降低 50 mg/L ox-LDL 誘發(fā)的 THP-1 源性巨噬細(xì)胞 TNF-α、IL-6 的釋放 ,并提高 ox-LDL 誘導(dǎo)的 THP-1 源性巨噬細(xì)胞細(xì)胞活力 , 呈現(xiàn)濃度依賴性 , 結(jié)果提示鬼箭羽可能通過(guò)抑制炎癥因子的釋放來(lái)發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用。至于鬼箭羽究竟通過(guò)何種信號(hào)通路發(fā)揮其抗炎作用 , 以及鬼箭羽對(duì)于巨噬細(xì)胞膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)的影響 , 作者將在后續(xù)的試驗(yàn)中繼續(xù)研究。

［1］黃德斌 ,余昭芬 .鬼箭羽三種提取物對(duì)氧自由基作用的影響 .湖北民族學(xué)院學(xué)報(bào) , 2006,23(2):4-6.

2014-04-08］

421001 湖南衡陽(yáng) , 南華大學(xué)心血管病研究所 (黃靚 唐志晗 )；外科學(xué)總論教研室 (黃靚 熊文昊 王漢群 鄒飛燕 唐志晗 )；機(jī)能學(xué)實(shí)驗(yàn)中心 (張弛 )