由慶軍 杜依燃

CHL1在腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤中表達(dá)的臨床意義

由慶軍 杜依燃

目的研究CHL1在腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤中表達(dá)的臨床意義。方法采用RT-PCR和Western blot檢測(cè)腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤原發(fā)組織和瘤旁組織中CHL1的表達(dá), 分析其與臨床病理因素關(guān)系。結(jié)果CHL1在腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤原發(fā)瘤組織中的表達(dá)低于相應(yīng)的瘤旁組織。結(jié)論為研究腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤發(fā)生和進(jìn)展提供了策略。

腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤；CHL1；臨床意義

腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見(jiàn)的原發(fā)性腫瘤, 具有侵襲性生長(zhǎng), 無(wú)控性增殖, 易復(fù)發(fā)的特點(diǎn)［1,2］。其本質(zhì)上是一種多基因異常疾病, 通過(guò)原癌基因的過(guò)表達(dá), 同時(shí)伴隨抑癌基因的突變?nèi)笔? 從而使腫瘤細(xì)胞逃避了正常生長(zhǎng)的調(diào)控機(jī)制。傳統(tǒng)治療方法(包括手術(shù)、化療和放療)并沒(méi)有完全解決膠質(zhì)細(xì)胞瘤侵襲性生長(zhǎng)所導(dǎo)致的高復(fù)發(fā)率和低治愈率難題。由此, 從根本上糾正與腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的基因異常的基因治療已成為醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)［3］。

神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和再生過(guò)程中, 細(xì)胞粘附分子(cell adhesion molecules, CAM)是介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞, 細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間相互識(shí)別、粘附和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要信號(hào)分子［4,5］。 CAM主要分為四大類：免疫球蛋白超家族、鈣粘素、整合素和選擇素。CHL1基因定位于3q26上, 屬于細(xì)胞粘附分子免疫球蛋白超家族, 集中表達(dá)于神經(jīng)系統(tǒng)。目前關(guān)于CHL1與腫瘤的關(guān)系已引起人們的重視。Y.Li等［6］研究發(fā)現(xiàn), CHL1促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的粘附和遷移, 但是不促進(jìn)侵襲。N.Gavert等［7］在結(jié)腸癌中研究發(fā)現(xiàn), CHL1介導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移不需要上皮細(xì)胞的間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)和腫瘤樣干細(xì)胞表型發(fā)生變化。但是目前對(duì)于CHL1在腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤中表達(dá)的臨床意義的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

本研究中, 作者檢測(cè)了100例腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤患者的原發(fā)組織及相應(yīng)的瘤旁組織標(biāo)本的CHL1表達(dá)情況。結(jié)果表明：CHL1在腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤組織中低表達(dá), 在癌旁組織相對(duì)高表達(dá), 并且在mRNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平相一致。CHL1 mRNA表達(dá)量與臨床分期、組織學(xué)分級(jí)、腫瘤大小、淋巴結(jié)狀態(tài)等因素相關(guān)。因此, CHL1為深入研究腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤的分子病理機(jī)制以及臨床治療提供新線索和策略, 有望成為腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤早期診斷和預(yù)測(cè)預(yù)后的生物分子標(biāo)志物。

1 材料與方法

1.1腫瘤標(biāo)本 100例腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤組織標(biāo)本均取自2005年9月~2012年1月吉林市中心醫(yī)院收治的腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤患者, 所有病例術(shù)前均未行放療和化療。組織樣本經(jīng)液氮速凍后-80℃保存。所有樣本采集和使用均征得患者同意并簽署知情同意書后由吉林市中心醫(yī)院倫理委員會(huì)同意使用。

1.2細(xì)胞總RNA的提取 采用TRAZOL一步法快速提取細(xì)胞總RNA。將腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤組織樣本加入液氮在研缽中磨碎, 加3~5 ml Trizol試劑, 室溫作用30 min后懸液分裝于1.5 ml EP管中, 每管1 ml；待組織細(xì)胞消化完全后于每個(gè)EP管中加入氯仿(200 μl/1 ml Trizol), 顛倒混勻, 12, 000×g 4℃離心20 min； 吸取上層水相, 移至另一干凈的EP管中,分別加入異丙醇(0.5 ml/1 mlTrizol)混勻。-20℃沉淀2 h, 12000×g 4℃離心20 min；棄上清, 75%乙醇洗滌RNA 沉淀3次；用真空泵抽干RNA沉淀, 加入DEPC水溶解RNA, 65℃助溶5~10 min；用微量核酸定量分析儀檢測(cè)RNA濃度和純度, 較純的RNA OD260/OD280的值在1.5~2.0之間。取1 μg RNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量, 完整的RNA其28 S與18 S的條帶亮度比值應(yīng)為2：1。實(shí)時(shí)熒光定量PCR。

1.3cDNA的合成 20 μl SuperScriptTMII體系中包括5 μg總RNA, 0.5 μg Oligo (dT), 10 nmol dNTP mix, 65℃變性5 min,冰浴后加入First-Strand Buffer, 0.2 μmol DTT和40 U RNA酶抑制劑, 37℃溫育2 min后加入M-MLV 200 U, 37℃反應(yīng)50 min。反應(yīng)完成后70℃, 15 min終止反應(yīng)。

1.4熒光定量PCR反應(yīng) 采用Oligo6.0軟件設(shè)計(jì)引物和探針序列, 引物及探針均由上海生工生物工程公司合成。實(shí)時(shí)熒光定量PCR, 20 μl反應(yīng)體系中包括由40 ng總RNA反轉(zhuǎn)錄所得的cDNA, 10 μl Platinum Quantitative PCR SuperMix-UDG, 10 μmol/L的上下游引物和TaqMan探針各0.4 μl。PCR反應(yīng)條件為50℃ 溫育2 min, 95℃預(yù)變性3 min, 95℃變性30 s, 60℃退火延伸1 min, 40個(gè)循環(huán)。CT值為熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)過(guò)的循環(huán)數(shù)。每個(gè)樣本中每個(gè)基因的檢測(cè)均重復(fù)3次。CT值為熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)過(guò)的循環(huán)數(shù),△CT值為各樣本中目的基因的CT值與管家基因GAPDH的CT值之差, 2-△CT則為該樣本中CHL1相對(duì)于GAPDH mRNA的表達(dá)量。

1.5Western blot 制備4%濃縮膠和10%分離膠的聚丙烯酰胺垂直平板凝膠, 40 μg總蛋白經(jīng)80伏電壓電泳3 h后,電轉(zhuǎn)70伏3 h轉(zhuǎn)印至PVDF膜。含5% ECL blocking agent的TBS-T(pH 8.3)室溫封閉1 h后加入一抗, 4℃平搖過(guò)夜, TBS-T洗膜6次后加入辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗, 室溫孵育1 h, TBS-T洗膜6次, 加ECL Western blotting Detection Reagents顯色1~2 min, 曝光X膠片。用BIO-RAD ChemiDocXRS凝膠成像系統(tǒng)照相。一抗：兔抗人CHL1(Abcam公司)；二抗：辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗兔(Santa Cruz公司, 美國(guó))。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 選擇分組患者預(yù)后達(dá)到敏感性和特異性最佳值的mRNA水平作為閾值, 分別將腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤病例分類為CHL1mRNA高表達(dá)組和低表達(dá)組, 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn), P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1CHL1在腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤組織和配對(duì)的正常組織差異表達(dá)作者采用RT-PCR和Western blot 檢測(cè)100例同時(shí)收集腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤和配對(duì)瘤旁正常腦組織病例中CHL1 mRNA和蛋白表達(dá), 結(jié)果表明：患者的腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤原發(fā)組織中 CHL1表達(dá)量較配對(duì)瘤旁正常腦組織下調(diào)3倍以上, χ2檢驗(yàn)證實(shí)腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤原發(fā)組織中較配對(duì)瘤旁正常腦組織中表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.019 ), 見(jiàn)圖1A、B。

圖1 RT-PCR和Western blot 檢測(cè)腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤原發(fā)組織和配對(duì)瘤旁組織中CHL1表達(dá)量差異。A)CHL1 mRNA在配對(duì)腦良、惡性組織中的表達(dá)水平差異。B)CHL1蛋白在配對(duì)腦良、惡性組織中的表達(dá)水平差異。

2.2CHL1 表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系 CHL1 mRNA表達(dá)量與臨床分期、腫瘤大小、淋巴結(jié)狀態(tài)等因素相關(guān)。CHL1 mRNA在臨床分期III、II期組較I期組表達(dá)降低, 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2= 7.08, P=0.026)；在腫瘤T2 (2~5 cm)、T3 (> 5 cm)組低于T1(≤2 cm)組, 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.76, P=0.021)；隨著淋巴結(jié)陽(yáng)性數(shù)目增加而表達(dá)降低(χ2=13.01, P=0.001)；CHL1 mRNA在組織學(xué)分級(jí)III期組較I+II期組表達(dá)降低, 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.07, P=0.014)。表達(dá)量與年齡無(wú)明顯相關(guān)性(P=0.750), 見(jiàn)表1。

表1 CHL1 mRNA表達(dá)水平與臨床病理各因素的關(guān)系

3 討論

神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和再生過(guò)程中, 細(xì)胞粘附分子(cell adhesion molecules, CAM)是介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞, 細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間相互識(shí)別、粘附和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要信號(hào)分子［4］。CHL1在腫瘤中的作用也逐漸得到重視。A.Thies等［8］對(duì)惡性黑色素瘤、皮膚正常組織研究發(fā)現(xiàn), CHL1與轉(zhuǎn)移有關(guān)。A.Rokman 等［9］研究發(fā)現(xiàn), CHL1在前列腺癌中作為易感基因定位于3p26。E.N.Manderson等［10］對(duì)于CHL1同源性基因分子遺傳分析發(fā)現(xiàn), 卵巢癌中CHL1同contactin 6和 contactin 4 共同位于3p26, 是腫瘤抑制基因。N.Gavert等［11］研究發(fā)現(xiàn), 在浸潤(rùn)性結(jié)腸癌中, CHL1是β-catenin 信號(hào)通路的新靶點(diǎn)。

CHL1參與許多神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生。但是關(guān)于CHL1在腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤中表達(dá)的臨床意義的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究中作者發(fā)現(xiàn)患者的腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤原發(fā)組織中 CHL1表達(dá)量較配對(duì)瘤旁正常腦組織下調(diào)3倍以上, CHL1 mRNA表達(dá)量與臨床分期、腫瘤大小、淋巴結(jié)狀態(tài)等因素相關(guān)。CHL1mRNA在臨床分期III、II期組較I期組表達(dá)降低, 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果證明在腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤原發(fā)組織中CHL1低表達(dá), CHL1 mRNA表達(dá)量與臨床分期、組織學(xué)分級(jí)、腫瘤大小、淋巴結(jié)狀態(tài)等因素相關(guān)。作者的結(jié)果是否作為診斷患者的生物分子指標(biāo)有待進(jìn)一步證明。

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Clinical significance of CHL1 in glioma tumorigenesis express

YOU Qing-jun, DU Yi-ran.Jilin Central Hospital, Jilin 132011, China

ObjectiveTo evaluate the diagnostic value of CHL1 in glioma patients.MethodsRT-PCR and Western blot were used to examine the expression of CHL1 in samps, including 100 normal tissues and 30 primary tumors.ResultsCHL1 was low-regulated in glioma and related to LN.ConclusionOur results may provide a strategy for blocking glioma and progression.

Glioma tumorigenesis; CHL1; Clinical significance

132011 吉林省吉林市中心醫(yī)院神經(jīng)外科