金煜華，謝中國(guó)，樓 寶，史會(huì)來(lái)

(1.浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江省海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江舟山 316021；2.浙江海洋學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院，浙江舟山 316022；3.浙江舟山普陀海洋高科技園，浙江舟山 316102；4.湖南文理學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，湖南常德 415000)

黃姑魚(yú)Nibea albiflora Richardson俗稱(chēng)黃婆雞，屬鱸形目、石首魚(yú)科、黃姑魚(yú)屬，具有肉味鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富、養(yǎng)殖效益高等特點(diǎn)，是我國(guó)的重要海水經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)。近年來(lái)陸續(xù)開(kāi)展了黃姑魚(yú)生物學(xué)、全人工繁殖及大規(guī)格魚(yú)種培育技術(shù)研究等工作[1,2]。傳統(tǒng)的黃姑魚(yú)苗培育一般采用輪蟲(chóng)、鹵蟲(chóng)和橈足類(lèi)等生物活餌，但生物餌料成本昂貴，營(yíng)養(yǎng)不全面，產(chǎn)量不穩(wěn)定且易攜帶病原菌，育苗成活率僅為10%左右，嚴(yán)重制約著黃姑魚(yú)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。研制適用于黃姑魚(yú)仔稚魚(yú)的人工配合飼料部分或全部代替生物餌料是解決這一問(wèn)題的迫切需求。由于對(duì)黃姑魚(yú)仔稚魚(yú)營(yíng)養(yǎng)需求了解十分有限，因此難以配置出營(yíng)養(yǎng)均衡全面的飼料。研究黃姑魚(yú)仔稚魚(yú)發(fā)育過(guò)程中氨基酸、脂肪酸的變化，以期為開(kāi)發(fā)優(yōu)質(zhì)高效的仔稚魚(yú)微粒飼料提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)于2012年6-7月在浙江省海洋水產(chǎn)研究所西閃試驗(yàn)場(chǎng)進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)所用黃姑魚(yú)親魚(yú)為該試驗(yàn)場(chǎng)人工繁育的體質(zhì)健壯、無(wú)病無(wú)傷的2年齡黃姑魚(yú)。經(jīng)人工催產(chǎn)，收集受精卵于5 m×2 m×2 m的育苗池中充氣培養(yǎng)，育苗所用水為經(jīng)沉淀和沙濾后的天然海水，鹽度26.5～27.0。受精卵孵化期間水溫27±1℃，經(jīng)30 h左右孵出；仔稚幼魚(yú)在原池中培育，水溫27±2℃。

初孵仔魚(yú)2日齡開(kāi)口攝食，開(kāi)口餌料為經(jīng)過(guò)小球藻強(qiáng)化培育的褶皺臂尾輪蟲(chóng)，10日齡左右投喂鹵蟲(chóng)無(wú)節(jié)幼體，12日齡開(kāi)始投喂橈足類(lèi)或人工配合飼料。人工育苗餌料系列及使用時(shí)間如圖1所示。

圖1 黃姑魚(yú)人工育苗餌料系列及使用時(shí)期Fig.1 Feeding regime of the N.albiflora larvae

1.2 樣品采集

實(shí)驗(yàn)所取樣品為1、5、10、20、45日齡的仔稚魚(yú)，取樣時(shí)間均在早晨投喂飼料前，樣品取全魚(yú)，隨機(jī)取出的仔稚魚(yú)放入無(wú)餌料水族箱內(nèi)1 h，20、45日齡稚魚(yú)饑餓24 h。然后將所取的仔稚魚(yú)置于冰盤(pán)上致死。所得的樣品放在-80℃冰箱保存。仔稚魚(yú)樣品在氨基酸、游離氨基酸、脂肪酸分析前，用美國(guó)電熱YO-230冷干機(jī)經(jīng)充分冷凍干燥至恒重。

1.3 氨基酸分析

樣品用6 mol/L的鹽酸溶液在110℃下水解22 h，然后過(guò)濾水解液，用超純水定容后取2 mL減壓蒸干，干燥完后加入0.02 mol/L的鹽酸溶液2 mL溶解全部氨基酸，上機(jī)進(jìn)行色層分析。用美國(guó)安捷倫Agilent 1100全自動(dòng)氨基酸分析儀測(cè)定樣品中的的氨基酸組成。

1.4 游離氨基酸分析

準(zhǔn)確稱(chēng)取1.0 g樣品，加15 mL 5%三氯乙酸溶液勻漿，定容至25 mL，于4℃放置24 h。用定性濾紙過(guò)濾吸取0.1 mL在10 000 r/min下離心10 min，于4℃保存待檢測(cè)用。用美國(guó)安捷倫Agilent 1100全自動(dòng)氨基酸分析儀測(cè)定樣品中游離氨基酸。

1.5 脂肪酸分析

檢測(cè)方法采用GB／21514—2008，使用日本島津GC-2010氣相色譜儀測(cè)定。

1.6 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用SPSS19.0軟件處理，做單因素方差(One-way ANOVA)分析，若差異顯著（P＜0.05）則進(jìn)行Duncan多重比較。結(jié)果數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD，n=3)表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 黃姑魚(yú)仔稚魚(yú)氨基酸變化模式

各日齡黃姑魚(yú)仔稚魚(yú)所含必需氨基酸與非必需氨基酸的變化模式見(jiàn)表1。不同日齡的黃姑魚(yú)水解氨基酸中，必需氨基酸中的精氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、賴(lài)氨酸5種氨基酸的含量最高，占必需氨基酸總量的70%左右。必需氨基酸中的組氨酸、蛋氨酸含量最低，僅占必需氨基酸的10%左右。水解氨基酸的總量呈上升趨勢(shì)，必需氨基酸的總量，先下降，后上升。從不同日齡的氨基酸含量來(lái)看，賴(lài)氨酸為第一限制性氨基酸。非必需氨基酸中，天冬氨酸、谷氨酸和丙氨酸的含量最高，占非必需氨基酸總量的60%左右。隨發(fā)育階段不同，仔稚魚(yú)的各種氨基酸含量差異較大。

表1 黃姑魚(yú)仔稚魚(yú)氨基酸的含量（g/100 g）Tab.1 Contents and compositions of amino acids of N.albiflora larvae(g/100 g)

對(duì)仔稚魚(yú)飼料而言，任何一種必需氨基酸（EAA）的缺乏或者不足均會(huì)提高氨基酸的氧化代謝，導(dǎo)致魚(yú)類(lèi)生長(zhǎng)性能下降和飼料轉(zhuǎn)化率的降低[3-4]。因此，了解仔稚魚(yú)對(duì)每種必需氨基酸的特定需求量對(duì)能否配制出營(yíng)養(yǎng)平衡且成本較低的飼料至關(guān)重要。海水仔稚魚(yú)具有較高的生長(zhǎng)率[5]，因而對(duì)氨基酸有較高的需要量，以滿(mǎn)足其體蛋白的沉積、更迭、能量代謝及其它生理功能。海水仔稚魚(yú)的必需氨基酸通常認(rèn)為與已經(jīng)確定的魚(yú)類(lèi)的必需氨基酸一致，為蛋氨酸、賴(lài)氨酸、精氨酸、組氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、色氨酸、纈氨酸10種氨基酸。在實(shí)踐中采用魚(yú)肉氨基酸組成指標(biāo)作為魚(yú)類(lèi)必需氨基酸需要量能較好地反映魚(yú)類(lèi)氨基酸需要量，理想的飼料氨基酸模式應(yīng)該是仔稚魚(yú)的體組成氨基酸模式[6]。與幼成魚(yú)相比，由于不同時(shí)期仔稚魚(yú)器官和組織的發(fā)育速度不同，從而導(dǎo)致仔稚魚(yú)體的氨基酸組型隨發(fā)育階段不同而變化較大。ARAG?O等[3]的研究結(jié)果表明半滑舌鰨仔稚魚(yú)的氨基酸組型在發(fā)育過(guò)程不斷變化，必需氨基酸的需要量同時(shí)發(fā)生變化，很難制備能夠完全滿(mǎn)足仔稚魚(yú)各個(gè)時(shí)期氨基酸需要的平衡飼料。飼料中氨基酸的平衡能提高氨基酸的轉(zhuǎn)化率，促進(jìn)仔稚魚(yú)的生長(zhǎng)以及對(duì)蛋白質(zhì)的利用效率。隨著仔稚魚(yú)營(yíng)養(yǎng)研究的進(jìn)一步深入，越來(lái)越多的研究結(jié)果表明仔稚魚(yú)具有較強(qiáng)的調(diào)節(jié)氨基酸代謝能力。由于傳統(tǒng)方法難以推測(cè)仔稚魚(yú)的氨基酸需要量，近年來(lái)不少科研工作者采用同位素標(biāo)記的方法來(lái)研究仔稚魚(yú)的氨基酸需要量[7-9]。

2.2 黃姑魚(yú)仔稚魚(yú)游離氨基酸變化模式

黃姑魚(yú)仔稚魚(yú)發(fā)育階段的游離氨基酸含量見(jiàn)表2。1日齡的仔稚魚(yú)游離氨基酸含量最高，為12.134 g/100 g；45日齡仔稚魚(yú)的游離氨基酸含量最低，為1.497 g/100 g。隨著仔稚魚(yú)的生長(zhǎng)，游離氨基酸的含量呈降低趨勢(shì)，20日齡的黃姑魚(yú)仔稚魚(yú)游離氨基酸含量略有升高，推斷可能跟攝食的餌料鹵蟲(chóng)有關(guān)。隨著仔稚魚(yú)發(fā)育階段不同，各種游離氨基酸含量差異比較顯著。

表2 黃姑魚(yú)仔稚魚(yú)游離氨基酸的含量(g/100 g)Tab.2 Contents and compositions of free amino acids of N.albiflora larvae(g/100 g)

游離氨基酸（FAA）既是重要的代謝供能物質(zhì)，也是魚(yú)體蛋白質(zhì)生物合成的主要底物。游離氨基酸在海水魚(yú)魚(yú)卵成熟過(guò)程及孵化早期發(fā)揮著重要的作用，研究發(fā)現(xiàn)游離氨基酸可以作為鮭魚(yú)Gadus morhua卵和仔稚魚(yú)發(fā)育的能量源[10]。R?NNESTAD等[4]認(rèn)為海水魚(yú)類(lèi)的胃在仔稚魚(yú)時(shí)期尚未成功分化，導(dǎo)致仔稚魚(yú)攝食的蛋白質(zhì)無(wú)法高效率的變性、降解，而蛋白質(zhì)的降解產(chǎn)物小分子肽類(lèi)物質(zhì)或游離氨基酸相對(duì)于蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)更容易被仔稚魚(yú)吸收和利用，科研工作者已逐漸重視游離氨基酸及小肽的營(yíng)養(yǎng)作用。將14C標(biāo)記的游離氨基酸精氨酸、賴(lài)氨酸添加到飼料，采用管飼技術(shù)飼喂大西洋鮭Hippoglossus hippoglossus仔稚魚(yú)，30 min后發(fā)現(xiàn)腸道的平均吸收率高達(dá)71%，而排出率僅為6%[11]。海水仔稚魚(yú)攝食生物活餌后，游離氨基酸迅速釋放被仔稚魚(yú)吸收利用，因此推測(cè)游離氨基酸在魚(yú)類(lèi)消化系統(tǒng)發(fā)育不完善的早期階段發(fā)揮著重要的生理作用。研究證實(shí)，飼料中蛋白的可溶性以及肽的構(gòu)型會(huì)極大程度地影響仔魚(yú)的生長(zhǎng)[12]。游離氨基酸中的甘氨酸、丙氨酸和精氨酸可作為仔稚魚(yú)的誘食劑[13]。在仔稚魚(yú)飼料中添加過(guò)量的游離氨基酸，其效果往往會(huì)適得其反。受限于魚(yú)體體內(nèi)有限的轉(zhuǎn)運(yùn)載體，大量的游離氨基酸不能被吸收利用，而是通過(guò)鰓、泌尿系統(tǒng)等途徑排出體外，不會(huì)被用于蛋白質(zhì)合成以促進(jìn)生長(zhǎng)。

2.3 黃姑魚(yú)仔稚魚(yú)脂肪酸組成

黃姑魚(yú)仔稚魚(yú)體脂肪酸的變化模式見(jiàn)表3。黃姑魚(yú)仔稚魚(yú)發(fā)育過(guò)程的主要脂肪酸為：16:0、18:0、16:1、18:1和DHA，其總量占脂肪酸總量的70%左右。仔稚魚(yú)必需的脂肪酸DHA、EPA、ARA在仔稚魚(yú)的發(fā)育過(guò)程中含量變化均較為顯著，但均處于較高的含量水平。飼料脂肪酸組成直接影響到養(yǎng)殖對(duì)象脂肪酸組成和含量，由于不同日齡仔稚魚(yú)攝食不同的餌料，而不同餌料的脂肪酸組成不同，從而造成不同日齡仔稚魚(yú)的脂肪酸組成差異較大。

表3 黃姑魚(yú)仔稚魚(yú)脂肪酸組成(占總脂肪酸的質(zhì)量百分比)Tab.3 Contents and compositions of fatty acids of the N.albiflora larvae(weight percentage of total fatty acids)

脂類(lèi)是魚(yú)類(lèi)胚胎發(fā)育過(guò)程中重要的代謝能源，同時(shí)為海洋魚(yú)類(lèi)提供必需脂肪酸。對(duì)海水魚(yú)魚(yú)卵的脂肪酸組成分析發(fā)現(xiàn)，DHA和EPA在總脂肪酸中所占比重非常高，并且這種高水平一直持續(xù)于胚胎發(fā)育的全過(guò)程中，說(shuō)明這兩種脂肪酸在胚胎發(fā)育的過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。特別是n-3系列高度不飽和脂肪酸HUFA能影響水產(chǎn)動(dòng)物親體的繁殖力、受精率以及仔魚(yú)生長(zhǎng)和存活率[14-16]。n-3HUFA如DHA、EPA是海水仔稚魚(yú)的必需脂肪酸，必須從飼料中獲得[17-18]。n-6HUFA如ARA的作用也越來(lái)越得到重視，ARA對(duì)海水仔稚魚(yú)的生長(zhǎng)、滲透壓調(diào)節(jié)、存活率、魚(yú)體脂肪酸組成、繁殖、變態(tài)過(guò)程、體色、免疫力等方面同樣發(fā)揮著重要的影響[19]。仔稚魚(yú)脂肪酸的研究方向由分析單獨(dú)的脂肪酸營(yíng)養(yǎng)成分向研究脂肪酸整體營(yíng)養(yǎng)成分發(fā)展，考慮各種營(yíng)養(yǎng)成分合適的配比，RAINUZZO等[20]發(fā)現(xiàn)DHA和EPA的比例平衡對(duì)于維持生物膜的流動(dòng)性極為重要，一旦兩者比例失衡，尤其當(dāng)EPA高而DHA低時(shí)，會(huì)使磷脂結(jié)構(gòu)的組成不平衡，從而導(dǎo)致仔稚魚(yú)不能正常生長(zhǎng)。海水魚(yú)卵中脂類(lèi)的含量和組成相當(dāng)于仔、稚魚(yú)的脂類(lèi)需要，故對(duì)于開(kāi)始外源性攝食的仔魚(yú)而言，理想餌料的脂肪酸組型應(yīng)是與卵或卵黃囊仔魚(yú)的脂肪酸組型相近[21-22]。飼料脂肪酸組成直接影響到養(yǎng)殖對(duì)象脂肪酸組成已被大量的文獻(xiàn)報(bào)道所證實(shí)。由于本研究中不同日齡的仔稚魚(yú)攝食的餌料脂肪酸組成不同，這也是造成魚(yú)體脂肪酸組成差異的直接原因。

3 結(jié)論

黃姑魚(yú)仔稚魚(yú)發(fā)育過(guò)程中，由于各器官和組織的發(fā)育速度不同，不同餌料之間的氨基酸組型存在差異，導(dǎo)致黃姑魚(yú)仔稚魚(yú)的氨基酸組型是不斷變化的。必需氨基酸中的精氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、賴(lài)氨酸5種氨基酸的含量最高。1日齡的黃姑魚(yú)仔稚魚(yú)的游離氨基酸含量最高，隨后游離氨基酸的含量呈降低趨勢(shì)。黃姑魚(yú)仔稚魚(yú)的主要脂肪酸為：16:0、18:0、16:1、18:1和DHA。仔稚魚(yú)必需的脂肪酸DHA、EPA、ARA均處于較高的含量。

[1]雷霽霖,陳 超,徐延康,等.黃姑魚(yú)工廠化育苗技術(shù)研究[J].海洋科學(xué),1992,11(6):5-10.

[2]樓 寶,史會(huì)來(lái),毛國(guó)民,等.黃姑魚(yú)全人工繁育及大規(guī)格苗種培育技術(shù)研究[J].現(xiàn)代漁業(yè)信息,2011,26(3):20-23.

[3]ARAG?O C,CONCEIC?O L E C,FYHN H,et al.Estimated amino acid requirements during early ontogeny in fish with different life styles:gilthead seabream(Sparus aurata)and Senegalese sole(Solea senegalensis)[J].Aquaculture,2004,242:589-605.

[4]RφNNESTAD I,THORSEN A,FINN R N.Fish larval nutrition:recent advances in amino acid metabolism[J].Aquaculture,1999,177:201-216.

[5]DABROWSKI K.Ontogenetical aspects of nutritional requirements in fish[J].Comp Biochem Physiol,1986,85:639-655.

[6]MAMBRINI M,KAUSHIK S J.Indispensable amino acid requirements of fish:correspondence between quantitative data and amino acid profiles of tissue proteins[J].Journal of Applied Ichthyology,1995,11:240-247.

[7]R?NNESTAD I,ROJAS-GARCA C R,TONHEIM S,et al.In vivo studies of digestion and nutrient assimilation in marine fish larvae[J].Aquaculture,2001,201:161-175.

[8]HOVDE S C,VIDAL M C,OPSTAD I,et al.Design and synthesis of 14C-labeelled proteins as tools for protein digestion studies in fish larvae[J].Aquaculture Nutrition,2005,11:395-401.

[9]LE VAY L,GAMBOA-DELGADO J.Naturally-occurring stable isotopes as direct measures of larval feeding efficiency,nutrient incorporation and turnover[J].Aquaculture,2011,315:95-103.

[10]FYHN H J,SERIGSTAD B.Free amino acids as energy substrate in developing eggs and larvae of the cod Gadus morhua[J].Marine Biology,1987,296:335-341.

[11]APPLEBAUM S L,RφNNESTAD I.Absorption,assimilation and catabolism of individual free amino acids by larval Atlantic halibut(Hippoglossus hippoglossus)[J].Aquaculture,2004,230:313-322.

[12]CARVALHO A P,SA R,OLIVA TELES A,et al.Solubility and peptide profile affect the utilization of dietary protein by common carp(Cyprinus carpio)during early larval stages[J].Aquaculture,2004,234:319-333.

[13]薛 敏,解綬啟,崔奕波,等.魚(yú)類(lèi)促攝食物質(zhì)研究進(jìn)展[J].水生生物學(xué)報(bào),2003,27(6):639-643.

[14]IZQUIERDO M S,SOCORRO J,ARANTZAMENDI L,et al.Recent advances in lipid nutrition in fish larvae[J].Fish Physiology and Biochemistry,2000,22:97-107.

[15]KOVEN W M,TANDLER A,KISSIL G W,et al.The effect of dietary n-3 highly unsaturated fatty acids on growth,survival and swim bladder development in Sparus aurata larvae[J].Aquaculture,1990,91:131-141.

[16]SALHI M,IZQUIERDO M S,HERNáNDEZ-CRUZ C M,et al.Effect of lipid and n-3 HUFA levels in microdiets on growth survival and fatty acid composition of larval gilthead seabream(Sparus aurata)[J].Aquaculture,1994,124:275-282.

[17]劉鏡恪.海魚(yú)早期階段必需脂肪酸和磷脂的研究現(xiàn)狀與展望[J].海洋水產(chǎn)研究,2002,23(2):58-64.

[18]IZQUIERDO M S.Essential fatty acid requirements of cultured marine fish larvae[J].Aquaculture Nutrition,1996,2:183-191.

[19]KOVEN W,ANHOLT R V,LUTZKY S,et al.The effect of dietary arachidonic acid on growth,survival,and cortisol levels in different-age gilthead seabream larvae(Sparus auratus)exposed to handling or daily salinity change[J].Aquaculture,2003,228:307-320.

[20]RAINUZZO J R,REITAN K I,OLSEN Y.The significance of lipids at early stages of marine fish:A review[J].Aquaculture,1997,155:103-115.

[21]SARGENT J R,BELL J G,MCEVOY L A,et al.Recent development s in the essential fatty acid nutrition of fish[J].Aquaculture,1999,177:191-199.

[22]RAINUZZO J R,REITAN K I,OLSEN Y.The significance of lipids at early stages of marine fish:A review[J].Aquaculture,1997,155:103-115.