董玉瑋等

摘要：以活性污泥中分離出的亞硝化的細菌為研究對象，對亞硝化菌培養(yǎng)條件（培養(yǎng)溫度、pH、碳源、氮源、刺激因子）進行優(yōu)化。結(jié)果表明：亞硝化細菌最佳培養(yǎng)溫度為30 ℃，最佳培養(yǎng)基pH值為8.0，外加碳源Na2CO3最佳濃度為0.2%，NH4HCO3最佳濃度為0.2%，刺激因子LaCl3最佳濃度為0.004%。在此最佳培養(yǎng)條件下，亞硝化細菌生長及亞硝酸鹽氮富集能力達到最高，為185.36 mg/L，脫氮率最高為92.52%；采用三角瓶半連續(xù)式培養(yǎng)的亞硝化細菌脫氮性能優(yōu)于量筒培養(yǎng)的，而連續(xù)式培養(yǎng)較半連續(xù)式培養(yǎng)能更有利于亞硝化細菌菌群數(shù)量的增長和繁殖。

關(guān)鍵詞：亞硝化細菌；培養(yǎng)條件；優(yōu)化

中圖分類號： X172 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）04-0314-03

收稿日期：2013-08-19

基金項目：江蘇省自然科學基金（編號：BK2011201）；徐州工程學院科技計劃（編號：XKY2012216）。

作者簡介：董玉瑋（1980—），男，江蘇徐州人，博士，講師，主要從事環(huán)境微生物學研究。E-mail：dongyuwei66@163.com。

通信作者：張雁秋，教授。E-mail：yanqiuzhang66@163.com。亞硝化細菌在自然界分布十分普遍，土壤、淡水及海洋中都有亞硝化細菌的存在，能將氨氧化成亞硝酸，屬于硝化細菌科兩個生理亞群之一[1]，在硝化作用第一步即由銨鹽氧化為亞硝酸鹽的過程中起作用，同時也是其第一個限速反應[2-3]。亞硝化細菌與人類的關(guān)系十分密切，被廣泛應用于食品、生物、醫(yī)藥工業(yè)廢水凈化，城市污水處理，魚類養(yǎng)殖，農(nóng)作物土壤改良等方面[4-5]。亞硝化細菌的生長代謝過程極其緩慢，在適宜的條件下一般需要24 h才能完成1次分裂周期。在進行固體培養(yǎng)過程中甚至需數(shù)月才能長出菌落。亞硝化細菌是嚴格的專性化異養(yǎng)菌，以銨鹽的氧化滿足其能量的需要。在純培養(yǎng)的情況下，培養(yǎng)基中若加入有機物質(zhì)將會抑制亞硝化細菌的生長，但是自然環(huán)境中有機物質(zhì)對亞硝化細菌的影響不如在純培養(yǎng)中的大。亞硝化細菌對培養(yǎng)基組成、pH值和溫度等的改變都敏感[6]。本試驗研究碳源、氮源、溫度、刺激因子、pH對亞硝化細菌生長及亞硝酸鹽富集能力的影響，對亞硝化細菌培養(yǎng)條件進行優(yōu)化。

1材料和方法

1.1材料

亞硝化細菌從中國礦業(yè)大學環(huán)境與測繪學院實驗室活性污泥中富集分離獲得，經(jīng)鑒定為Nitrosomonas sp.[7]，經(jīng)不斷選育后該菌種亞硝酸鹽富集能力較強。

1.2方法

1.2.1培養(yǎng)基亞硝化細菌富集培養(yǎng)基[8]：0.4%（NH4）2SO4 、0.1% K2HPO4、0.05% MgSO4、0.2% NaCl、004% FeSO4，0.5% CaCO3 混勻溶解。調(diào)節(jié)pH值至8.0～8.2。亞硝化細菌液體培養(yǎng)基：亞硝化細菌富集培養(yǎng)基稀釋5倍，即為亞硝化細菌液體培養(yǎng)基，其中NH+4-N濃度為 206 mg/L。

1.2.2亞硝化細菌培養(yǎng)條件優(yōu)化

1.2.2.1溫度選取一定量的長勢較好的亞硝化細菌，加入500 mL亞硝化細菌液體培養(yǎng)基，于500 mL搖瓶中，調(diào)pH值為8，在15、25、30、35、40 ℃下，110 r/min搖床培養(yǎng)。

1.2.2.2Na2CO3濃度選取一定量的長勢較好的亞硝化細菌，加入500 mL亞硝化細菌液體培養(yǎng)基，于500 mL搖瓶中，調(diào)pH值為8，分別加入0.1%、0.2%、0.4%，1%Na2CO3，110 r/min，最適溫度下?lián)u床培養(yǎng)。

1.2.2.3NH4HCO3濃度選取一定量的長勢較好的亞硝化細菌，加入500 mL亞硝化細菌液體培養(yǎng)基，于500 mL搖瓶中，調(diào)pH值為8，分別加入0.02%、0.1%、0.2%、0.3% NH4HCO3，110 r/min，最適溫度，最適Na2CO3濃度下?lián)u床培養(yǎng)。

1.2.2.4刺激因子（氯化鑭）濃度選取一定量的長勢較好的亞硝化細菌，加入500 mL亞硝化細菌液體培養(yǎng)基，分別加入0.001%、0.002%、0.004%、0.008%、0.01%、0.02% LaCl3，110 r/min、最適溫度、最適Na2CO3濃度、最適NH4HCO3濃度下?lián)u床培養(yǎng)。

1.2.2.5pH值選取一定量的長勢較好的亞硝化細菌，加入500 mL亞硝化細菌液體培養(yǎng)基，于500 mL搖瓶中，分別于pH 6、7、8、9、10條件下，110 r/min，最適溫度，最適Na2CO3濃度，最適NH4HCO3濃度，最適LaCl3濃度下?lián)u床培養(yǎng)。

1.2.3亞硝化細菌培養(yǎng)方式的改進

1.2.3.1亞硝化細菌的半連續(xù)式培養(yǎng)采用最佳培養(yǎng)基，接種亞硝化細菌300 mL菌液分別于1 L三角瓶和1 L量筒中，不斷曝氣。30 ℃恒溫培養(yǎng)38～40 d，每7 d更換新的培養(yǎng)基，每2 d測定其亞硝酸態(tài)氮的含量。

1.2.3.2亞硝化細菌的連續(xù)式培養(yǎng)取300 mL亞硝化細菌菌體，接種于1 L三角瓶中，加滿亞硝化細菌最佳培養(yǎng)基，30 ℃ 連續(xù)式培養(yǎng)，每2 d測定其亞硝酸態(tài)氮的含量。

1.2.4檢測方法[9]亞硝態(tài)氮含量的測定采用α-萘胺分光光度法；銨態(tài)氮含量的測定采用納氏試劑分光光度法；硝態(tài)氮含量的測定采用酚二磺酸分光光度法。

2結(jié)果與分析

2.1溫度對亞硝化細菌培養(yǎng)的影響

分別于15、25、30、35、40 ℃下，120 r/min培養(yǎng)亞硝化細菌18 d。從圖1可知，隨著培養(yǎng)時間的增加，不同溫度下亞硝態(tài)氮含量都是先增加后趨于平緩。溫度過低時，亞硝化細菌的生長代謝緩慢，隨著溫度升高，亞硝化細菌細胞內(nèi)的生化反應加快，促進了亞硝態(tài)氮的生成。當溫度為30 ℃時，亞硝態(tài)氮濃度最高，為160.71 mg/L，即此時亞硝化細菌的脫氮能力最強，因此亞硝化細菌培養(yǎng)最佳溫度為30 ℃，這與 Hyungseok 的研究結(jié)果[10]一致。endprint

2.2pH值對亞硝化細菌培養(yǎng)的影響

從圖2可知，隨著培養(yǎng)時間的增加，不同pH值下亞硝態(tài)氮含量都是先增加后趨于平緩。亞硝化細菌適宜在偏堿性條件下生長，pH偏低時，其活性受到影響，隨著pH值的升高，亞硝化細菌變得活躍。當pH值為8.0時，亞硝態(tài)氮濃度最高，為172.16 mg/L，即此時亞硝化細菌的脫氮能力最強，因此亞硝化細菌培養(yǎng)最佳pH值為8.0，這與廖雪義[11]等的研究結(jié)果一致。

2.3Na2CO3濃度對亞硝化細菌培養(yǎng)的影響

亞硝化細菌以無機碳源為唯一碳源，因此培養(yǎng)體系中無機碳源的含量會對亞硝化細菌的生長產(chǎn)生影響。自然界中無機碳主要以CO2、HCO-3、CO2-33種形式存在，不同形式的無機碳源對亞硝化細菌的生長影響有一定影響，原來液體培養(yǎng)基以CaCO3為唯一碳源，由于CaCO3較難溶解，碳源釋放不足，因此補加易溶解的Na2CO3以提供更多的碳源供亞硝化細菌生長所需。

從圖3可知，隨著培養(yǎng)時間的增加，不同濃度Na2CO3下亞硝酸鹽氮含量都是先增加后趨于平緩。當Na2CO3濃度為0.2%時，亞硝態(tài)氮濃度最高，為171.44 mg/L，即此時亞硝化細菌的脫氮能力最強，因此亞硝化細菌液體培養(yǎng)基中最佳Na2CO3濃度為0.2%。

2.4NH4HCO3濃度對亞硝化細菌培養(yǎng)的影響

以NH+4為氮源最適合亞硝化細菌的生長，即硝化作用效率最高。NH4HCO3不但能提供NH+4形式氮源，且能提供HCO-3形式碳源，有利于亞硝化細菌獲得更多形式的碳源。

從圖4可知，隨著培養(yǎng)時間的增加，不同濃度的NH4HCO3下亞硝酸鹽氮含量都是先增加后趨于平緩。當?shù)摧^少時，無法滿足亞硝化細菌的生長需要，過多則會對亞硝化細菌有一定的刺激，硝化作用反而受到抑制。當NH4HCO3濃度為0.2%時，亞硝態(tài)氮濃度最高，為179.16 mg/L，即此時亞硝化細菌的脫氮能力最強，因此亞硝化細菌最佳NH4HCO3濃度為0.2%，這與楊代金等[12]的研究結(jié)果相近。

2.5刺激因子LaCl3對亞硝化細菌培養(yǎng)的影響

LaCl3對亞硝化細菌酶的作用與其濃度有關(guān)，當濃度較低時對酶具有變構(gòu)激活作用，而濃度高時對酶具有抑制作用。在一定的LaCl3含量范圍內(nèi)，亞硝化速率隨LaCl3含量的增加而增大。當LaCl3濃度為0.004%時，亞硝態(tài)氮濃度最高，為183.12 mg/L，當LaCl3濃度超過0.004%時，反而對亞硝態(tài)氮的積累有抑制作用（圖5）。

在加入0.2%Na2CO3、0.2% NH4HCO3、0.004% LaCl3的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)亞硝化細菌，pH值8.0，30 ℃，110 r/min培養(yǎng)10 d，每1 d測定亞硝態(tài)氮、銨態(tài)氮、硝態(tài)氮的含量，結(jié)果見圖6。

從圖6可以看出，在最佳培養(yǎng)條件下，隨著培養(yǎng)時間的增加，亞硝態(tài)氮含量逐漸增加，最高達185.36 mg/L，銨態(tài)氮去除率達到92.52%，硝態(tài)氮含量始終保持在較低水平，說明經(jīng)過優(yōu)化培養(yǎng)后，該亞硝化細菌的脫氮性能較好。

2.6培養(yǎng)方式對亞硝化細菌生長的影響

從圖7可以看出，在半連續(xù)培養(yǎng)中，隨著培養(yǎng)時間的增加，在三角瓶和量筒中進行半連續(xù)培養(yǎng)的亞硝化細菌，其脫氮性能總體呈增加趨勢。在每次更換培養(yǎng)基之前，亞硝態(tài)氮含量逐漸增加。第一次更換培養(yǎng)基前的亞硝態(tài)氮最高含量分別為86.04 mg/L和80.11 mg/L，最后一次更換培養(yǎng)基后，亞硝態(tài)氮的含量最高，分別達到174.17 mg/L和156.33 mg/L，分別增加了50.60%和48.75%。同時采用三角瓶培養(yǎng)的亞硝化細菌脫氮性能優(yōu)于量筒培養(yǎng)的。原因可能是：（1）三角瓶底部空間較大，有利于亞硝化細菌生長和營養(yǎng)物質(zhì)的傳遞，量筒底部狹小，不利于亞硝化細菌大量繁殖，也不利于營養(yǎng)物質(zhì)順利輸送；（2）由于亞硝化細菌對氧氣需求較低，三角瓶自下而上空間逐漸縮小，阻礙了過多的氧氣進入，從而更有利于亞硝化細菌生長。

從圖8可知，經(jīng)過連續(xù)式培養(yǎng)，亞硝化細菌的亞硝態(tài)氮含量總體呈增加的趨勢，最大值達到202.56 mg/L，40 d時亞硝態(tài)氮含量為178.08 mg/L，略高于半連續(xù)培養(yǎng)的亞硝態(tài)氮含量（174.17 mg/L），但連續(xù)式培養(yǎng)較半連續(xù)式培養(yǎng)操作更方便，同時能夠較好地有利于亞硝化細菌菌群數(shù)量的增長和繁殖，可為今后亞硝化細菌實驗室的擴大化培養(yǎng)提供參考。

3結(jié)論

本試驗優(yōu)化后的亞硝化細菌液體培養(yǎng)條件為0.2%NH4HCO3，0.2%Na2CO3，pH值8.0，溫度30 ℃，刺激因子LaCl3最佳濃度為0.004%。在最佳培養(yǎng)條件下，亞硝化細菌富集亞硝態(tài)氮能力最高，可達185.36 mg/L，脫氮率最高為92.52%。連續(xù)式培養(yǎng)較半連續(xù)式培養(yǎng)能更有利于亞硝化細菌菌群數(shù)量的增長和繁殖，且更方便。

參考文獻：

[1]Woses C R，Weisburg W G，Paster B J. The phylogeny of purple baeteria：the alpha subdivision[J]. Systematic and Applied Microbiology，1984，5（3）：327-336.

[2]De Boer W，Gunnewiek P J，Veenhuis M，et al. Nitrification at low pH by aggregated chemolithotrophic bacteria[J]. Applied and Environmental Microbiology，1991，57（12）：3600-3604.

[3]Liu Z P，Liu S J. Advances in the molecular biology of nitrifying microorganisms[J]. Chin J Appl Environ Biol，2004，10（4）：521-525.

[4]Hu J L，Lin X G，Chu H Y. Isolation of soil ammonia-oxidizing bacteria[J]. Soils，2005，37（5）：569-571.

[5]Yu J，Yang M，Qi R，et al. Community structures of ammonia-oxidizing bacteria in different municipal wastewater treatment systems[J]. Acta Scientiae Circumstantiae，2009，29（3）：521-526.

[6]Werner D，Newton W E. Nitrogen fixation in agriculture forestry[M]. Netherlands：Springer，2005：255-276.

[8]陳紹銘，鄭福壽. 水生生物學實驗法[M]. 北京：海洋出版社，1985：80-85.

[9]國家環(huán)境保護總局. 水和廢水監(jiān)測分析方法[M]. 北京：中國環(huán)境科學出版社，2002：258-280.

[10]Hyungseok Y. Nitrogen remove from synthetic wastewater bysimullaneus nitrification and denitrification via nitrite in anintermittently aerated teactor[J]. Wat Res，1999，33（1）：146.

[11]廖雪義，馬光庭，藍榮，等. 亞硝化作用菌種的分離篩選及條件選擇[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學，2007，35（5）：1259-1261.

[12]楊代金，張穗，王玉軍，等. 一株氨氮降解菌的篩選及其降解特性的初步研究[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學，2009，3（3）：87-90.endprint

2.2pH值對亞硝化細菌培養(yǎng)的影響

從圖2可知，隨著培養(yǎng)時間的增加，不同pH值下亞硝態(tài)氮含量都是先增加后趨于平緩。亞硝化細菌適宜在偏堿性條件下生長，pH偏低時，其活性受到影響，隨著pH值的升高，亞硝化細菌變得活躍。當pH值為8.0時，亞硝態(tài)氮濃度最高，為172.16 mg/L，即此時亞硝化細菌的脫氮能力最強，因此亞硝化細菌培養(yǎng)最佳pH值為8.0，這與廖雪義[11]等的研究結(jié)果一致。

2.3Na2CO3濃度對亞硝化細菌培養(yǎng)的影響

亞硝化細菌以無機碳源為唯一碳源，因此培養(yǎng)體系中無機碳源的含量會對亞硝化細菌的生長產(chǎn)生影響。自然界中無機碳主要以CO2、HCO-3、CO2-33種形式存在，不同形式的無機碳源對亞硝化細菌的生長影響有一定影響，原來液體培養(yǎng)基以CaCO3為唯一碳源，由于CaCO3較難溶解，碳源釋放不足，因此補加易溶解的Na2CO3以提供更多的碳源供亞硝化細菌生長所需。

從圖3可知，隨著培養(yǎng)時間的增加，不同濃度Na2CO3下亞硝酸鹽氮含量都是先增加后趨于平緩。當Na2CO3濃度為0.2%時，亞硝態(tài)氮濃度最高，為171.44 mg/L，即此時亞硝化細菌的脫氮能力最強，因此亞硝化細菌液體培養(yǎng)基中最佳Na2CO3濃度為0.2%。

2.4NH4HCO3濃度對亞硝化細菌培養(yǎng)的影響

以NH+4為氮源最適合亞硝化細菌的生長，即硝化作用效率最高。NH4HCO3不但能提供NH+4形式氮源，且能提供HCO-3形式碳源，有利于亞硝化細菌獲得更多形式的碳源。

從圖4可知，隨著培養(yǎng)時間的增加，不同濃度的NH4HCO3下亞硝酸鹽氮含量都是先增加后趨于平緩。當?shù)摧^少時，無法滿足亞硝化細菌的生長需要，過多則會對亞硝化細菌有一定的刺激，硝化作用反而受到抑制。當NH4HCO3濃度為0.2%時，亞硝態(tài)氮濃度最高，為179.16 mg/L，即此時亞硝化細菌的脫氮能力最強，因此亞硝化細菌最佳NH4HCO3濃度為0.2%，這與楊代金等[12]的研究結(jié)果相近。

2.5刺激因子LaCl3對亞硝化細菌培養(yǎng)的影響

LaCl3對亞硝化細菌酶的作用與其濃度有關(guān)，當濃度較低時對酶具有變構(gòu)激活作用，而濃度高時對酶具有抑制作用。在一定的LaCl3含量范圍內(nèi)，亞硝化速率隨LaCl3含量的增加而增大。當LaCl3濃度為0.004%時，亞硝態(tài)氮濃度最高，為183.12 mg/L，當LaCl3濃度超過0.004%時，反而對亞硝態(tài)氮的積累有抑制作用（圖5）。

在加入0.2%Na2CO3、0.2% NH4HCO3、0.004% LaCl3的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)亞硝化細菌，pH值8.0，30 ℃，110 r/min培養(yǎng)10 d，每1 d測定亞硝態(tài)氮、銨態(tài)氮、硝態(tài)氮的含量，結(jié)果見圖6。

從圖6可以看出，在最佳培養(yǎng)條件下，隨著培養(yǎng)時間的增加，亞硝態(tài)氮含量逐漸增加，最高達185.36 mg/L，銨態(tài)氮去除率達到92.52%，硝態(tài)氮含量始終保持在較低水平，說明經(jīng)過優(yōu)化培養(yǎng)后，該亞硝化細菌的脫氮性能較好。

2.6培養(yǎng)方式對亞硝化細菌生長的影響

從圖7可以看出，在半連續(xù)培養(yǎng)中，隨著培養(yǎng)時間的增加，在三角瓶和量筒中進行半連續(xù)培養(yǎng)的亞硝化細菌，其脫氮性能總體呈增加趨勢。在每次更換培養(yǎng)基之前，亞硝態(tài)氮含量逐漸增加。第一次更換培養(yǎng)基前的亞硝態(tài)氮最高含量分別為86.04 mg/L和80.11 mg/L，最后一次更換培養(yǎng)基后，亞硝態(tài)氮的含量最高，分別達到174.17 mg/L和156.33 mg/L，分別增加了50.60%和48.75%。同時采用三角瓶培養(yǎng)的亞硝化細菌脫氮性能優(yōu)于量筒培養(yǎng)的。原因可能是：（1）三角瓶底部空間較大，有利于亞硝化細菌生長和營養(yǎng)物質(zhì)的傳遞，量筒底部狹小，不利于亞硝化細菌大量繁殖，也不利于營養(yǎng)物質(zhì)順利輸送；（2）由于亞硝化細菌對氧氣需求較低，三角瓶自下而上空間逐漸縮小，阻礙了過多的氧氣進入，從而更有利于亞硝化細菌生長。

從圖8可知，經(jīng)過連續(xù)式培養(yǎng)，亞硝化細菌的亞硝態(tài)氮含量總體呈增加的趨勢，最大值達到202.56 mg/L，40 d時亞硝態(tài)氮含量為178.08 mg/L，略高于半連續(xù)培養(yǎng)的亞硝態(tài)氮含量（174.17 mg/L），但連續(xù)式培養(yǎng)較半連續(xù)式培養(yǎng)操作更方便，同時能夠較好地有利于亞硝化細菌菌群數(shù)量的增長和繁殖，可為今后亞硝化細菌實驗室的擴大化培養(yǎng)提供參考。

3結(jié)論

本試驗優(yōu)化后的亞硝化細菌液體培養(yǎng)條件為0.2%NH4HCO3，0.2%Na2CO3，pH值8.0，溫度30 ℃，刺激因子LaCl3最佳濃度為0.004%。在最佳培養(yǎng)條件下，亞硝化細菌富集亞硝態(tài)氮能力最高，可達185.36 mg/L，脫氮率最高為92.52%。連續(xù)式培養(yǎng)較半連續(xù)式培養(yǎng)能更有利于亞硝化細菌菌群數(shù)量的增長和繁殖，且更方便。

參考文獻：

[1]Woses C R，Weisburg W G，Paster B J. The phylogeny of purple baeteria：the alpha subdivision[J]. Systematic and Applied Microbiology，1984，5（3）：327-336.

[2]De Boer W，Gunnewiek P J，Veenhuis M，et al. Nitrification at low pH by aggregated chemolithotrophic bacteria[J]. Applied and Environmental Microbiology，1991，57（12）：3600-3604.

[3]Liu Z P，Liu S J. Advances in the molecular biology of nitrifying microorganisms[J]. Chin J Appl Environ Biol，2004，10（4）：521-525.

[4]Hu J L，Lin X G，Chu H Y. Isolation of soil ammonia-oxidizing bacteria[J]. Soils，2005，37（5）：569-571.

[5]Yu J，Yang M，Qi R，et al. Community structures of ammonia-oxidizing bacteria in different municipal wastewater treatment systems[J]. Acta Scientiae Circumstantiae，2009，29（3）：521-526.

[6]Werner D，Newton W E. Nitrogen fixation in agriculture forestry[M]. Netherlands：Springer，2005：255-276.

[8]陳紹銘，鄭福壽. 水生生物學實驗法[M]. 北京：海洋出版社，1985：80-85.

[9]國家環(huán)境保護總局. 水和廢水監(jiān)測分析方法[M]. 北京：中國環(huán)境科學出版社，2002：258-280.

[10]Hyungseok Y. Nitrogen remove from synthetic wastewater bysimullaneus nitrification and denitrification via nitrite in anintermittently aerated teactor[J]. Wat Res，1999，33（1）：146.

[11]廖雪義，馬光庭，藍榮，等. 亞硝化作用菌種的分離篩選及條件選擇[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學，2007，35（5）：1259-1261.

[12]楊代金，張穗，王玉軍，等. 一株氨氮降解菌的篩選及其降解特性的初步研究[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學，2009，3（3）：87-90.endprint

2.2pH值對亞硝化細菌培養(yǎng)的影響

從圖2可知，隨著培養(yǎng)時間的增加，不同pH值下亞硝態(tài)氮含量都是先增加后趨于平緩。亞硝化細菌適宜在偏堿性條件下生長，pH偏低時，其活性受到影響，隨著pH值的升高，亞硝化細菌變得活躍。當pH值為8.0時，亞硝態(tài)氮濃度最高，為172.16 mg/L，即此時亞硝化細菌的脫氮能力最強，因此亞硝化細菌培養(yǎng)最佳pH值為8.0，這與廖雪義[11]等的研究結(jié)果一致。

2.3Na2CO3濃度對亞硝化細菌培養(yǎng)的影響

亞硝化細菌以無機碳源為唯一碳源，因此培養(yǎng)體系中無機碳源的含量會對亞硝化細菌的生長產(chǎn)生影響。自然界中無機碳主要以CO2、HCO-3、CO2-33種形式存在，不同形式的無機碳源對亞硝化細菌的生長影響有一定影響，原來液體培養(yǎng)基以CaCO3為唯一碳源，由于CaCO3較難溶解，碳源釋放不足，因此補加易溶解的Na2CO3以提供更多的碳源供亞硝化細菌生長所需。

從圖3可知，隨著培養(yǎng)時間的增加，不同濃度Na2CO3下亞硝酸鹽氮含量都是先增加后趨于平緩。當Na2CO3濃度為0.2%時，亞硝態(tài)氮濃度最高，為171.44 mg/L，即此時亞硝化細菌的脫氮能力最強，因此亞硝化細菌液體培養(yǎng)基中最佳Na2CO3濃度為0.2%。

2.4NH4HCO3濃度對亞硝化細菌培養(yǎng)的影響

以NH+4為氮源最適合亞硝化細菌的生長，即硝化作用效率最高。NH4HCO3不但能提供NH+4形式氮源，且能提供HCO-3形式碳源，有利于亞硝化細菌獲得更多形式的碳源。

從圖4可知，隨著培養(yǎng)時間的增加，不同濃度的NH4HCO3下亞硝酸鹽氮含量都是先增加后趨于平緩。當?shù)摧^少時，無法滿足亞硝化細菌的生長需要，過多則會對亞硝化細菌有一定的刺激，硝化作用反而受到抑制。當NH4HCO3濃度為0.2%時，亞硝態(tài)氮濃度最高，為179.16 mg/L，即此時亞硝化細菌的脫氮能力最強，因此亞硝化細菌最佳NH4HCO3濃度為0.2%，這與楊代金等[12]的研究結(jié)果相近。

2.5刺激因子LaCl3對亞硝化細菌培養(yǎng)的影響

LaCl3對亞硝化細菌酶的作用與其濃度有關(guān)，當濃度較低時對酶具有變構(gòu)激活作用，而濃度高時對酶具有抑制作用。在一定的LaCl3含量范圍內(nèi)，亞硝化速率隨LaCl3含量的增加而增大。當LaCl3濃度為0.004%時，亞硝態(tài)氮濃度最高，為183.12 mg/L，當LaCl3濃度超過0.004%時，反而對亞硝態(tài)氮的積累有抑制作用（圖5）。

在加入0.2%Na2CO3、0.2% NH4HCO3、0.004% LaCl3的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)亞硝化細菌，pH值8.0，30 ℃，110 r/min培養(yǎng)10 d，每1 d測定亞硝態(tài)氮、銨態(tài)氮、硝態(tài)氮的含量，結(jié)果見圖6。

從圖6可以看出，在最佳培養(yǎng)條件下，隨著培養(yǎng)時間的增加，亞硝態(tài)氮含量逐漸增加，最高達185.36 mg/L，銨態(tài)氮去除率達到92.52%，硝態(tài)氮含量始終保持在較低水平，說明經(jīng)過優(yōu)化培養(yǎng)后，該亞硝化細菌的脫氮性能較好。

2.6培養(yǎng)方式對亞硝化細菌生長的影響

從圖7可以看出，在半連續(xù)培養(yǎng)中，隨著培養(yǎng)時間的增加，在三角瓶和量筒中進行半連續(xù)培養(yǎng)的亞硝化細菌，其脫氮性能總體呈增加趨勢。在每次更換培養(yǎng)基之前，亞硝態(tài)氮含量逐漸增加。第一次更換培養(yǎng)基前的亞硝態(tài)氮最高含量分別為86.04 mg/L和80.11 mg/L，最后一次更換培養(yǎng)基后，亞硝態(tài)氮的含量最高，分別達到174.17 mg/L和156.33 mg/L，分別增加了50.60%和48.75%。同時采用三角瓶培養(yǎng)的亞硝化細菌脫氮性能優(yōu)于量筒培養(yǎng)的。原因可能是：（1）三角瓶底部空間較大，有利于亞硝化細菌生長和營養(yǎng)物質(zhì)的傳遞，量筒底部狹小，不利于亞硝化細菌大量繁殖，也不利于營養(yǎng)物質(zhì)順利輸送；（2）由于亞硝化細菌對氧氣需求較低，三角瓶自下而上空間逐漸縮小，阻礙了過多的氧氣進入，從而更有利于亞硝化細菌生長。

從圖8可知，經(jīng)過連續(xù)式培養(yǎng)，亞硝化細菌的亞硝態(tài)氮含量總體呈增加的趨勢，最大值達到202.56 mg/L，40 d時亞硝態(tài)氮含量為178.08 mg/L，略高于半連續(xù)培養(yǎng)的亞硝態(tài)氮含量（174.17 mg/L），但連續(xù)式培養(yǎng)較半連續(xù)式培養(yǎng)操作更方便，同時能夠較好地有利于亞硝化細菌菌群數(shù)量的增長和繁殖，可為今后亞硝化細菌實驗室的擴大化培養(yǎng)提供參考。

3結(jié)論

本試驗優(yōu)化后的亞硝化細菌液體培養(yǎng)條件為0.2%NH4HCO3，0.2%Na2CO3，pH值8.0，溫度30 ℃，刺激因子LaCl3最佳濃度為0.004%。在最佳培養(yǎng)條件下，亞硝化細菌富集亞硝態(tài)氮能力最高，可達185.36 mg/L，脫氮率最高為92.52%。連續(xù)式培養(yǎng)較半連續(xù)式培養(yǎng)能更有利于亞硝化細菌菌群數(shù)量的增長和繁殖，且更方便。

參考文獻：

[1]Woses C R，Weisburg W G，Paster B J. The phylogeny of purple baeteria：the alpha subdivision[J]. Systematic and Applied Microbiology，1984，5（3）：327-336.

[2]De Boer W，Gunnewiek P J，Veenhuis M，et al. Nitrification at low pH by aggregated chemolithotrophic bacteria[J]. Applied and Environmental Microbiology，1991，57（12）：3600-3604.

[3]Liu Z P，Liu S J. Advances in the molecular biology of nitrifying microorganisms[J]. Chin J Appl Environ Biol，2004，10（4）：521-525.

[4]Hu J L，Lin X G，Chu H Y. Isolation of soil ammonia-oxidizing bacteria[J]. Soils，2005，37（5）：569-571.

[5]Yu J，Yang M，Qi R，et al. Community structures of ammonia-oxidizing bacteria in different municipal wastewater treatment systems[J]. Acta Scientiae Circumstantiae，2009，29（3）：521-526.

[6]Werner D，Newton W E. Nitrogen fixation in agriculture forestry[M]. Netherlands：Springer，2005：255-276.

[8]陳紹銘，鄭福壽. 水生生物學實驗法[M]. 北京：海洋出版社，1985：80-85.

[9]國家環(huán)境保護總局. 水和廢水監(jiān)測分析方法[M]. 北京：中國環(huán)境科學出版社，2002：258-280.

[10]Hyungseok Y. Nitrogen remove from synthetic wastewater bysimullaneus nitrification and denitrification via nitrite in anintermittently aerated teactor[J]. Wat Res，1999，33（1）：146.

[11]廖雪義，馬光庭，藍榮，等. 亞硝化作用菌種的分離篩選及條件選擇[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學，2007，35（5）：1259-1261.

[12]楊代金，張穗，王玉軍，等. 一株氨氮降解菌的篩選及其降解特性的初步研究[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學，2009，3（3）：87-90.endprint