王飛　張麗

摘要：采用超聲波破碎多食鞘氨醇桿菌細胞壁的方法提取雌二醇降解酶，通過單因素條件研究確定各因素對超聲波破碎影響的高低，依據Box-Benhnken設計原則對破碎條件進行響應面回歸模型分析（RSA）。研究得到最佳條件為：菌體濃度188 mg/mL，破碎功率400 W，總破碎時間29 min（超聲3 s，間隔5 s），認為破碎功率對超聲波破碎的影響最大。預測破碎后得到的粗酶液總酶活力為1.484 U，實際測得的粗酶液酶活力為1.477 U。根據試驗結果認為：采用超聲波破碎方法可以較好地提取氨肽酶，運用響應面分析法優(yōu)化超聲波破碎條件是可行的。

關鍵詞：ED4菌株；超聲波破碎；E2降解酶

中圖分類號：Q814.1；X172 文獻標志碼：A 文章編號：1002-1302（2014）04-0310-04

收稿日期：2013-08-23

基金項目：江蘇省自然科學基金（編號：SBK201022464）。

作者簡介：王飛（1988—），女，安徽合肥人，碩士研究生，研究方向為微生物學。E-mail：wang576180559@126.com。

通信作者：張麗，女，碩士，副教授，研究方向為生物化工。E-mail：njust_zhangli@163.com。近年來，甾體雌激素因其對生物體內分泌系統(tǒng)產生的種種不利影響而引起人們的廣泛關注[1-3]。甾體雌激素是一種環(huán)境內分泌干擾物質（endocrine-disrupting compounds，EDCs），是指能夠進入生物體內的外源性物質，可干擾生物體內天然激素的產生、釋放、代謝、交互作用，從而對生物體正常的體內激素平衡、代謝生長和行為產生干擾作用[4]。17β-雌二醇（E2）被認為是最具潛在影響、作用最強烈且在水環(huán)境中普遍存在的一種甾體雌激素，當其質量濃度低至ng/L級時仍可對水生生物繁殖、生態(tài)安全乃至人類健康造成極大的潛在威脅[5-6]。目前雌激素污染的生物修復主要通過從被污染的土壤與水質中分離篩選降解菌，再將其用于雌激素的生物降解、修復[7-12]。本研究采用超聲波破碎E2降解菌細胞壁的方法提取E2降解酶，通過單因素條件研究、響應面分析優(yōu)化超聲波破碎的最佳條件，旨在為E2降解酶的研究和E2降解途徑的建立奠定初步的研究基礎。

1材料與方法

1.1試驗材料

試驗菌株：多食鞘氨醇桿菌（Sphingobacterium multivolum）ED4，能高效降解17β-雌二醇，由筆者所在實驗室分離獲得。

試驗藥品：17β-雌二醇（17β-estradiol，E2），純度>98%，購自美國Sigma。

試驗儀器：超凈工作臺，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；超聲波細胞破碎儀，汕頭市科毅儀器設備有限公司；HC-3518高速冷凍離心機，科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司；DSX-280A手提式滅菌鍋，上海申騁儀器科技有限公司；752N分光光度計，上海精密科學儀器有限公司。

1.2試驗方法

1.2.1菌體制備從4 ℃冰箱中保存的LB斜面上挑取ED4菌株，連續(xù)活化3代，按2%接種量，在30 ℃條件下擴大培養(yǎng)至對數生長期時取出，離心收集菌體沉淀（4 ℃、5 000 r/min條件下離心20 min）；用pH值為7的磷酸緩沖溶液清洗、離心，反復洗滌后用無機鹽培養(yǎng)基將菌液稀釋到D600 nm為約0.5后，便制成菌懸液。

1.2.2粗酶液的制備將ED4菌種進行產酶培養(yǎng)72 h后，冰浴條件下用超聲波破碎細胞，300 W破碎4 s，間隔8 s，共破碎30 min；于10 000 r/min、4 ℃條件下高速離心30 min，收集上清液即為粗酶液。

1.2.317β-雌二醇降解酶活力的測定方法先向20 mL試管中加入9 mL 0.05 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（含10 mg/L 17β-雌二醇），再加入1mL粗酶液，30 ℃水浴中反應1 h后加入05 mL 1 mol/L的HCl溶液終止酶反應。每個處理重復2次。在一定溫度和pH值條件下，1 min內減少1 μg 17β-雌二醇所需的酶量為1個酶活力單位，用U表示[13]。

1.2.4超聲波破碎條件的確定首先根據單因素試驗確定菌體濃度、破碎功率、破碎時間3個條件對超聲波破碎的影響，然后按Box-Behnken原理設計試驗，以菌體濃度、破碎功率、破碎時間為響應變量，根據單因素試驗確定上下水平后，用Design-Expert 8.0.7.1軟件進行響應面優(yōu)化分析。破碎中用冰水浴冷卻樣品。

2結果與分析

2.1單因素超聲波破碎條件

2.1.1菌體濃度對超聲波破碎提取17β-雌二醇降解酶的影響在超聲波破碎功率為300 W、超聲破碎總時間為 26 min （工作時間4 s，間隔時間6 s）的條件下，配置50～350 mg/mL 不同濃度的ED4降解菌菌體懸液進行細胞破碎。由圖1可以看出，當菌體濃度為200 mg/mL時，17β-雌二醇降解酶的酶活力最高，但是隨著破碎體系中菌體濃度逐漸升高，酶活力隨之降低，這可能是當菌體濃度過高時，超聲波破碎難以形成空穴效應，產生的多余熱量降低了破碎效率并破壞了降解酶活性。

2.1.2破碎功率對超聲波破碎提取17β-雌二醇降解酶的影響當菌體懸液濃度為200 mg/mL時，在100～600 W的范圍內調節(jié)超聲破碎功率，破碎26 min（工作4 s，間隔6 s）。圖2結果表明，當破碎功率為300 W時，17β-雌二醇降解酶的酶活力最高；隨著破碎功率的不斷增加，降解酶活力逐漸下降；破碎功率過低時，降解酶釋放不完全而使酶活力較低；破碎功率超過最佳值時，由于超聲波空化現象而導致熱能增加，從而破壞了酶活性。

2.1.3破碎時間對超聲波破碎提取17β-雌二醇的影響設菌體懸液濃度為200 mg/mL，超聲破碎功率為300 W，破碎時間分別為5、12、19、26、33、40、47 min（工作4 s，間隔6 s）。圖3結果表明，在菌體濃度和超聲波破碎功率保持不變的前提下，17β-雌二醇降解酶的酶活力在破碎時間為26 min時達到最大值；隨著破碎時間的增加，降解酶活力呈下降趨勢?？赡茈S著時間的增加，超聲產生的熱量也逐漸增多，從而導致酶活力下降。endprint

2.2超聲波提取17β-雌二醇降解酶條件的優(yōu)化

以破碎功率、菌體濃度、破碎時間為響應變量，根據單因素試驗確定上下水平后，按Box-Behnken原理設計試驗并進行優(yōu)化分析。各試驗組的因素水平設計見表1，試驗分組及結果見表2。

3結論

本試驗研究了1株17β-雌二醇高效降解菌的超聲破碎的優(yōu)化條件。首先利用單因素試驗確定了破碎時間、破碎功率、菌體濃度等最佳破碎條件，然后用中心組合設計和響應面分析法確定了影響因子的取值。優(yōu)化后的破碎條件為破碎功率400 W、破碎時間29 min、菌體濃度188 mg/mL。在此破碎條件下，降解酶酶活力為1.477 U，與預測值擬合良好，說明該模型能很好地預測實際破碎情況。

參考文獻：

[1]丁小東，朱明華. 環(huán)境激素污染研究[J]. 能源環(huán)境保護，2006，20（4）：13-15.

[2]Gross-Sorokin M Y，Roast S D，Brighty G C. Assessment of feminization of male fish in English rivers by the Environment Agency of England and Wales[J]. Environmental Health Perspectives，2006，114（Suppl 1）：147-151.

[3]Johnson A C，Sumpter J P. Removal of endocrine-disrupting chemicals in activated sludge treatment works[J]. Environmental Science and Technology，2001，35（24）：4697-4703.

[4]Kavlock R J，Daston G P，Derosa C，et al. Research needs for the risk assessment of health and environmental effects of endocrine disruptors：a report of the U.S. EPA-sponsored workshop[J]. Environmental Health Perspectives，1996，104（Suppl 4）：715-740.

[5]世界資源研究所，聯合國環(huán)境規(guī)劃署，聯合國開發(fā)計劃署，等. 1998-99世界資源報告：全球環(huán)境指南[M]. 北京：中國環(huán)境科學出版社，1999.

[6]Hinteman T，Schneider C，Schler H F，et al. Field study using two immunoassays for the determination of estradiol and ethinylestradiol in the aquatic environment[J]. Water Research，2006，40（12）：2287-2294.

[7]任海燕，紀樹蘭，劉志培，等. 17α-乙炔基雌二醇降解菌的分離鑒定及降解特性[J]. 環(huán)境科學，2006，27（6）：1186-1190.

[8]Haiyan R， Shulan J， Ahmad N， et al. Degradation characteristics and metabolic pathway of 17α-ethynylestradiol by Sphingobacterium sp. JCR5[J]. Chemosphere， 2007， 66（2）： 340-346.

[9]Fujii K， Kikuchi S， Satomi M， et al. Degradation of 17β-estradiol by a gram-negative bacterium isolated from activated sludge in a sewage treatment plant in Tokyo， Japan[J]. Applied and Environmental Microbiology，2002，68（4）：2057-2060.

[10]Fan Z， Casey F X M， Hakk H， et al. Persistence and fate of 17β-estradiol and testosterone in agricultural soils[J]. Chemosphere， 2007， 67（5）： 886-895.

[11]Muller M，Patureau D，Godon J J，et al. Molecular and kinetic characterization of mixed cultures degrading natural and synthetic estrogens[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2010，85（3）：691-701.

[12]Yu C P， Roh H， Chu K H. 17β-estradiol-degrading bacteria isolated from activated sludge[J]. Environmental Science & Technology， 2007， 41（2）： 486-492.

[13]紀建業(yè). 脂肪酶活力測定方法的改進[J]. 通化師范學院學報，2005，26（6）：51-53.endprint

2.2超聲波提取17β-雌二醇降解酶條件的優(yōu)化

以破碎功率、菌體濃度、破碎時間為響應變量，根據單因素試驗確定上下水平后，按Box-Behnken原理設計試驗并進行優(yōu)化分析。各試驗組的因素水平設計見表1，試驗分組及結果見表2。

3結論

本試驗研究了1株17β-雌二醇高效降解菌的超聲破碎的優(yōu)化條件。首先利用單因素試驗確定了破碎時間、破碎功率、菌體濃度等最佳破碎條件，然后用中心組合設計和響應面分析法確定了影響因子的取值。優(yōu)化后的破碎條件為破碎功率400 W、破碎時間29 min、菌體濃度188 mg/mL。在此破碎條件下，降解酶酶活力為1.477 U，與預測值擬合良好，說明該模型能很好地預測實際破碎情況。

參考文獻：

[1]丁小東，朱明華. 環(huán)境激素污染研究[J]. 能源環(huán)境保護，2006，20（4）：13-15.

[2]Gross-Sorokin M Y，Roast S D，Brighty G C. Assessment of feminization of male fish in English rivers by the Environment Agency of England and Wales[J]. Environmental Health Perspectives，2006，114（Suppl 1）：147-151.

[3]Johnson A C，Sumpter J P. Removal of endocrine-disrupting chemicals in activated sludge treatment works[J]. Environmental Science and Technology，2001，35（24）：4697-4703.

[4]Kavlock R J，Daston G P，Derosa C，et al. Research needs for the risk assessment of health and environmental effects of endocrine disruptors：a report of the U.S. EPA-sponsored workshop[J]. Environmental Health Perspectives，1996，104（Suppl 4）：715-740.

[5]世界資源研究所，聯合國環(huán)境規(guī)劃署，聯合國開發(fā)計劃署，等. 1998-99世界資源報告：全球環(huán)境指南[M]. 北京：中國環(huán)境科學出版社，1999.

[6]Hinteman T，Schneider C，Schler H F，et al. Field study using two immunoassays for the determination of estradiol and ethinylestradiol in the aquatic environment[J]. Water Research，2006，40（12）：2287-2294.

[7]任海燕，紀樹蘭，劉志培，等. 17α-乙炔基雌二醇降解菌的分離鑒定及降解特性[J]. 環(huán)境科學，2006，27（6）：1186-1190.

[8]Haiyan R， Shulan J， Ahmad N， et al. Degradation characteristics and metabolic pathway of 17α-ethynylestradiol by Sphingobacterium sp. JCR5[J]. Chemosphere， 2007， 66（2）： 340-346.

[9]Fujii K， Kikuchi S， Satomi M， et al. Degradation of 17β-estradiol by a gram-negative bacterium isolated from activated sludge in a sewage treatment plant in Tokyo， Japan[J]. Applied and Environmental Microbiology，2002，68（4）：2057-2060.

[10]Fan Z， Casey F X M， Hakk H， et al. Persistence and fate of 17β-estradiol and testosterone in agricultural soils[J]. Chemosphere， 2007， 67（5）： 886-895.

[11]Muller M，Patureau D，Godon J J，et al. Molecular and kinetic characterization of mixed cultures degrading natural and synthetic estrogens[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2010，85（3）：691-701.

[12]Yu C P， Roh H， Chu K H. 17β-estradiol-degrading bacteria isolated from activated sludge[J]. Environmental Science & Technology， 2007， 41（2）： 486-492.

[13]紀建業(yè). 脂肪酶活力測定方法的改進[J]. 通化師范學院學報，2005，26（6）：51-53.endprint

2.2超聲波提取17β-雌二醇降解酶條件的優(yōu)化

以破碎功率、菌體濃度、破碎時間為響應變量，根據單因素試驗確定上下水平后，按Box-Behnken原理設計試驗并進行優(yōu)化分析。各試驗組的因素水平設計見表1，試驗分組及結果見表2。

3結論

本試驗研究了1株17β-雌二醇高效降解菌的超聲破碎的優(yōu)化條件。首先利用單因素試驗確定了破碎時間、破碎功率、菌體濃度等最佳破碎條件，然后用中心組合設計和響應面分析法確定了影響因子的取值。優(yōu)化后的破碎條件為破碎功率400 W、破碎時間29 min、菌體濃度188 mg/mL。在此破碎條件下，降解酶酶活力為1.477 U，與預測值擬合良好，說明該模型能很好地預測實際破碎情況。

參考文獻：

[1]丁小東，朱明華. 環(huán)境激素污染研究[J]. 能源環(huán)境保護，2006，20（4）：13-15.

[2]Gross-Sorokin M Y，Roast S D，Brighty G C. Assessment of feminization of male fish in English rivers by the Environment Agency of England and Wales[J]. Environmental Health Perspectives，2006，114（Suppl 1）：147-151.

[3]Johnson A C，Sumpter J P. Removal of endocrine-disrupting chemicals in activated sludge treatment works[J]. Environmental Science and Technology，2001，35（24）：4697-4703.

[4]Kavlock R J，Daston G P，Derosa C，et al. Research needs for the risk assessment of health and environmental effects of endocrine disruptors：a report of the U.S. EPA-sponsored workshop[J]. Environmental Health Perspectives，1996，104（Suppl 4）：715-740.

[5]世界資源研究所，聯合國環(huán)境規(guī)劃署，聯合國開發(fā)計劃署，等. 1998-99世界資源報告：全球環(huán)境指南[M]. 北京：中國環(huán)境科學出版社，1999.

[6]Hinteman T，Schneider C，Schler H F，et al. Field study using two immunoassays for the determination of estradiol and ethinylestradiol in the aquatic environment[J]. Water Research，2006，40（12）：2287-2294.

[7]任海燕，紀樹蘭，劉志培，等. 17α-乙炔基雌二醇降解菌的分離鑒定及降解特性[J]. 環(huán)境科學，2006，27（6）：1186-1190.

[8]Haiyan R， Shulan J， Ahmad N， et al. Degradation characteristics and metabolic pathway of 17α-ethynylestradiol by Sphingobacterium sp. JCR5[J]. Chemosphere， 2007， 66（2）： 340-346.

[9]Fujii K， Kikuchi S， Satomi M， et al. Degradation of 17β-estradiol by a gram-negative bacterium isolated from activated sludge in a sewage treatment plant in Tokyo， Japan[J]. Applied and Environmental Microbiology，2002，68（4）：2057-2060.

[10]Fan Z， Casey F X M， Hakk H， et al. Persistence and fate of 17β-estradiol and testosterone in agricultural soils[J]. Chemosphere， 2007， 67（5）： 886-895.

[11]Muller M，Patureau D，Godon J J，et al. Molecular and kinetic characterization of mixed cultures degrading natural and synthetic estrogens[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2010，85（3）：691-701.

[12]Yu C P， Roh H， Chu K H. 17β-estradiol-degrading bacteria isolated from activated sludge[J]. Environmental Science & Technology， 2007， 41（2）： 486-492.

[13]紀建業(yè). 脂肪酶活力測定方法的改進[J]. 通化師范學院學報，2005，26（6）：51-53.endprint