管思琪等

摘要：在湖南石門磺廠采集含砷尾砂樣品和水樣，利用選擇性培養(yǎng)基富集培養(yǎng)和分離，獲得13株對(duì)砷有抗性的菌株，這些菌株屬于Pseudomonas otitidis和銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa），均能在較高濃度的砷培養(yǎng)液中生存，主要通過還原砷達(dá)到對(duì)砷的高抗性作用。其中，菌株SM-T1對(duì)As（Ⅲ）和As（Ⅴ）的抗性分別達(dá)到了60 mmol/L和100 mmol/L，該菌株最適生長pH值為7.0～8.0，最適生長溫度為20 ℃；在砷濃度未達(dá)到致死濃度時(shí)，砷濃度對(duì) SM-T1 的生長速度影響較大，對(duì)其最終的生長狀況影響較小。這為進(jìn)一步利用砷抗性菌開展含砷環(huán)境的生物修復(fù)奠定了良好的基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：湖南石門；砷礦區(qū)；砷抗性菌；氧化還原；最適生長條件

中圖分類號(hào)： X172 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2014）04-0300-03

收稿日期：2013-08-29

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（編號(hào)：40930742）；國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（編號(hào)：2014CB846004）。

作者簡介：管思琪（1987—），女，江蘇南通人，碩士，從事環(huán)境微生物研究。

通信作者：王睿勇。Tel：（025）83592685；E-mail：wangry@nju.edu.cn。隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展，自然環(huán)境正面臨著空前壓力，砷污染日益加重便是其中之一。砷（As）是一種類金屬，廣泛存在于巖石圈、水圈和生物圈[1]，可能導(dǎo)致膀胱癌、腎癌、肝癌、肺癌、皮膚癌等的發(fā)生，被美國環(huán)境保護(hù)署列為典型致癌物[2]。砷可導(dǎo)致急性中毒和慢性中毒，在砷污染嚴(yán)重地區(qū)比如孟加拉國和印度引起極大關(guān)注。在我國很多地區(qū)也存在不同程度的砷污染，目前超過10個(gè)省、自治區(qū)發(fā)現(xiàn)了飲用水型砷中毒，因此，含砷化合物污染和防治已引起人們的普遍關(guān)注[3]。

砷污染對(duì)人類主要影響來自地方性的砷中毒和飲用水中砷含量超標(biāo)。2001年，世界衛(wèi)生組織建議將飲用水中砷的最高限度由原來的50 μg/L調(diào)整為10 μg/L[4]，如何治理砷污染，特別是如何從源頭上防止砷污染引起了人們的廣泛關(guān)注。目前主要的砷污染治理方法是將高毒性的砷轉(zhuǎn)化為低毒性的砷，或者將水體中的砷轉(zhuǎn)化為低水溶性或不溶于水的物質(zhì)。近年來，研究者發(fā)現(xiàn)砷抗性菌可以通過對(duì)砷的氧化/還原、吸附/去吸附、甲基化/去甲基化、沉淀/溶解等途徑來降低環(huán)境中砷的毒性[5-7]。砷抗性菌對(duì)砷的各種作用為治理砷污染提供了新的思路。

礦業(yè)活動(dòng)是導(dǎo)致砷污染的重要原因之一。從1850年工業(yè)革命到21世紀(jì)初，全球人為活動(dòng)向環(huán)境排放的砷含量逐年增加，其中礦業(yè)活動(dòng)產(chǎn)生的砷量占72.6%[8]。全球砷礦分布不均，其中，砷探明儲(chǔ)量的70%集中在中國。湖南石門有國內(nèi)外最大的雄磺礦，距今已有1 500年的開采歷史，年產(chǎn)砷礦3 000 t左右，在礦物開采過程中，極大污染了周圍的大氣、水和土壤環(huán)境，曾經(jīng)引起居民砷中毒事件的發(fā)生。本試驗(yàn)以該礦區(qū)的尾砂、水樣為研究對(duì)象，篩選分離砷抗性菌，對(duì)其進(jìn)行鑒定，并研究抗性菌對(duì)砷的氧化還原能力，為砷抗性菌的生物修復(fù)利用奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1含砷尾砂、水樣采集及其地化分析

尾砂來源于湖南省石門縣白云鄉(xiāng)界牌村的磺廠礦部選礦廠（29°38.727′N，111°2.049′E）；水樣來自礦廠一號(hào)窿二平硐口（29°38.760′N，111°2.130′E），現(xiàn)場測定pH值。采回的新鮮樣品充分混勻后，取一部分立刻進(jìn)行細(xì)菌分離，剩余的樣品經(jīng)冷凍干燥，參照孫青等的方法[9]測定元素含量。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1抗砷菌的富集、分離與純化抗砷富集培養(yǎng)基：1 L 去離子水中加入（NH）2SO4 2.0 g、乙酸鈉2.0 g、酵母提取物0.5 g 、胰蛋白胨1.0 g、葡萄糖0.2 g，pH值為7.5±0.2。培養(yǎng)基滅菌后，無菌加入NaAsO2至終濃度為10 mmol/L。制備固體培養(yǎng)基時(shí)，1 L培養(yǎng)基加入10.0 g瓊脂。取尾砂1.0 g或水樣20 mL加入100 mL抗砷富集培養(yǎng)基中，30 ℃、120 r/min搖床培養(yǎng)3 d；取1 mL富集培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到新的抗砷富集培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)接2次；將第3次轉(zhuǎn)接的富集培養(yǎng)物梯度稀釋后，涂布于抗砷富集培養(yǎng)基平板上，30 ℃培養(yǎng)3 d后劃線分離至純培養(yǎng)，獲得單菌落，轉(zhuǎn)接斜面保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2抗砷菌的鑒定 參照東秀珠等的方法[10]進(jìn)行。

1.2.3抗砷菌的抗性試驗(yàn)采用含有As的R2A培養(yǎng)基進(jìn)行抗性鑒定。將R2A培養(yǎng)基中As（Ⅲ）濃度調(diào)節(jié)為10、20、30、40、50、60 mmol/L，將As（Ⅴ）濃度調(diào)節(jié)為20、40、60、80、100、120 mmol/L；然后分別接入菌液，接種細(xì)胞密度約為 1×106個(gè)/mL，30 ℃、120 r/min條件下培養(yǎng)120 h；600 nm下測定吸光度D值，確定As（Ⅲ）的最小致死濃度和最大抗砷濃度。以大腸桿菌為對(duì)照菌株。

1.2.4菌株氧化、還原砷能力確定采用高錳酸鉀法。原理：高錳酸鉀具有強(qiáng)氧化性，與As（Ⅲ）接觸時(shí)氧化As（Ⅲ），同時(shí)自身還原而褪去紅色。檢驗(yàn)方法為：取50 μL R2A培養(yǎng)液、4 μL 0.01 mol/L高錳酸鉀溶液和946 μL無菌水搖勻?？瞻?為不加砷、高壓滅菌的R2A培養(yǎng)基50 μL，空白2為不接種、高溫高壓滅菌的R2A培養(yǎng)基50 μL，檢測樣為含有 10 mmol/L As（Ⅲ）或As（Ⅴ）的R2A培養(yǎng)基50 μL。

將菌種接入As（Ⅲ）濃度為10 mmol/L的R2A培養(yǎng)基，30 ℃、120 r/min下培養(yǎng)168 h。72 h和168 h各檢測1次，空白樣1中紅色不褪去，空白樣2中紅色褪去，樣品紅色不褪去或變淡，即該菌種具有砷氧化功能（圖1）。endprint

將菌種接入As（Ⅴ）濃度為10 mmol/L的R2A培養(yǎng)基，30 ℃、120 r/min下培養(yǎng)168 h，72 h和168 h各檢測1次，空白樣1中紅色不褪去，空白樣2中紅色不褪去，樣品紅色褪去，即該菌種具有砷還原功能（圖2）。

1.2.5菌株SM-T1的最適生長條件試驗(yàn)

1.2.5.1pH值對(duì)SM-T1生長的影響分別將As（Ⅲ）濃度為10 mmol/L的R2A培養(yǎng)基初始pH值調(diào)為5.0、6.0、70、8.0、9.0，接種SM-T1種子液，孢子濃度控制在 1×106個(gè)/mL，30 ℃、120 r/min條件下培養(yǎng)48 h，測定D值，確定細(xì)菌在不同pH值下的生長情況。

1.2.5.2溫度對(duì)SM-T1生長的影響將溫度分別設(shè)置為15、20、25、30、35 ℃，接種SM-T1種子液，孢子濃度 1×106個(gè)/mL，120 r/min下培養(yǎng)48 h，測定D值，確定細(xì)菌在不同溫度下的生長情況。

1.2.5.3不同砷濃度對(duì)SM-T1生長的影響在獲得最適pH值和最適溫度條件下，將As（Ⅲ）濃度設(shè)置為0、10、20、30 mmol/L，接種SM-T1種子液，孢子濃度1×106個(gè)/mL，120 r/min 條件下培養(yǎng)72 h，每隔4 h用分光光度計(jì)測定D值1次，確定細(xì)菌在不同濃度As（Ⅲ）條件下的生長曲線。

2結(jié)果與分析

2.1尾砂和水樣的化學(xué)分析結(jié)果

本研究共采集10個(gè)尾砂樣品和3個(gè)水樣，典型樣品的元素分析結(jié)果（表1）表明，尾礦SM-T-1和SM-T-6的砷含量極高，超過了質(zhì)量的30%，除Ca、Mg、Al外，2個(gè)樣品的其他金屬含量也均高于其他尾礦樣品；水樣SM-S-4的砷含量也達(dá)到了24.0%，除Ca、Mg外，主要金屬含量也均高于其他樣品。參照國標(biāo)GB 15618—1995《土壤環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》，所有樣品砷含量均達(dá)到重度污染程度。水樣分析表明，pH值為中性，砷含量嚴(yán)重超標(biāo)，達(dá)到30 mg/L以上。

2.2抗砷菌的富集培養(yǎng)、分離、純化和鑒定

經(jīng)過含AS（Ⅲ）濃度為10 mmol/L的抗砷培養(yǎng)基富集培養(yǎng)、相同濃度抗性平板篩選及多次劃線分離，所有樣品都分離得到了抗砷菌株，說明砷抗性菌在該環(huán)境中普遍存在。對(duì)分離獲得的13株細(xì)菌（均為好氧桿菌）進(jìn)行形態(tài)學(xué)和生理學(xué)鑒定，結(jié)合16S rDNA序列分析，初步鑒定這13株細(xì)菌為Pseudomonas otitidis和銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）。典型菌株的16S rDNA序列分析結(jié)果如圖3所示。

2.3菌株的抗砷試驗(yàn)

由表2可見，13個(gè)菌株都有很強(qiáng)的抗砷能力：除菌株 SM-S-7 外，其他菌株對(duì)As（Ⅲ）的抗性都超過40 mmol/L，對(duì)AS（Ⅴ）的抗性超過60 mmol/L。對(duì)砷抗性最強(qiáng)的是菌株SM-T1，其對(duì)As（Ⅲ）和As（Ⅴ）的抗性分別達(dá)到60 mmol/L和 100 mmol/L；As（Ⅲ）的毒性雖然比As（Ⅴ）的毒性要大得多，但是13個(gè)菌株對(duì)兩者的抵抗能力差異不大，這可能是菌株對(duì)砷發(fā)生氧化還原作用所致。

2.4抗砷菌對(duì)砷的氧化、還原作用

用高錳酸鉀法鑒定結(jié)果表明，大部分菌株對(duì)As（Ⅴ）有還原性，As（Ⅴ）被還原為As（Ⅲ）后，As（Ⅲ）對(duì)細(xì)胞的毒性更強(qiáng)，這可能也是這些菌株對(duì)As（Ⅲ）和As（Ⅴ）耐受能力差別不大的原因。

2.5菌株SM-T1最適生長條件

3小結(jié)與討論

通過在湖南石門璜礦采集含砷尾砂樣品和水樣，在實(shí)驗(yàn)室利用選擇性培養(yǎng)基富集培養(yǎng)和分離，獲得13株對(duì)砷有抗性的菌株；對(duì)菌株的鑒定表明，它們屬于Pseudomonas otitidis和銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）。對(duì)砷的抗性試驗(yàn)表

明，13個(gè)菌株均能在較高濃度的砷培養(yǎng)液中生存，主要通過還原砷達(dá)到對(duì)砷的高抗性作用，其中，菌株SM-T1對(duì)As（Ⅲ）和As（Ⅴ）的抗性分別達(dá)到了60 mmol/L和100 mmol/L。

對(duì)典型抗性菌株SM-T1研究表明，菌株SM-T1能在pH值5.0～9.0、溫度15～35 ℃范圍內(nèi)生長，最適生長pH值為7.0～8.0、最適生長溫度為20 ℃。在砷濃度未達(dá)到致死濃度時(shí)，砷濃度對(duì)SM-T1生長影響較大，對(duì)其最終的生長狀況影響較小，細(xì)菌可以進(jìn)行正常旺盛的細(xì)胞分裂。這為進(jìn)一步利用砷抗性菌開展含砷環(huán)境的生物修復(fù)奠定了良好基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1]Cullen W R，Reimer K J. Arsenic speciation in the environment[J]. Chemical Review，1989，89（4）：713-764.

[2]Chen M，Ma L Q，Harris W G. Arsenic concentrations in florida surface soils：influence of soil type and properties[J]. Soil Sci Soc J，2002，66：632-640.

[3]王薇，徐炎華. 水體中砷污染和治理概況[J]. 微量元素與健康研究，2005，22（5）：59-61.

[4]Gomez-Caminero A，Howe P，Hughes M，et al. Environmental health criteria 224 arsenic and arsenic compounds[R]. Geneva：World Health Organization，2001.

[5]Turpeinen R，Pantsar-Kallio M，Hggblom M，et al. Influence of microbes on the mobilization，toxicity and biomethylation of arsenic in soil[J]. Science of the Total Environment，1999，236（1/3）：173-180.

[6]Silver S，Phung L T. Genes and enzymes involved in bacterial oxidation and reduction of inorganic arsenic[J]. Applied and Environmental Microbiology，2005，71（2）：599-608.

[7]Kashyap D R，Botero L M，F(xiàn)ranck W L，et al. Complex regulation of arsenite oxidation in Agrobacterium tumefaciens[J]. Journal of Bacteriology，2006，188（3）：1081-1088.

[8]Han F X，Su Y，Monts D L，et al. Assessment of global industrial-age anthropogenic arsenic contamination[J]. Naturwissenschaften，2003，90（9）：395-401.

[9]孫青，邢輝，何斌，等. 安徽銅陵獅子山硫化物礦山酸礦水中微生物功能群的研究[J]. 巖石礦物學(xué)雜志，2009，28（6）：547-552.

[10]東秀珠，蔡妙英. 常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊[M]. 北京：科學(xué)出版社，2001：370-398.endprint

將菌種接入As（Ⅴ）濃度為10 mmol/L的R2A培養(yǎng)基，30 ℃、120 r/min下培養(yǎng)168 h，72 h和168 h各檢測1次，空白樣1中紅色不褪去，空白樣2中紅色不褪去，樣品紅色褪去，即該菌種具有砷還原功能（圖2）。

1.2.5菌株SM-T1的最適生長條件試驗(yàn)

1.2.5.1pH值對(duì)SM-T1生長的影響分別將As（Ⅲ）濃度為10 mmol/L的R2A培養(yǎng)基初始pH值調(diào)為5.0、6.0、70、8.0、9.0，接種SM-T1種子液，孢子濃度控制在 1×106個(gè)/mL，30 ℃、120 r/min條件下培養(yǎng)48 h，測定D值，確定細(xì)菌在不同pH值下的生長情況。

1.2.5.2溫度對(duì)SM-T1生長的影響將溫度分別設(shè)置為15、20、25、30、35 ℃，接種SM-T1種子液，孢子濃度 1×106個(gè)/mL，120 r/min下培養(yǎng)48 h，測定D值，確定細(xì)菌在不同溫度下的生長情況。

1.2.5.3不同砷濃度對(duì)SM-T1生長的影響在獲得最適pH值和最適溫度條件下，將As（Ⅲ）濃度設(shè)置為0、10、20、30 mmol/L，接種SM-T1種子液，孢子濃度1×106個(gè)/mL，120 r/min 條件下培養(yǎng)72 h，每隔4 h用分光光度計(jì)測定D值1次，確定細(xì)菌在不同濃度As（Ⅲ）條件下的生長曲線。

2結(jié)果與分析

2.1尾砂和水樣的化學(xué)分析結(jié)果

本研究共采集10個(gè)尾砂樣品和3個(gè)水樣，典型樣品的元素分析結(jié)果（表1）表明，尾礦SM-T-1和SM-T-6的砷含量極高，超過了質(zhì)量的30%，除Ca、Mg、Al外，2個(gè)樣品的其他金屬含量也均高于其他尾礦樣品；水樣SM-S-4的砷含量也達(dá)到了24.0%，除Ca、Mg外，主要金屬含量也均高于其他樣品。參照國標(biāo)GB 15618—1995《土壤環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》，所有樣品砷含量均達(dá)到重度污染程度。水樣分析表明，pH值為中性，砷含量嚴(yán)重超標(biāo)，達(dá)到30 mg/L以上。

2.2抗砷菌的富集培養(yǎng)、分離、純化和鑒定

經(jīng)過含AS（Ⅲ）濃度為10 mmol/L的抗砷培養(yǎng)基富集培養(yǎng)、相同濃度抗性平板篩選及多次劃線分離，所有樣品都分離得到了抗砷菌株，說明砷抗性菌在該環(huán)境中普遍存在。對(duì)分離獲得的13株細(xì)菌（均為好氧桿菌）進(jìn)行形態(tài)學(xué)和生理學(xué)鑒定，結(jié)合16S rDNA序列分析，初步鑒定這13株細(xì)菌為Pseudomonas otitidis和銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）。典型菌株的16S rDNA序列分析結(jié)果如圖3所示。

2.3菌株的抗砷試驗(yàn)

由表2可見，13個(gè)菌株都有很強(qiáng)的抗砷能力：除菌株 SM-S-7 外，其他菌株對(duì)As（Ⅲ）的抗性都超過40 mmol/L，對(duì)AS（Ⅴ）的抗性超過60 mmol/L。對(duì)砷抗性最強(qiáng)的是菌株SM-T1，其對(duì)As（Ⅲ）和As（Ⅴ）的抗性分別達(dá)到60 mmol/L和 100 mmol/L；As（Ⅲ）的毒性雖然比As（Ⅴ）的毒性要大得多，但是13個(gè)菌株對(duì)兩者的抵抗能力差異不大，這可能是菌株對(duì)砷發(fā)生氧化還原作用所致。

2.4抗砷菌對(duì)砷的氧化、還原作用

用高錳酸鉀法鑒定結(jié)果表明，大部分菌株對(duì)As（Ⅴ）有還原性，As（Ⅴ）被還原為As（Ⅲ）后，As（Ⅲ）對(duì)細(xì)胞的毒性更強(qiáng)，這可能也是這些菌株對(duì)As（Ⅲ）和As（Ⅴ）耐受能力差別不大的原因。

2.5菌株SM-T1最適生長條件

3小結(jié)與討論

通過在湖南石門璜礦采集含砷尾砂樣品和水樣，在實(shí)驗(yàn)室利用選擇性培養(yǎng)基富集培養(yǎng)和分離，獲得13株對(duì)砷有抗性的菌株；對(duì)菌株的鑒定表明，它們屬于Pseudomonas otitidis和銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）。對(duì)砷的抗性試驗(yàn)表

明，13個(gè)菌株均能在較高濃度的砷培養(yǎng)液中生存，主要通過還原砷達(dá)到對(duì)砷的高抗性作用，其中，菌株SM-T1對(duì)As（Ⅲ）和As（Ⅴ）的抗性分別達(dá)到了60 mmol/L和100 mmol/L。

對(duì)典型抗性菌株SM-T1研究表明，菌株SM-T1能在pH值5.0～9.0、溫度15～35 ℃范圍內(nèi)生長，最適生長pH值為7.0～8.0、最適生長溫度為20 ℃。在砷濃度未達(dá)到致死濃度時(shí)，砷濃度對(duì)SM-T1生長影響較大，對(duì)其最終的生長狀況影響較小，細(xì)菌可以進(jìn)行正常旺盛的細(xì)胞分裂。這為進(jìn)一步利用砷抗性菌開展含砷環(huán)境的生物修復(fù)奠定了良好基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1]Cullen W R，Reimer K J. Arsenic speciation in the environment[J]. Chemical Review，1989，89（4）：713-764.

[2]Chen M，Ma L Q，Harris W G. Arsenic concentrations in florida surface soils：influence of soil type and properties[J]. Soil Sci Soc J，2002，66：632-640.

[3]王薇，徐炎華. 水體中砷污染和治理概況[J]. 微量元素與健康研究，2005，22（5）：59-61.

[4]Gomez-Caminero A，Howe P，Hughes M，et al. Environmental health criteria 224 arsenic and arsenic compounds[R]. Geneva：World Health Organization，2001.

[5]Turpeinen R，Pantsar-Kallio M，Hggblom M，et al. Influence of microbes on the mobilization，toxicity and biomethylation of arsenic in soil[J]. Science of the Total Environment，1999，236（1/3）：173-180.

[6]Silver S，Phung L T. Genes and enzymes involved in bacterial oxidation and reduction of inorganic arsenic[J]. Applied and Environmental Microbiology，2005，71（2）：599-608.

[7]Kashyap D R，Botero L M，F(xiàn)ranck W L，et al. Complex regulation of arsenite oxidation in Agrobacterium tumefaciens[J]. Journal of Bacteriology，2006，188（3）：1081-1088.

[8]Han F X，Su Y，Monts D L，et al. Assessment of global industrial-age anthropogenic arsenic contamination[J]. Naturwissenschaften，2003，90（9）：395-401.

[9]孫青，邢輝，何斌，等. 安徽銅陵獅子山硫化物礦山酸礦水中微生物功能群的研究[J]. 巖石礦物學(xué)雜志，2009，28（6）：547-552.

[10]東秀珠，蔡妙英. 常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊[M]. 北京：科學(xué)出版社，2001：370-398.endprint

將菌種接入As（Ⅴ）濃度為10 mmol/L的R2A培養(yǎng)基，30 ℃、120 r/min下培養(yǎng)168 h，72 h和168 h各檢測1次，空白樣1中紅色不褪去，空白樣2中紅色不褪去，樣品紅色褪去，即該菌種具有砷還原功能（圖2）。

1.2.5菌株SM-T1的最適生長條件試驗(yàn)

1.2.5.1pH值對(duì)SM-T1生長的影響分別將As（Ⅲ）濃度為10 mmol/L的R2A培養(yǎng)基初始pH值調(diào)為5.0、6.0、70、8.0、9.0，接種SM-T1種子液，孢子濃度控制在 1×106個(gè)/mL，30 ℃、120 r/min條件下培養(yǎng)48 h，測定D值，確定細(xì)菌在不同pH值下的生長情況。

1.2.5.2溫度對(duì)SM-T1生長的影響將溫度分別設(shè)置為15、20、25、30、35 ℃，接種SM-T1種子液，孢子濃度 1×106個(gè)/mL，120 r/min下培養(yǎng)48 h，測定D值，確定細(xì)菌在不同溫度下的生長情況。

1.2.5.3不同砷濃度對(duì)SM-T1生長的影響在獲得最適pH值和最適溫度條件下，將As（Ⅲ）濃度設(shè)置為0、10、20、30 mmol/L，接種SM-T1種子液，孢子濃度1×106個(gè)/mL，120 r/min 條件下培養(yǎng)72 h，每隔4 h用分光光度計(jì)測定D值1次，確定細(xì)菌在不同濃度As（Ⅲ）條件下的生長曲線。

2結(jié)果與分析

2.1尾砂和水樣的化學(xué)分析結(jié)果

本研究共采集10個(gè)尾砂樣品和3個(gè)水樣，典型樣品的元素分析結(jié)果（表1）表明，尾礦SM-T-1和SM-T-6的砷含量極高，超過了質(zhì)量的30%，除Ca、Mg、Al外，2個(gè)樣品的其他金屬含量也均高于其他尾礦樣品；水樣SM-S-4的砷含量也達(dá)到了24.0%，除Ca、Mg外，主要金屬含量也均高于其他樣品。參照國標(biāo)GB 15618—1995《土壤環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》，所有樣品砷含量均達(dá)到重度污染程度。水樣分析表明，pH值為中性，砷含量嚴(yán)重超標(biāo)，達(dá)到30 mg/L以上。

2.2抗砷菌的富集培養(yǎng)、分離、純化和鑒定

經(jīng)過含AS（Ⅲ）濃度為10 mmol/L的抗砷培養(yǎng)基富集培養(yǎng)、相同濃度抗性平板篩選及多次劃線分離，所有樣品都分離得到了抗砷菌株，說明砷抗性菌在該環(huán)境中普遍存在。對(duì)分離獲得的13株細(xì)菌（均為好氧桿菌）進(jìn)行形態(tài)學(xué)和生理學(xué)鑒定，結(jié)合16S rDNA序列分析，初步鑒定這13株細(xì)菌為Pseudomonas otitidis和銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）。典型菌株的16S rDNA序列分析結(jié)果如圖3所示。

2.3菌株的抗砷試驗(yàn)

由表2可見，13個(gè)菌株都有很強(qiáng)的抗砷能力：除菌株 SM-S-7 外，其他菌株對(duì)As（Ⅲ）的抗性都超過40 mmol/L，對(duì)AS（Ⅴ）的抗性超過60 mmol/L。對(duì)砷抗性最強(qiáng)的是菌株SM-T1，其對(duì)As（Ⅲ）和As（Ⅴ）的抗性分別達(dá)到60 mmol/L和 100 mmol/L；As（Ⅲ）的毒性雖然比As（Ⅴ）的毒性要大得多，但是13個(gè)菌株對(duì)兩者的抵抗能力差異不大，這可能是菌株對(duì)砷發(fā)生氧化還原作用所致。

2.4抗砷菌對(duì)砷的氧化、還原作用

用高錳酸鉀法鑒定結(jié)果表明，大部分菌株對(duì)As（Ⅴ）有還原性，As（Ⅴ）被還原為As（Ⅲ）后，As（Ⅲ）對(duì)細(xì)胞的毒性更強(qiáng)，這可能也是這些菌株對(duì)As（Ⅲ）和As（Ⅴ）耐受能力差別不大的原因。

2.5菌株SM-T1最適生長條件

3小結(jié)與討論

通過在湖南石門璜礦采集含砷尾砂樣品和水樣，在實(shí)驗(yàn)室利用選擇性培養(yǎng)基富集培養(yǎng)和分離，獲得13株對(duì)砷有抗性的菌株；對(duì)菌株的鑒定表明，它們屬于Pseudomonas otitidis和銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）。對(duì)砷的抗性試驗(yàn)表

明，13個(gè)菌株均能在較高濃度的砷培養(yǎng)液中生存，主要通過還原砷達(dá)到對(duì)砷的高抗性作用，其中，菌株SM-T1對(duì)As（Ⅲ）和As（Ⅴ）的抗性分別達(dá)到了60 mmol/L和100 mmol/L。

對(duì)典型抗性菌株SM-T1研究表明，菌株SM-T1能在pH值5.0～9.0、溫度15～35 ℃范圍內(nèi)生長，最適生長pH值為7.0～8.0、最適生長溫度為20 ℃。在砷濃度未達(dá)到致死濃度時(shí)，砷濃度對(duì)SM-T1生長影響較大，對(duì)其最終的生長狀況影響較小，細(xì)菌可以進(jìn)行正常旺盛的細(xì)胞分裂。這為進(jìn)一步利用砷抗性菌開展含砷環(huán)境的生物修復(fù)奠定了良好基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1]Cullen W R，Reimer K J. Arsenic speciation in the environment[J]. Chemical Review，1989，89（4）：713-764.

[2]Chen M，Ma L Q，Harris W G. Arsenic concentrations in florida surface soils：influence of soil type and properties[J]. Soil Sci Soc J，2002，66：632-640.

[3]王薇，徐炎華. 水體中砷污染和治理概況[J]. 微量元素與健康研究，2005，22（5）：59-61.

[4]Gomez-Caminero A，Howe P，Hughes M，et al. Environmental health criteria 224 arsenic and arsenic compounds[R]. Geneva：World Health Organization，2001.

[5]Turpeinen R，Pantsar-Kallio M，Hggblom M，et al. Influence of microbes on the mobilization，toxicity and biomethylation of arsenic in soil[J]. Science of the Total Environment，1999，236（1/3）：173-180.

[6]Silver S，Phung L T. Genes and enzymes involved in bacterial oxidation and reduction of inorganic arsenic[J]. Applied and Environmental Microbiology，2005，71（2）：599-608.

[7]Kashyap D R，Botero L M，F(xiàn)ranck W L，et al. Complex regulation of arsenite oxidation in Agrobacterium tumefaciens[J]. Journal of Bacteriology，2006，188（3）：1081-1088.

[8]Han F X，Su Y，Monts D L，et al. Assessment of global industrial-age anthropogenic arsenic contamination[J]. Naturwissenschaften，2003，90（9）：395-401.

[9]孫青，邢輝，何斌，等. 安徽銅陵獅子山硫化物礦山酸礦水中微生物功能群的研究[J]. 巖石礦物學(xué)雜志，2009，28（6）：547-552.

[10]東秀珠，蔡妙英. 常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊[M]. 北京：科學(xué)出版社，2001：370-398.endprint