申貴雋，熊 迪

（大連大學(xué) 環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，遼寧 大連 116622）

0 引言

L-酪氨酸是人體不能合成的芳香族氨基酸，為非必需氨基酸。在醫(yī)藥領(lǐng)域，L-酪氨酸是合成各種物質(zhì)的前體原料，如甲狀腺素、腎上腺素、左旋多巴和酪氨酸亞硫酸鹽等[1]；在臨床上，酪氨酸亞硫酸鹽用于治療各種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病骨髓灰質(zhì)炎，如結(jié)核性腦膜炎的急性期、神經(jīng)分裂癥、無(wú)力綜合征以及老年性精神病等[2]。目前，檢測(cè)L-酪氨酸的含量方法主要有色譜法、流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法、極譜法、毛細(xì)管電泳法和光度法等[3-5]，這些檢測(cè)方法消耗時(shí)間長(zhǎng)、程序繁瑣、所需費(fèi)用高且容易被污染，因此建立一種快速、高效且價(jià)廉的分離檢測(cè)L-酪氨酸的方法具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

分子印跡技術(shù)起源于以抗原合成抗體的研究理論[15]，并經(jīng)過(guò)一定時(shí)間的思想萌芽[16,17]。在1972 年，德國(guó)Wulff 研究組提出了分子印跡聚合物的概念[18]，代表著分子印跡理論的正式提出。而1993 年George等[19]報(bào)道了分子印跡聚合物的研究，極大的推動(dòng)了分子印跡技術(shù)的發(fā)展。分子印跡聚合物的高選擇性與穩(wěn)定性等特殊性質(zhì)，使得分子印跡技術(shù)在色譜分離、固相萃取、仿生傳感器、模擬酶催化和膜分離等諸多領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[8-12]。近年來(lái)，將分子印跡技術(shù)應(yīng)用于傳感器識(shí)別元件[9,13]，利用分子印跡敏感膜的特異識(shí)別性與電化學(xué)傳感器的導(dǎo)高靈敏度相結(jié)合成為國(guó)內(nèi)外研究熱點(diǎn)之一。

電化學(xué)聚合方法可制備具有特異識(shí)別性的聚合物薄膜[9,14]，通過(guò)改變聚合電位和聚合緩沖液組分等條件實(shí)現(xiàn)聚合過(guò)程的控制，從而獲得不同厚度、不同電性能的聚合物膜。為此，本文利用鄰苯二胺通過(guò)電化學(xué)聚合制備對(duì)L-酪氨酸具有特異識(shí)別性的分子印跡傳感器敏感膜，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)L-酪氨酸的快速檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

鄰苯二胺（o-PD)、鐵氰化鉀和氯酸鉀；氮?dú)猓兌?99.5%）；L-苯丙氨酸（L-Phe)、L-丙氨酸（L-Ala)、L-色氨酸（L-Trp)和L-天冬氨酸（L-Asp)均為生物純；實(shí)驗(yàn)用水均為二次蒸餾水，其它試劑均為分析純。

CV 法和DPV 法測(cè)試均在CS300 工作站（上海辰華儀器公司）上進(jìn)行，EIS 法測(cè)試在CHI660D 工作站（上海辰華儀器公司）采用三電極體系：金電極為工作電極，鈦絲電極為輔助電極，飽和甘汞電極為參比電極。

1.2 金電極的預(yù)處理

如圖1，將金電極在砂紙上打磨后在均勻鹿皮上拋光（用0.05 μm 的氧化鋁粉）之后，浸入熱混合溶液[V(濃硫酸）:V(30%H2O2)=3:1]中清洗10 min。取出電極用去離子水沖洗，依次分別在去離子水、硝酸（1:1）、無(wú)水乙醇、去離子水中清洗5 min，然后在0.5 mol/L 硫酸溶液中與-1~1 V 進(jìn)行循環(huán)伏安(CV)電化學(xué)處理，直到獲得穩(wěn)定的循環(huán)伏安電流響應(yīng)。再將金電極放入 10 mol/L KCLO3和 10 mmol/L K3[Fe(CN)6]的混合液（混合比例1:1）中，于-0.6~0.4 V 分別用CV 法、DPV 法檢驗(yàn)電極活性，所有操作均在室溫下進(jìn)行。

圖1 0.5 mol/L 硫酸溶液中活化裸金電極

1.3 分子印跡敏感膜的制備

將4 mmol/L 的 L-酪氨酸和10 mmol/L 的鄰苯二胺混合液（比例1:1）溶液通氮?dú)獬?0 min 自組裝4 h，在-1~1 V 電位范圍內(nèi)并設(shè)置掃描速度為50 mV/s，運(yùn)用CV 法掃描50 圈，在磷酸緩沖溶液（pH=8.0）中使鄰苯二胺電聚合成膜。取出電極，用去離子水沖洗,放入10 mmol/L K3[Fe(CN)6]和10 mmol/L KCLO3的混合液中，于-0.6~0.4 V 分別用CV 法、DPV 法檢測(cè)電極；取出電極后，先用去離子水沖洗，然后再用V（甲醇）：V（乙酸）=9:1 的洗脫液洗脫模板分子L-酪氨酸。以上所有實(shí)驗(yàn)均在室溫下進(jìn)行。

1.4 分子印跡敏感膜的性能表征

將分子印跡敏感膜修飾電極（即印跡電極）浸入含有10 mmol/L KCLO3和10 mmol/L K3[Fe(CN)6]的支持電解質(zhì)溶液中，采用循環(huán)伏安（CV)法，示差脈沖（DPV）法、電化學(xué)阻抗譜（EIS)法對(duì)其進(jìn)行性能測(cè)試。循環(huán)伏安（CV）法設(shè)置電位范圍為-1.2~0.8 V，掃描速度為50 mV/s；示差脈沖（DPV）法設(shè)置電位范圍為-1.2~0.8 V；阻抗（EIS）法設(shè)置的頻率范圍為1.0×10-2~1.0×106Hz。

2 結(jié)果與討論

2.1 分子印跡敏感膜的制備

由圖2CV 曲線形狀可知，模板分子L-酪氨酸存在時(shí)金電極上o-PD 電聚合過(guò)程是一個(gè)完全不可逆過(guò)程，掃描的第一圈CV 圖中于-0.25 V 處有明顯的氧化峰，第二圈峰電流隨著掃描圈數(shù)數(shù)增多而明顯降低，掃描三圈后氧化峰相比較前兩圈明顯減弱，掃描五圈后氧化峰基本消失，處于相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)，而L-酪氨酸在所選范圍內(nèi)并無(wú)電活性，說(shuō)明在金電極表面發(fā)生了聚合反應(yīng)，生成了致密的且包含了L-酪氨酸分子的o-PD 聚合物低導(dǎo)電性膜，即分子印跡敏感膜。

圖2 金電極電聚合過(guò)程循環(huán)伏安圖

2.2 分子印跡敏感膜表面的電化學(xué)性質(zhì)

由圖3 可知，a 表示電聚合后，由于電極表面形成的聚鄰苯二胺膜不具有導(dǎo)電性，[Fe(CN)6]4-/3-不能透過(guò)聚合物膜直接與金電極發(fā)生氧化還原反應(yīng)，所以峰電流很?。籦 表示在電聚合之前[Fe(CN)6]4-/3-容易達(dá)到裸金電極表面發(fā)生反應(yīng)；c 表示將模板分子L-酪氨酸從鄰苯二胺分子印跡膜上洗脫之后，在聚合物膜內(nèi)形成了與L-酪氨酸分子的大小和形狀相同的印跡穴孔，這些穴孔能允許[Fe(CN)6]4-/3-與電極表面接觸，達(dá)到電極表面并進(jìn)行氧化還原反應(yīng)，在圖中能觀察到有可逆的[Fe(CN)6]4-/3-還原峰。配制一定濃度L-酪氨酸溶液（pH=8.0 的磷酸緩沖溶液環(huán)境下）與印跡聚合物膜與再次發(fā)生電化學(xué)反應(yīng)，L-酪氨酸分子不斷被印跡孔穴識(shí)別，填補(bǔ)大小和形狀相同的孔穴，導(dǎo)致[Fe(CN)6]4-/3-的傳質(zhì)過(guò)程再次受到阻礙，不能直接與金電極表面接觸而使導(dǎo)電性減弱，其氧化還原電流強(qiáng)度顯著減弱，可逆性變差。

圖3 金電極聚合前后變化循環(huán)伏安圖 （a）裸金電極，（b）非印跡電極，（c）印跡電極

由圖4 是以K3[Fe(CN)6]為探針，KCLO3 為支持電解質(zhì)，測(cè)試了分子印跡敏感膜修飾電極的交流阻抗圖，其中的a 和b 代表裸金電極的阻抗，裸金電極的阻抗譜基本成線性，表明[Fe(CN)6]4-/3-容易到達(dá)裸金電極表面發(fā)生反應(yīng)，在裸金電極表面不存在阻擋電子傳輸?shù)奈镔|(zhì)；c 表示金電極表面已聚合印跡膜且模板分子未洗脫的電極，e 和d 表示洗脫后的分子印跡傳感器敏感膜在4 mmol/L 的L-酪氨酸溶液中吸附L-酪氨酸后，其阻抗值有明顯變化，說(shuō)明分子印跡電極對(duì)L-酪氨酸分子有特異性識(shí)別作用。

圖4 金電極聚合前后變化阻抗圖 （a）裸金電極和，(b)非印跡電極，（c）印跡電極

圖5 可知，適用DPV 法檢測(cè)分子印跡傳感膜的化學(xué)性質(zhì)，曲線分別abc 是裸金電極、已聚合印跡膜且模板分子未洗脫的電極和洗脫后模板分子之后的分子印跡膜在鐵氰化鉀和氯酸鉀混合溶液中進(jìn)行DPV 法掃描圖，從圖可以看出，a 裸金電極在鐵氰化鉀溶液中的DPV 圖線出現(xiàn)較大峰電流值，在聚合上包含模板的分子印跡膜之后，峰電流值減小幾乎呈線性，當(dāng)洗脫模板分子之后，出現(xiàn)峰值，說(shuō)明電聚合后，金電極上形成了不導(dǎo)電的聚鄰苯二胺膜，鄰苯二胺膜不與鐵氰化鉀發(fā)生反應(yīng)，電流很小，洗脫模板分子后，鐵氰化鉀離子可以通過(guò)電極表面形成的孔穴與電極表面發(fā)生氧化還原反應(yīng)。

圖5 金電極聚合前后示差脈沖圖 （a）裸金電極，（b）非印跡電極，（c）印跡電極

2.3 分子印跡敏感膜的選擇性檢測(cè)

考察分子印跡傳感器敏感膜對(duì)L-酪氨酸分子及干擾物的電化學(xué)影響，選擇與L-酪氨酸結(jié)構(gòu)相似的L-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-天冬氨酸等幾種氨基酸作為干擾物，對(duì)分子印跡敏感膜的選擇性進(jìn)行檢測(cè)，使用的方法為示差脈沖法（DPV）。如圖6：

圖6 印跡電極L-酪氨酸及干擾物的反應(yīng)

由圖6 可知，分子印跡膜修飾電極對(duì)L-色氨酸、L-天冬氨酸、L-苯丙氨酸的電流響應(yīng)很小，說(shuō)明這些干擾物與分子印跡膜上的印跡孔穴大小和形狀不匹配，不能完全封閉穴孔，鐵氰化鉀能通過(guò)孔穴縫隙與金電極表面接觸而不受阻礙，而印跡膜對(duì)L-酪氨酸的電流響應(yīng)較大。這說(shuō)明印跡膜對(duì)L-酪氨酸具有特異識(shí)別性。

2.4 印跡電極對(duì)L-酪氨酸的響應(yīng)性及應(yīng)用

配制不同濃度的L-酪氨酸的背景溶液，采用示差脈沖法（DPV）法檢測(cè)了[Fe(CN)6]4-/3-氧化峰隨L-酪氨酸濃度的變化，如圖6 可知，分別以L-酪氨酸的濃度對(duì)數(shù)和峰電流做標(biāo)準(zhǔn)曲線，在 1×10-2~2.0 mg/mL 的濃度范圍內(nèi)峰電流隨L-酪氨酸濃度的增加呈線性下降，線性回歸方程為：

I=-3.5×10-6logCL-Tyr+6.2×10-6

相關(guān)系數(shù)為0.9917。配制樣品進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)得樣品峰電流值為8.7428×10-6A，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算得到對(duì)應(yīng)的樣品濃度為0.1992 mg/mL。

2.5 分子印跡傳感器敏感膜電極的重現(xiàn)性

用制備的同一支分子印跡傳感器敏感膜電極，采用示差脈沖法（DPV）法對(duì)6 個(gè)濃度為0.2 mg/mL 的L-酪氨酸背景溶液進(jìn)行連續(xù)平行測(cè)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 印跡膜修飾電極重現(xiàn)性

由表1 得知，對(duì)濃度為0.2 mg/mL 的6 個(gè)L-酪氨酸對(duì)照溶液進(jìn)行檢測(cè)，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.2%。

2.6 分子印跡傳感器敏感膜的使用壽命

將印跡電極儲(chǔ)存一周，電流響應(yīng)值達(dá)到初始響應(yīng)值的90%，一個(gè)月后電流響應(yīng)值達(dá)到75%，說(shuō)明該印跡電極使用壽命較長(zhǎng)。鑒于該印跡電極在對(duì)L-酪氨酸的分析研究中已經(jīng)取得了令人滿意的結(jié)果，因此該印跡傳感器有望應(yīng)用于食品，藥品中L-酪氨酸的檢測(cè)。

[1] 劉學(xué)良, 劉鶯, 王俊德, 等. 分子烙印技術(shù)的應(yīng)用與最新進(jìn)展[J]. 分析化學(xué), 2002, 30(10): 1260-1266.

[2] 李秀華, 王自瑛, 王后方. L-酪氨的合成研究[J]. 科技信息, 2007(33): 343.

[3] 王穎, 李楠. 分子印跡技術(shù)及其應(yīng)用[J]. 化工進(jìn)展, 2010, 29(12): 2315-2323.

[4] 宮倩倩, 曹玉華、, 王陽(yáng), 等. 吲哚-3-乙酸分子印跡聚合物膜電化學(xué)傳感器的研制[J]. 分析科學(xué)學(xué)報(bào), 2011, 27(5): 556-560.

[5] 遲大民, 蘇立強(qiáng), 鄧茜珊, 等. 分子印跡功能單體選擇方法研究進(jìn)展[J]. 化工時(shí)刊, 2009, 23(12): 55-57.

[6] 隋紅艷, 李紅旗, 沈忠耀. 分子印跡技術(shù)手性分離氨基酸衍生物(I)-分子印跡聚合物的制備、色譜評(píng)價(jià)及物理化學(xué)表征[J]. 精細(xì)化工, 2002, 20(6): 345-348.

[7] 高寶平, 李婧, 郭滿棟. 白藜蘆醇分子印跡傳感器的制備及應(yīng)用[J]. 分析科學(xué)學(xué)報(bào), 2011, 27(2): 162-166.

[8] Caro E, Marcé R M, Borrull F, et al. Application of molecularly imprinted polymers to solid-phase extraction of compounds from environmental and biological samples [J]. TrAC Trends in Analytical Chemistry, 2006, 25(2): 143-154.

[9] 徐雯, 李曉, 張衛(wèi)英, 等. L-色氨酸分子印跡敏感膜的制備與性能[J]. 高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào), 2012(10): 2199-2204.

[10] Dai J, Pan J, Xu L, et al. Preparation of molecularly imprinted nanoparticles with superparamagnetic susceptibi- lity through atom transfer radical emulsion polymerization for the selective recognition of tetracycline from aqueous medium [J]. Journal of hazardous materials, 2012, 205: 179- 188.

[11] Qiao F, Du J. Rapid screening of clenbuterol hydrochloride in chicken samples by molecularly imprinted matrix solid- phase dispersion coupled with liquid chromatography [J]. Journal of Chromatography B, 2013, 923: 136-140.

[12] 賴家平, 何錫文, 郭洪生, 等. 分子印跡技術(shù)回顧、現(xiàn)狀與展望[J]. 分析化學(xué)研究報(bào)告, 2001(7): 836-844.

[13] Hu Y, Zhang Z, Zhang H, et al. Sensitive and selective imprinted electrochemical sensor for p-nitrophenol based on ZnO nanoparticles/carbon nanotubes doped chitosan film [J]. Thin Solid Films, 2012, 520(16): 5314-5321.

[14] Li Y, Yang T, Qi X, et al. Development of a group selective molecularly imprinted polymers based solid phase extraction of malachite green from fish water and fish feed samples [J]. Analytica Chimicacta, 2008, 624(2): 317-325.

[15] Pauling L. A theory of the structure and process of formation of antibodies [J]. Journal of the American Chemical Society, 1940, 62(10): 2643-2657.

[16] Dickey F H. The preseparation of specific adsorbents [J]. P Natl Acad Sci USA, 1949, 35(5): 227-229.

[17] Dickey F H. Specific adsorption [J]. The Journal of Physical Chemistry, 1955, 59(8): 695-707.

[18] Wulff G, Sarhan A, Zabrocki K. Enzyme-analogue built polymers and their use for the resolution of racemates [J]. Tetrahedron Letters, 1973, 14(44): 4329-4332.

[19] Vlatakis G, Andersson L I, Müller R, et al. Drug assay using antibody mimics made by molecular imprinting [J]. Nature, 1993, 361(6413): 645-647.