張文麗+詹宇豪+沈俊明等

【摘要】 目的：明確針刺對(duì)慢性腦缺血的腦皮質(zhì)區(qū)自由基相關(guān)指標(biāo)影響及其機(jī)制。方法：將實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為正常、慢性腦缺血（IR）和針刺組，對(duì)比觀察各組動(dòng)物慢性腦缺血5周時(shí)腦皮質(zhì)病理變化及超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、活性氧（reactive oxygen species，ROS）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、黃嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XOD）含量的影響。結(jié)果：IR組SOD 值較正常組顯著降低，針刺組的SOD活性表達(dá)明顯高于IR組，ROS、XOD活性低于IR組，而MDA的活性明顯低于IR組（P<0.05或P<0.01）。結(jié)論：針刺對(duì)慢性腦缺血有一定保護(hù)作用，此作用機(jī)制可能是針刺通過(guò)清除自由基，降低脂質(zhì)過(guò)氧化應(yīng)激而保護(hù)慢性腦缺血的神經(jīng)功能損傷。

【關(guān)鍵詞】 針刺； 自由基； 慢性腦缺血

慢性腦缺血表現(xiàn)為頭痛、頭暈、失眠、記憶力減退、健忘等癥狀，是臨床常見(jiàn)病、多發(fā)病之一；近年來(lái)呈逐年上升并有年輕化的趨勢(shì)，嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量。在人類(lèi)對(duì)抗腦血管疾病的歷史進(jìn)程中，針刺發(fā)揮了非常重要作用，為中華民族的醫(yī)療衛(wèi)生做出了不可磨滅的貢獻(xiàn)，是中國(guó)腦血管病防治的特色所在[1-3]。現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)針刺能不同程度提高腦耐缺血缺氧能力，而且對(duì)慢性腦缺血多偏重于臨床治療觀察[4-5]，本文從基礎(chǔ)研究入手旨在探討針刺對(duì)慢性腦缺血腦皮質(zhì)區(qū)自由基相關(guān)指標(biāo)影響及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 30只Wistar 健康雄性大鼠體重250～320 g；購(gòu)于北京維通利華公司。SOD、ROS、MDA、XOD試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.2 動(dòng)物分組 動(dòng)物隨機(jī)分成正常組、慢性腦缺血組（IR）、針刺組，每組10只；針刺組于第一次腦缺血后2 h內(nèi)立即針刺，以后每日一次針刺大椎、百會(huì)穴30 min。各組均常規(guī)飼養(yǎng)。

1.3 模型制備 通過(guò)兩血管法即雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎建立腦缺血模型，模型大鼠在1周內(nèi)分2次結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈（分別在第1天和第7天）。術(shù)前禁食12 h、禁水4 h。仰臥位，10%水合氯醛0.3 mL/100 g腹腔注射麻醉，頸部消毒后正中切開(kāi)，鈍性分離出一側(cè)迷走神經(jīng)與頸總動(dòng)脈，用4號(hào)絲線雙重結(jié)扎一側(cè)頸總動(dòng)脈，縫合時(shí)切口內(nèi)注慶大霉素注射液4萬(wàn)單位預(yù)防感染。該側(cè)結(jié)扎后間隔7 d行第二次手術(shù)，同法結(jié)扎該側(cè)頸總動(dòng)脈。大鼠術(shù)后放保溫毯上使其肛溫保持在36.5～37.0 ℃至蘇醒。制作模型過(guò)程中未有死亡動(dòng)物。

1.4 針刺方法 針刺參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》中大鼠的常用針灸穴位定位方法，自制針刺鼠裝置；選取“百會(huì)、大椎”?！鞍贂?huì)”穴在頂骨正中，“大椎”穴在背部正中第7頸椎與第1胸椎間。刺法：以30號(hào)1寸毫針（天協(xié)牌，蘇州天協(xié)針灸器械有限公司生產(chǎn)）向前斜刺入“百會(huì)”5 mm，直刺入“大椎”5 mm。捻轉(zhuǎn)1 min后，留針30 min，每隔5分鐘捻針一次。每天1次，均在上午10點(diǎn)左右進(jìn)行，連續(xù)治療5周。針刺組大鼠于末次進(jìn)針后4 h內(nèi)用10%水合氯醛腹腔麻醉后迅速斷頭取腦。

1.5 腦皮質(zhì)病理變化 取額葉皮質(zhì)多聚甲醛內(nèi)固定，然后進(jìn)行HE染色觀察病理變化。

1.6 腦皮質(zhì)自由基相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定 取解凍后腦皮質(zhì)，用天平稱(chēng)重，按照1：9 w/v加入生理鹽水，組織在水浴中勻漿，低溫離心機(jī)中離心10 min取上清液（2000 r/min），采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定腦組織超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力；硫代巴比妥酸法測(cè)定腦丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量?；钚匝酰╮eactive oxygen species，ROS）、黃嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XOD）活力含量測(cè)定采用比色法。具體操作按照南京建成生物工程研究所提供的試劑盒內(nèi)操作指南進(jìn)行。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 11.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以（x±s）表示，采用方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腦皮質(zhì)區(qū)病理學(xué)改變 正常組額葉皮層細(xì)胞結(jié)構(gòu)排列整齊，皮層神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞正常。IR組時(shí)額葉皮層細(xì)胞固縮、壞死，小血管水腫明顯、有的管腔出現(xiàn)閉塞；神經(jīng)元變性壞死，數(shù)量明顯減少，排列稀疏，錐體細(xì)胞層變薄，核變淺，基質(zhì)疏松及空泡形成。針刺組額葉皮層，神經(jīng)元細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本正常，出現(xiàn)少量錐體細(xì)胞脫失，部分錐體細(xì)胞缺血明顯改善，可見(jiàn)膠質(zhì)細(xì)胞和小血管增生。

2.2 各組大鼠腦組織ROS、MDA、XOD、SOD的變化 如表1所示，與正常組比較，慢性腦缺血組SOD 值顯著降低（P<0.05）， 而ROS、XOD、MDA均顯著升高（P<0.01）。與IR 組比較，針刺組SOD 顯著升高（P<0.05），ROS、XOD、MDA均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。

3 討論

慢性腦缺血是通過(guò)各種原因引起長(zhǎng)期的腦灌注不足，腦發(fā)生組織病理改變，國(guó)內(nèi)外大量研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)腦梗死和老年癡呆癥的發(fā)病前期都曾有長(zhǎng)期慢性腦缺血的存在[6]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)1周內(nèi)分2次手術(shù)進(jìn)行永久性結(jié)扎大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈，制備慢性腦缺血的動(dòng)物模型，這種方法實(shí)質(zhì)上是以慢性低灌注引起腦缺血缺氧，最終導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的功能下降、學(xué)習(xí)記憶功能障礙。此模型能較好地模擬人類(lèi)因動(dòng)脈管腔狹窄、動(dòng)脈粥樣硬化等因素導(dǎo)致的血管性腦卒中。有人認(rèn)為大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎后2.5 h腦血流量減少25%～90%，1周后仍下降并持續(xù)數(shù)月。且結(jié)扎1周皮層葡萄糖利用下降20%～30%，海馬葡萄糖利用下降15%。雙側(cè)頸總動(dòng)脈術(shù)后3周即為慢性缺血期[7]。氧化應(yīng)激損傷被認(rèn)為是引起慢性腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞損傷的重要因素之一。神經(jīng)細(xì)胞對(duì)氧自由基極為敏感，產(chǎn)生一系列自由基連鎖反應(yīng)，攻擊灰質(zhì)的神經(jīng)元等富含脂質(zhì)的腦組織，造成嚴(yán)重的氧化應(yīng)激狀態(tài)，誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡，并使初始缺血損傷不嚴(yán)重的神經(jīng)元也發(fā)生壞死[8]。endprint

根據(jù)傳統(tǒng)理論，針刺可以疏通經(jīng)絡(luò)，調(diào)和氣血，治療疾病。其治療機(jī)理也越來(lái)越成為研究的熱點(diǎn)。Tanaka等[9]發(fā)現(xiàn)雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)后1 d至6周，SOD活性較對(duì)照組下降明顯；其他實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)電針能降低大鼠腦組織內(nèi)MDA含量， 增強(qiáng)SOD活性[10-11]。這與筆者的部分結(jié)果相一致。在慢性腦缺血過(guò)程中，自由基直接攻擊生物膜中的不飽和脂肪酸，使其發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，從而導(dǎo)致神經(jīng)元的損傷[8]。MDA作為氧自由基與生物膜不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的代謝產(chǎn)物，其含量的變化間接的反應(yīng)了腦組織中氧自由基含量的變化。SOD對(duì)機(jī)體的氧化與抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用，是機(jī)體清除氧自由基、防止生成羥自由基、阻斷自由基病理性連鎖反應(yīng)最重要的防御酶，保護(hù)細(xì)胞免受損傷。XOD屬需氧脫氫酶類(lèi)，是體內(nèi)核酸代謝中的重要酶。并且在缺氧過(guò)程中其對(duì)自由基的產(chǎn)生起了重要作用。ROS通過(guò)細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡甚至導(dǎo)致其壞死。本研究結(jié)果顯示，針刺后腦組織中ROS、MDA 和XOD 水平降低，而抗氧化酶SOD活性升高，說(shuō)明針刺減輕慢性腦缺血的損傷與其抗氧化作用有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)研究顯示針刺可以改善慢性腦缺血大鼠額葉皮層神經(jīng)細(xì)胞、錐體細(xì)胞變性、壞死，血管水腫等不可逆的病理生理?yè)p傷，其一系列變化與氧化應(yīng)激密切相關(guān)。因此針刺可以挽救瀕死的神經(jīng)元、啟動(dòng)應(yīng)激機(jī)制、防止腦細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化、減輕自由基對(duì)機(jī)體的損傷。但較多環(huán)節(jié)較多靶點(diǎn)的參與機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究。

參考文獻(xiàn)

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（收稿日期：2014-03-04） （本文編輯：陳丹云）endprint

根據(jù)傳統(tǒng)理論，針刺可以疏通經(jīng)絡(luò)，調(diào)和氣血，治療疾病。其治療機(jī)理也越來(lái)越成為研究的熱點(diǎn)。Tanaka等[9]發(fā)現(xiàn)雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)后1 d至6周，SOD活性較對(duì)照組下降明顯；其他實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)電針能降低大鼠腦組織內(nèi)MDA含量， 增強(qiáng)SOD活性[10-11]。這與筆者的部分結(jié)果相一致。在慢性腦缺血過(guò)程中，自由基直接攻擊生物膜中的不飽和脂肪酸，使其發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，從而導(dǎo)致神經(jīng)元的損傷[8]。MDA作為氧自由基與生物膜不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的代謝產(chǎn)物，其含量的變化間接的反應(yīng)了腦組織中氧自由基含量的變化。SOD對(duì)機(jī)體的氧化與抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用，是機(jī)體清除氧自由基、防止生成羥自由基、阻斷自由基病理性連鎖反應(yīng)最重要的防御酶，保護(hù)細(xì)胞免受損傷。XOD屬需氧脫氫酶類(lèi)，是體內(nèi)核酸代謝中的重要酶。并且在缺氧過(guò)程中其對(duì)自由基的產(chǎn)生起了重要作用。ROS通過(guò)細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡甚至導(dǎo)致其壞死。本研究結(jié)果顯示，針刺后腦組織中ROS、MDA 和XOD 水平降低，而抗氧化酶SOD活性升高，說(shuō)明針刺減輕慢性腦缺血的損傷與其抗氧化作用有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)研究顯示針刺可以改善慢性腦缺血大鼠額葉皮層神經(jīng)細(xì)胞、錐體細(xì)胞變性、壞死，血管水腫等不可逆的病理生理?yè)p傷，其一系列變化與氧化應(yīng)激密切相關(guān)。因此針刺可以挽救瀕死的神經(jīng)元、啟動(dòng)應(yīng)激機(jī)制、防止腦細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化、減輕自由基對(duì)機(jī)體的損傷。但較多環(huán)節(jié)較多靶點(diǎn)的參與機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究。

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[11] Gan Y，Huang G，Zhang M.Effect of acupuncture on neuronal apoptosis after focal cerebral ischemic reperfusion Injury in Rats[J].World Journal of Acupuncture-Moxibustion，2007，17（3）：13-16.

（收稿日期：2014-03-04） （本文編輯：陳丹云）endprint

根據(jù)傳統(tǒng)理論，針刺可以疏通經(jīng)絡(luò)，調(diào)和氣血，治療疾病。其治療機(jī)理也越來(lái)越成為研究的熱點(diǎn)。Tanaka等[9]發(fā)現(xiàn)雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)后1 d至6周，SOD活性較對(duì)照組下降明顯；其他實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)電針能降低大鼠腦組織內(nèi)MDA含量， 增強(qiáng)SOD活性[10-11]。這與筆者的部分結(jié)果相一致。在慢性腦缺血過(guò)程中，自由基直接攻擊生物膜中的不飽和脂肪酸，使其發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，從而導(dǎo)致神經(jīng)元的損傷[8]。MDA作為氧自由基與生物膜不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的代謝產(chǎn)物，其含量的變化間接的反應(yīng)了腦組織中氧自由基含量的變化。SOD對(duì)機(jī)體的氧化與抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用，是機(jī)體清除氧自由基、防止生成羥自由基、阻斷自由基病理性連鎖反應(yīng)最重要的防御酶，保護(hù)細(xì)胞免受損傷。XOD屬需氧脫氫酶類(lèi)，是體內(nèi)核酸代謝中的重要酶。并且在缺氧過(guò)程中其對(duì)自由基的產(chǎn)生起了重要作用。ROS通過(guò)細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡甚至導(dǎo)致其壞死。本研究結(jié)果顯示，針刺后腦組織中ROS、MDA 和XOD 水平降低，而抗氧化酶SOD活性升高，說(shuō)明針刺減輕慢性腦缺血的損傷與其抗氧化作用有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)研究顯示針刺可以改善慢性腦缺血大鼠額葉皮層神經(jīng)細(xì)胞、錐體細(xì)胞變性、壞死，血管水腫等不可逆的病理生理?yè)p傷，其一系列變化與氧化應(yīng)激密切相關(guān)。因此針刺可以挽救瀕死的神經(jīng)元、啟動(dòng)應(yīng)激機(jī)制、防止腦細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化、減輕自由基對(duì)機(jī)體的損傷。但較多環(huán)節(jié)較多靶點(diǎn)的參與機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究。

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[10] 張?zhí)焐?，楊露，胡榮，等.不同時(shí)程電針對(duì)大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞再灌注區(qū)腦組織興奮性氨基酸含量的影響[J].針刺研究，2007，32（4）：234-236.

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（收稿日期：2014-03-04） （本文編輯：陳丹云）endprint