付換成+盧秋麗+劉浩+張文秋+趙云

【摘要】 目的：分析CH225在非還原電泳時(shí)抗體條帶主條帶以外在高分子量和低分子量產(chǎn)生雜條帶的原因。方法：在不同的供試品緩沖液和不同電泳條件下進(jìn)行SDS-PAGE電泳比較。結(jié)果：上樣前100 ℃煮樣1 min與加碘乙酰胺結(jié)果相同。結(jié)論：高分子量和低分子量雜條帶可以用電泳上樣前100 ℃煮樣1 min消除即可。

【關(guān)鍵詞】 非還原SDS-PAGE； 重組單抗； EGFR； 重組抗人表皮生長(zhǎng)因子受體

藥品生產(chǎn)過程中，重組蛋白類藥物的質(zhì)量檢測(cè)和控制十分重要，SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝膠電泳）是蛋白類藥物的純度分析的常用手段[1-2]。CH225（重組抗人表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）嵌合單克隆抗體）是四川恒星生物制藥有限公司采用基因工程技術(shù)，利用NS/0細(xì)胞表達(dá)的人源化抗體，屬于IgG1亞型，已用于轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌、頭頸癌等多種癌癥的治療，并且現(xiàn)有研究表明可能適用于鼻咽癌、肺癌等其他癌癥的治療[3-4]。在CH225的臨床前研發(fā)，質(zhì)量檢測(cè)的過程中發(fā)現(xiàn)，除抗體主條帶以外，還存在一些分子量大小不同的雜條帶，特別在非還原性實(shí)驗(yàn)中，情況尤為明顯。本文采用不同溫度和不同試劑的條件下對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理，比較最佳的SDS-PAGE結(jié)果，為CH225批量生產(chǎn)的質(zhì)量檢測(cè)和控制提供參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品 參比品（批號(hào)C201105002）：四川恒星生物制藥有限公司于2011年5月第2批生產(chǎn)的CH225注射液；對(duì)照品（批號(hào)C201107006）：四川恒星生物制藥有限公司于2011年7月第6批生產(chǎn)的CH225注射液；愛比妥（Erbitux）：通用名西妥昔單抗（cetuximab），默克公司生產(chǎn)。

1.2 主要試劑和儀器 SDS-PAGE電泳裝置和掃描儀為Bio-Rad公司產(chǎn)品；水為超純水，其余試劑均為分析純。

1.3 緩沖液的配制 還原型SDS-PAGE供試品緩沖液（2×）：0.12 mol/L Tris-HCl，20%甘油，0.1%溴酚藍(lán)，4% SDS，200 mmol/L DTT；非還原型SDS-PAGE供試品緩沖液（2×）：0.12 mol/L Tris-HCl，20%甘油，0.1%溴酚藍(lán)，4% SDS；天然供試品緩沖液（2×）：0.12 mol/L Tris-HCl，20%甘油，0.1%溴酚藍(lán)；加碘乙酰胺的非還原SDS-PAGE供試品緩沖液（2×）：向上述非還原SDS-PAGE供試品緩沖液中加入新鮮配制的1 mol/L碘乙酰胺母液，至終濃度為200 mmol/L。

1.4 實(shí)驗(yàn)過程

1.4.1 70 ℃與100 ℃水浴非還原SDS-PAGE分析 C201105002（參比品）、稀釋至2 mg/mL與2×非還原SDS-PAGE供試品緩沖液等體積混合，70 ℃分別水浴1、3、5 min后，立即轉(zhuǎn)入冰浴。另取相同樣品加入與2×非還原SDS-PAGE供試品緩沖液等體積混合，100 ℃分別水浴1、3、5 min，立即轉(zhuǎn)入冰浴。再取相同樣品加入2×非還原SDS-PAGE供試品緩沖液等體積混合，不經(jīng)水浴。分離膠濃度8.0%，10 μL/孔上樣，100 V電壓開始電泳，待指示劑前沿進(jìn)入分離膠后，電壓改為150 V。電泳結(jié)束后，凝膠用考馬斯亮藍(lán)R250染色[5]。

1.4.2 普通非還原SDS-PAGE與天然SDS-PAGE分析 C201105002（參比品）和Erbitux樣品均稀釋至2 mg/mL與2×非還原SDS-PAGE供試品緩沖液等體積混合，分別70 ℃水浴3 min、100 ℃水浴1 min后，立即轉(zhuǎn)入冰浴。分離膠濃度8.0%，10 μL/孔上樣，100 V開始電泳，待指示劑前沿進(jìn)入分離膠后，電壓改為150 V。另取相同樣品加入天然供試品緩沖液后不進(jìn)行加熱變性處理，直接進(jìn)行SDS-PAGE電泳。再取相同樣品加入2×非還原SDS-PAGE供試品緩沖液等體積混合，不經(jīng)水浴進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束后，凝膠用考馬斯亮藍(lán)R250染色[5]。

1.4.3 添加碘乙酰胺的非還原SDS-PAGE分析 C201105002（參比品）、C201107006和Erbitux樣品均稀釋至2 mg/mL，分別加入2×非還原SDS-PAGE供試品緩沖液或加碘乙酰胺的2×非還原SDS-PAGE供試品緩沖液，混勻后，70 ℃水浴3 min。分離膠濃度8.0%，上樣量10 μL，采用室溫條件下150 V恒壓電泳。電泳結(jié)束后，SDS-PAGE凝膠用考馬斯亮藍(lán)R250染色[1]。

2 結(jié)果

2.1 70 ℃與100 ℃不同時(shí)間水浴非還原SDS-PAGE分析 70 ℃分別處理1、2、3 min的樣品電泳結(jié)果的相對(duì)分子量小的次帶依次減少，70 ℃ 3 min相對(duì)分子量小的次帶已基本不可見；100 ℃ 1、2、3 min時(shí)相對(duì)分子量小的次帶有增加趨勢(shì)，100 ℃ 1 min時(shí)相對(duì)分子質(zhì)量小的次帶已基本消失；未經(jīng)水浴的條帶出現(xiàn)多個(gè)雜的相對(duì)分子低的次帶。表明對(duì)樣品進(jìn)行70 ℃ 3min或者100 ℃ 1 min的水浴處理對(duì)減少相對(duì)分子小的次帶有較好的效果，見圖1。

2.2 普通非還原SDS-PAGE與天然SDS-PAGE分析 未經(jīng)水浴的樣品中相對(duì)分子量大和相對(duì)分子量小的雜條帶比較明顯；對(duì)樣品進(jìn)行過預(yù)處理的電泳結(jié)果條帶單一；而對(duì)樣品未經(jīng)預(yù)處理的天然SDS-PAGE電泳結(jié)果出現(xiàn)彌散狀條帶，見圖2。

2.3 添加碘乙酰胺的非還原SDS-PAGE分析 愛比妥、C201107006、參比品在添加碘乙酰胺的情況下都比其沒有添加碘乙酰胺的相對(duì)分子量小的次帶要少得多；添加碘乙酰胺的樣品和未添加碘乙酰胺但經(jīng)過100 ℃ 1 min水浴的樣品的相對(duì)分子量小的次帶都明顯減少；在70 ℃ 3min煮樣后再添加碘乙酰胺對(duì)減少相對(duì)分子量小的次帶基本沒有效果，見圖3。endprint