毛龍火 王麗麗 熊 英

(1南昌大學第一附屬醫(yī)院傳染科 江西南昌 330031;2九江學院基礎醫(yī)學院 江西九江 332000)

銀杏 (Ginkgo bilobal)系銀杏科植物，具有欣賞、經(jīng)濟、藥用等多種價值。近年來，銀杏葉的藥用價值備受關注，引得廣大學者去研究探討。已發(fā)現(xiàn)的銀杏葉化學提取物有上百種，其中主要有黃酮類、萜類、酚類、生物堿等，而近年來的研究表明:黃酮類物質是銀杏葉的主要有效成分。黃酮類化合物的結構特點是具有C6－C3－C6的基本骨架，根據(jù)中間三碳鏈的氧化程度、B環(huán)(苯基)連接位置 (2－或3－位)以及三碳鏈是否呈環(huán)狀等特點，分為許多類型:黃酮、黃酮醇、二氫黃酮、二氫黃酮醇、異黃酮、二氫異黃酮、查爾酮等化合物［1］?，F(xiàn)已證實，銀杏葉中含有的黃酮類化合物具有優(yōu)異的抗氧化活性、抗腫瘤活性、防治心血管疾病和增強免疫力等作用。正是其上述眾多的生物活性引起了人們的廣泛重視，對該類化合物的研究已成為國內外醫(yī)藥界研究的熱門課題，是一類具有廣泛開發(fā)前景的天然藥物［1］。

目前提取黃酮化合物的主要方法有有機溶劑提取法、水或熱水提取法、微波提取法、二氧化碳超臨界提取法、酶解法、超聲波提取法等［1］。有機溶劑提取排污量大;水或熱水提取法效率低;氧化碳超臨界提取法、酶解法成本較高［2］;微波提取法設備簡單，提取效率高，是一個比較好的提取方法［3］。因此，本實驗用微波輔助有機溶劑法提取銀杏葉中總黃酮，以了解微波輔助下各種因素對銀杏葉總黃酮提取效率的影響，最后經(jīng)聚酰胺純化，為進一步研究銀杏葉的后期應用奠定基礎。

1 材料與方法

1實驗材料

1.1.1 實驗藥物 實驗所用銀杏葉購自九江天天好大藥房。

1.1.2 標準對照品 蘆丁標準品 (中國生物制品檢定所，批號100080－200707)配制成0.25mg/mL的蘆丁標準液。

1.2 試驗方法與結果

1.2.1 蘆丁標準品溶液的制備 精確稱取干燥至恒重的蘆丁對照品10.0mg于50mL容量瓶中，用適量70%乙醇溶解、蒸餾水定容。作為濃度為0.2mg/mL的蘆丁標準品溶液備用。

1.2.2 銀杏葉總黃酮樣品溶液制備 先把銀杏葉粉碎、干燥，稱取銀杏葉粉末1g，按比例加入一定濃度乙醇作溶劑，置于微波設備中提取濃縮，提取液過濾，加30%的乙醇溶解定容于50mL，搖勻靜置備用。

1.2.3 測定吸光度波長的選擇 分別取適量的蘆丁標準品溶液和制備好的銀杏葉總黃酮溶液，加入30%的乙醇至20mL，加入5%的NaNO21mL，搖勻靜置6min，加10%Al(NO3)31mL，搖勻靜置6min，再加入10%的NaOH 10mL，并加蒸餾水定容至50mL，搖勻靜置15 min后使用雙光束紫外可見分光光度計測最大吸光度，測得上述兩種溶液在511.2nm處有最大吸收波長。因此，本研究中將511.2nm作為最大吸收波長。

1.2.4 標準曲線的制備 分別取已制備好的蘆丁標 準 品 溶 液 0mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL、6.0mL、7.0mL于50mL容量瓶中，先后各自加入30%乙醇至25mL，加入5%亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻，放置6min，加入10%硝酸鋁溶液1mL，搖勻，放置6min［4］，加入10%氫氧化鈉10mL，加水至刻度，搖勻，放置15min［5］。在511.2nm波長測定吸光度，以蘆丁標準品溶液濃度 (C)為橫坐標，吸光度 (A)為縱坐標，建立蘆丁標準品濃度 (C)與吸光度 (A)的標準曲線，并繪制A－C標準曲線 (如圖1)，最后得回歸方程為:C=87.536×A—0.7994R2=0.9997。

圖1 蘆丁標準曲線

1.2.5 黃酮的定性鑒別［6］

(1)鹽酸－鎂粉反應:取已制備好的銀杏葉總黃酮樣品1mL置加有鎂粉適量的試管中，加濃鹽酸數(shù)滴，在泡沫處呈紅棕色。

(2)熒光反應:①三氯化鋁:將樣品點在紙上，噴灑1%(或5%)AlCl3，干燥后黃色斑點于紫外熒光燈下觀察，顯黃色斑點。②濃氨水溶液:將樣品點在紙上，干燥后，將濾紙在濃氨水瓶上熏，立即置于熒光下呈現(xiàn)極明顯的黃色熒光斑點［5］。

1.2.6 銀杏葉總黃酮的純化

(1)聚酰胺的預處理:取聚酰胺適量用4倍體積量95%乙醇浸泡48h，用超純水洗至中性;然后用4倍體積量的0.5%NaOH浸泡24h后再用水洗至中性;最后再用10%乙酸浸泡24h，用水洗至中性。

(2)總黃酮的純化:稱取已處理好的聚酰胺200g裝入層析柱中，將銀杏葉提取液約400mL以2～3mL/min的流速上柱，過柱完后用3倍聚酰胺體積量 (3～4BV)的超純水以3～4mL/min的速度洗柱至出水無色，再用4BV70%的乙醇以2～3mL/min的洗脫速度洗脫至無色透明，收集70%的乙醇洗脫液，減壓濃縮，干燥，稱重，測定總黃酮含量。

1.2.7 單因素實驗 將已制備好的銀杏葉總黃酮樣品溶液放在雙光束紫外可見分光光度計檢測，并根據(jù)回歸方程求出黃酮得率:黃酮得率 (%)=黃酮含量×稀釋倍數(shù)×稀釋體積×10－3/(W×103)×100%。選取對提取率有影響的3個因素:微波加熱時間、乙醇濃度、料液比，進行單因素實驗，獲得各個因素下的最佳提取條件。

(1)微波加熱時間對黃酮得率的影響: 分別稱取銀杏葉粉1g，加入20mL濃度為70%的乙醇，按上述方法提取黃酮，分別提取1、2、3、4、5min，計算黃酮得率并作微波加熱時間—黃酮得率圖，確定最佳的微波加熱時間為3min。

(2)乙醇濃度對黃酮得率的影響: 按上述方法提取黃酮，加入20mL不同濃度的乙醇溶液(50%、60%、70%、80%、90%)，在微波設備中提取一定時間 (為確定的最佳微波加熱時間)，計算黃酮得率并作乙醇濃度—黃酮得率圖，確定最佳的乙醇提取濃度為70%。

(3)料液比對黃酮得率的影響: 按上述方法，分別加入不同體積 (10mL、15mL、20mL、25mL、30mL)最佳濃度的乙醇溶液提取黃酮，計算在不同料液比下銀杏葉的黃酮得率并作乙醇體積—黃酮得率圖，確定最佳的料液比為20mL［7］。1.2.8正交實驗 在單因素實驗的基礎上，以黃酮含量為考察指標，采用L9(33)正交表對上述3個因素進行正交實驗。為了證實最佳提取條件，對正交實驗得到的最佳提取條件進行驗證實驗［7］。

表1 正交因素和水平

表2 正交實驗結果

由表可以看出K1、K2、K3表示各因素分別3個水平時相應的實驗結果的算術平均值;極差R是K1、K2、K3中最大值與最小值之差，它反映了實驗中各因素影響的大?。?］。所以可知因素A的極差最小，為最小誤差項，并且各因素在微波法提取銀杏葉總黃酮中的影響程度大小為:乙醇濃度＞料液比＞提取時間。

表3 微波法正交實驗設計的方差分析

由正交結果分析可知，因素B乙醇濃度，隨著濃度的逐步升高，總黃酮的得率也逐步提高;因素C料液比對總黃酮提取有顯著性意義;因素A對提取率無顯著性意義，可根據(jù)生產(chǎn)條件任取一水平，從節(jié)約能源和提高生產(chǎn)效率方面考慮，提取時間選擇A1(3min)，得出最佳提取工藝為A1B3C3。

1.2.9 最佳組合的驗證 最佳組合實驗驗證情況見表4。

表4 最佳組合驗證

結果表明，驗證試驗結果與正交試驗結果相近，確定該實驗結果基本穩(wěn)定可靠。

微波法與眾多其他提取方法相比，具有更方便、快速的優(yōu)點，但目前，微波萃取的應用對象還比較少，其應用研究還處于初始階段［9－10］。因此，在提取過程中也出現(xiàn)了不足之處，比如微波提取時間不宜過長，否則由于溶劑溢出造成實驗失敗。

聚酰胺具有靈敏度高，分辨力強，快速，操作方便等優(yōu)點，還可以重復利用既節(jié)約，又環(huán)保。但本實驗未在聚酰胺純化前、后對細胞影響作出對比，以證明聚酰胺的純化效果。

2 結論

以銀杏葉總黃酮提取液在511.2nm波長處的吸光度為參考指標，通過總黃酮提取工藝的正交試驗研究，確定了從銀杏葉中提取黃酮的最佳條件為:以90%乙醇為溶劑，料液比為1∶25，微波5min，通過驗證性試驗確定該提取方法結果準確可靠［8］。為進一步研究銀杏葉中總黃酮提取工藝提供理論依據(jù)。因此，含有豐富黃酮的銀杏葉，具有廣泛開發(fā)和利用的價值，值得綜合利用，應該加強其資源開發(fā)［4］。

［1］張巖，曹國杰，張燕，等．黃酮類化合物的提取以及檢測方法的研究進展 ［J］．食品研究與開發(fā)，2008，29(1):154．

［2］張萏，徐雅晴，時陽．黃酮類化合物提取工藝研究 ［J］．食品與藥品，2007，9(04A):54．

［3］張孝武．超聲和熱堿提取對蘆丁成分影響的比較 ［J］．中草藥，1997，28(2):88．

［4］謝茵，王秋亞，畢小平．正交設計法探討生姜中總黃酮的提取方案 ［J］．山西醫(yī)科大學學報，2008，39(11):1012．

［5］韋耀東，孫婷婷，劉?；ǎ龋暡ㄌ崛∩］乜傸S酮及鑒別 ［J］．時珍國醫(yī)國藥，2012，23(11):2811．

［6］蔡定建，柳茶花，鐘鴻鳴．野菊花中黃酮類物質的提取和鑒定 ［J］．中國食品添加劑，2010，21(2);143．

［7］付明，任寶紅，牛友芽，等．超聲波輔助法提取藜蒿黃酮的工藝研究 ［J］．懷化學院學報，2009，28(8):40．

［8］李寧，李楚．銀杏葉總黃酮提取工藝的正交設計研究 ［J］．山西農業(yè)大學學報:自然科學版，2010，30(1):74．

［9］郭振庫，金欽漢．微波萃取技術 ［J］．分析科學學報，2001，17(6):505．

［10］陳斌，南慶賢，呂玲，等．微波萃取葛根總異黃酮的工藝研究 ［J］．農業(yè)工程報，2001，17(6):123．