王 幸，陳穎妃，林煜丹，何禮安，關洪威，肖相政

（仲愷農業(yè)工程學院環(huán)境科學與工程學院，廣東 廣州 510225）

隨著經濟和社會的發(fā)展，固體有機廢物產生量不斷增長，據(jù)資料統(tǒng)計，2009年規(guī)?；B(yǎng)殖畜禽糞便產量約為8.37億噸［1］，2010年我國農作物秸稈產量達7.3億噸［2］，上述廢棄物的隨意排放和不合理處置對環(huán)境造成巨大壓力，亟待解決。農作物秸稈、畜禽糞便等有機廢棄物除含有大量的纖維素外，還含有氮、磷、鉀及多種微量元素［3］，因此通過科學處理和特殊工藝可將其變廢為寶，進行循環(huán)利用。目前比較成熟的降解纖維類廢棄物的方法是好氧生物處理，利用好氧微生物在有氧條件下纖維素酶的代謝作用，將廢物中復雜的有機物分解，進一步將其加工成飼料、有機肥料等［4－5］。目前用于生產纖維素酶的微生物大多為絲狀真菌，研究較多的有木霉屬、曲霉屬、根霉屬和漆斑霉屬，其中曲霉是公認產纖維素酶最高的菌種之一［6］。黑曲霉2是仲愷農業(yè)工程學院自行分離篩選的一株具有產纖維素酶活性的絲狀真菌，研究表明，該菌對木薯渣、煙葉渣、園林廢棄物等具有較好的降解效果，應用潛力巨大。為進一步提高其產酶效率，本文研究了培養(yǎng)時間、接種菌齡、裝液量（通氣）、初始pH、底物碳源等條件對產纖維素酶活性的影響，以期為今后推廣應用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株 黑曲霉2（仲愷農業(yè)工程學院環(huán)境科學與工程學院保存），以冰箱保存原始菌株為母種，由母種經復壯活化轉接的為一代菌種，依此分別為二代、三代菌種。

1.1.2 產酶基礎培養(yǎng)基 蔗糖30g，硝酸鈉2g，磷酸二氫鉀1g，氯化鉀0.5g，七水硫酸鎂0.5g，七水硫酸亞鐵0.01g，水1000mL，自然pH，121℃滅菌30min。

1.1.3 主要試劑 磷酸鈉緩沖液（（0.2mol/L，pH6.0）、羧甲基纖維素鈉鹽（CMC）緩沖液、3，5－二硝基水楊酸（DNS）顯色劑、1000μg/mL標準葡萄糖溶液、標準纖維素酶液（廣州某化學試劑店購買）。

1.1.4 底物碳源 木薯渣、稻秸、糖泥、中藥渣（其中木薯渣、糖泥分別取自廣東某淀粉廠和糖廠，中藥渣取自廣州某制藥公司，木薯渣、稻秸、糖泥、中藥渣經60℃烘干后磨碎，過60目篩備用）。

1.2 試驗方法

1.2.1 纖維素酶活性測定 纖維素粗酶液制備：發(fā)酵液經5000r/m離心10min，上清液即為粗酶液。纖維素酶活性測定：參照農用微生物菌劑（GB20287－2006）中纖維素酶活性測定方法［7］，以羧甲基纖維素鈉鹽作底物，CMC經纖維素酶水解后生成還原糖，還原糖能與3，5－二硝基水楊酸作用使硝基還原為氨基，溶液變?yōu)槌壬?，橙色的深度與還原糖濃度成正比，因此通過比色可求得還原糖含量，進而可計算纖維素酶活性。酶活單位：在試驗條件下，以每分鐘產生1μmol葡萄糖定義為1個酶活力單位［8］。

1.2.2 黑曲霉2種子液制備 將冰箱保存的黑曲霉2置于28℃的生化培養(yǎng)箱活化2h，然后轉接于50mL基礎培養(yǎng)基中，30℃、200r/min搖床培養(yǎng)24h，備用。

1.2.3 培養(yǎng)時間對黑曲霉2產酶活性的影響 接種5mL黑曲霉2種子液于150mL基礎培養(yǎng)基中，30℃、200r/min搖床培養(yǎng)，分別于24h、48h、72h、96h測定纖維素酶活性。

1.2.4 接種菌齡對黑曲霉2產酶活性的影響 參照1.2.2方法，分別以母種、一代菌種、二代菌種、三代菌種制備種子液，然后接種5mL種子液于150mL基礎培養(yǎng)基中，48h測定各處理纖維素酶活性。

1.2.5 通氣量（裝液量）對黑曲霉2產酶活性的影響 以3%接種量分別轉接種子液于100mL、150mL、200mL、250mL的基礎培養(yǎng)基中，30℃、200r/min搖床培養(yǎng)，測定各處理48h的纖維素酶活性。

1.2.6 pH 對黑曲霉2產酶活性的影響 分別配制pH 值為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的基礎培養(yǎng)基，然后接種5mL種子液，30℃、200r/min搖床培養(yǎng)，48h測定各處理纖維素酶活性。

1.2.7 不同底物（碳源）對黑曲霉2產酶活性的影響 分別以中藥渣、木薯渣、水稻秸稈、糖泥為碳源替代基礎培養(yǎng)基中的蔗糖，接種5mL種子液于150mL各培養(yǎng)基中，30℃、200r/min搖床培養(yǎng)，48h測定各處理的纖維素酶活性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本文數(shù)據(jù)采用SAS9.0進行統(tǒng)計分析（SAS Institute，Gary，NC，USA）；圖表制作采用軟件EXCEL 2003（Microsoft Company，USA）

2 結果與分析

2.1 培養(yǎng)時間對黑曲霉2產纖維素酶活性的影響

分別在培養(yǎng)24、48、72、96h取樣測定發(fā)酵液纖維素酶活性，結果見圖1。

圖1 培養(yǎng)時間對黑曲霉2產纖維素酶活性的影響

從圖1中可以看到，黑曲霉2產纖維素酶具有一定的規(guī)律性，酶活隨培養(yǎng)時間的延長而增加，48h達到活性高峰，酶活力為938.19μg/mL，隨后逐漸降低，至96h下降到45.57μg/mL。試驗結果表明48h為黑曲霉2產酶活性高峰，此時菌體生長旺盛。

2.2 接種菌齡對黑曲霉2產纖維素酶活性的影響

接種物菌齡直接影響菌體的生長活性，菌齡越老，菌體活性一般較低。本研究中分別接種母種、一代、二代和三代菌種，并離心測定了菌體濕重，結果見表1。從表中結果可以看到，接種不同菌種影響產酶活性，其總體呈現(xiàn)出隨菌齡老化而降低的趨勢，接種二代菌種和三代菌種酶活力差別不大，以接種原始菌株產酶活性最高，48h達611.07μg/mL，同時測定的菌絲濕重和酶活性具有一定的相關性，酶活性越高，菌體濕重一般越大。

表1 接種物菌齡對黑曲霉2產纖維素酶活性的影響

2.3 通氣量對黑曲霉2產纖維素酶活性的影響

不同裝量對纖維素酶活性的影響見表2。從表中可知，不同裝液量對纖維素酶活性影響顯著，其中以裝量150、200mL時酶活性較高，相比100、250mL裝量時差異顯著，說明黑曲霉2產酶需要一定的通氣條件，但并非通氣量越大越好，同時菌絲濕重與酶活性表現(xiàn)出較好相關性。

表2 不同裝液量對黑曲霉2產纖維素酶活性的影響

2.4 培養(yǎng)基初始pH對黑曲霉2產纖維素酶活性的影響

pH不但影響酶產量，而且影響酶的活性和穩(wěn)定性。分別調節(jié)基礎培養(yǎng)基pH為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，測定發(fā)酵液48h的纖維素酶活性，結果見圖2。從圖中可以看到，黑曲霉2在pH6.5時產酶活性最高，達787.46μg/mL，隨著pH增大，纖維素酶活性急劇下降，說明黑曲霉2在中性偏酸的環(huán)境條件下生長好，代謝旺盛，產酶量大，與文獻報導的黑曲霉適宜生長環(huán)境是弱酸性一致［9－10］。

圖2 初始pH對黑曲霉2產纖維素酶活性的影響

2.5 不同底物對黑曲霉2產纖維素酶活性的影響

分別采用木薯渣、水稻秸稈、糖泥、中藥渣作為碳源替代基礎培養(yǎng)中的蔗糖，測定48h的產酶活性，結果見表3。表中數(shù)據(jù)表明，纖維素酶活性因底物不同而有差異，其中以木薯渣做底物時，活性最高，達761.95μg/mL，其次為中藥渣，而以稻秸、糖泥做底物時，產酶活性相對較差，說明在四種有機廢棄物中，黑曲霉2對木薯渣的分解能力最強，效果最好。同時從測定的菌體濕重也可看到，其量與酶活性成正比，顯示了較好的相關性。

表3 不同底物對黑曲霉2產酶活性的影響

3 結論與討論

本文系統(tǒng)研究了接種菌齡、培養(yǎng)時間、通氣量、初始pH和不同碳源底物對黑曲霉2產纖維素酶活性的影響，確定了黑曲霉2高效產酶的最佳培養(yǎng)條件，即采用原始菌株接種、基礎培養(yǎng)基初始pH為6.5、每500mL搖瓶裝量為150mL、培養(yǎng)48h條件下產纖維素酶活性最高，為今后工業(yè)生產及高效應用提供了技術參數(shù)。

纖維素酶是誘導酶，在纖維素酶的生產中選擇合適產酶誘導物十分重要。據(jù)資料報道，產酶誘導物效力最強的是槐糖［11］，但其價格昂貴，不適合工業(yè)生產。本研究中選擇了四種有機廢棄物做為產酶誘導底物和碳源，其表現(xiàn)出了不同的產酶效果，以木薯渣效果最好，表明黑曲霉2對木薯渣的利用能力最強，適合木薯渣的高效降解。本研究中酶活力測定采用的是液體發(fā)酵培養(yǎng)，但目前有機廢棄物常用的處理方法是生物堆肥，因此下一步擬對該菌固體發(fā)酵產酶條件進行研究，以滿足生產的需要。

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