唐建 羅清禮

甲狀腺相關眼病(thyroid associated ophthalmopathy，TAO)是以眼外肌和眶脂肪組織增多為特征的自身免疫性疾病。眼眶脂肪組織增多不但與突眼程度相關，而且能分泌多種脂肪細胞因子。眼眶組織中的前脂肪成纖維細胞屬于成纖維細胞的一個亞型，在體外培養(yǎng)的適當條件下能分化為脂肪細胞[1]，在脂肪組織增生中起著重要作用。瘦素(Leptin)作為特異性的脂肪細胞因子，由Zhang等[2]于1994年發(fā)現(xiàn)其基因定位并命名，通過受體及多種神經(jīng)肽通路發(fā)揮生物學效應，除了作用于下丘腦來控制攝食、能量消耗外，還具有調(diào)節(jié)炎癥反應、促進細胞增殖等作用。本研究利用手術時獲得的TAO患者和正常人眼眶脂肪組織樣本，以及體外培養(yǎng)的TAO患者與正常人眼眶前脂肪成纖維細胞誘導分化得到的脂肪細胞，采用實時熒光定量PCR檢測Leptin mRNA的表達情況，探索其在TAO發(fā)病機制中的意義。

1 材料與方法

1.1組織來源TAO患者的眼眶脂肪組織取自眼眶減壓術中，共8例8眼，所有患者均符合TAO的診斷標準[3]，排除其他免疫性、腫瘤性疾病；正常人眼眶脂肪組織取自13例(13眼)去眼袋術中，亦排除其他免疫性、腫瘤性疾病。入選的TAO患者和正常人群性別比例、年齡、身體質(zhì)量指數(shù)間差異均無統(tǒng)計學意義(均為P>0.05，見表1)。本研究通過本院醫(yī)學倫理委員會的批準，組織取樣獲得患者的同意并簽署知情同意書。

表1 入選的TAO患者與正常人群的基線比較

1.2主要試劑與儀器TrizolTMRNA分離液(美國Gibco公司)，DMEM/F12培養(yǎng)液(美國Gibco公司)，酶聯(lián)免疫檢測儀(美國Thermolab公司)，CO2培養(yǎng)箱(美國Forma Scientific公司)，GeneAmp PCR System 9600(美國PE公司)，F(xiàn)TC2000實時熒光定量PCR儀(加拿大楓嶺公司)。

1.3眼眶前脂肪成纖維細胞的誘導分化和鑒定將眼眶脂肪組織樣本采用組織塊培養(yǎng)的方法進行前脂肪成纖維細胞培養(yǎng)，具體方法參見文獻[4]。傳代培養(yǎng)后，取同代對數(shù)生長期的細胞用于實驗，接種于培養(yǎng)板，含體積分數(shù)5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，待細胞生長融合后，換用誘導液2 mL(含IBMX 0.2 mmol·L-1、胰島素10 mg·L-1、地塞米松1 μmol·L-1)，3 d左右換液1次；換液2次后撤掉IBMX，用胰島素、地塞米松維持培養(yǎng)，油紅染色鑒定脂肪細胞分化，取第10天的分化脂肪細胞用于檢測Leptin mRNA。

1.4LeptinmRNA的檢測(1)Trizol法分別提取TAO患者和正常人的組織樣本、分化后脂肪細胞樣本的總RNA沉淀，GeneAmp PCR System 9600 PCR儀進行逆轉(zhuǎn)錄構(gòu)建cDNA模板。分別經(jīng)電泳驗證其RNA和cDNA純度。參照NCBI GeneBank中的基因序列設計引物和TaqMan探針，目的基因Leptin：上游引物：5’-CACCAAAACCCTCATCAAGA-3’，下游引物：5’-GAATGAAGTCCAAACCGGTGA-3’，探針：5’-CAATGACATTTCACACACGCAGTC-3’，擴增片段長度：106 bp；管家基因GAPDH：上游引物：5’-CCTCAAGATCATCAGCAAT-3’，下游引物：5’-CCATCCACAGTCTTCTGGGT-3’，探針：5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’，擴增片段長度：141 bp。(2)用假定初始拷貝數(shù)(X)的cDNA模板按10倍梯度進行稀釋，制成標準模板系列，建立標準曲線。FTC2000實時熒光定量PCR儀擴增條件：94 ℃ 1 min，94 ℃ 10 s，53 ℃ 30 s，70 ℃ 1 min，45個循環(huán)。采用53 ℃ 30 s作為退火期，系統(tǒng)采集每一循環(huán)反應時的各反應管的熒光強度增長指數(shù)(DRn)并繪制擴增動力學曲線。根據(jù)動力學曲線確定每個反應管中熒光強度增加到某一特定閾值時的擴增循環(huán)數(shù)(Ct值)，再根據(jù)Ct值與標準模板稀釋濃度的初始拷貝數(shù)的對數(shù)值作圖，得到該樣本的標準曲線。如果曲線的相關系數(shù)r>0.96，則認為標準曲線擬合滿意，計算各基因的擴增效率Ex=10-1/k(k為標準曲線的斜率)。(3)將逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA樣本各取5 μL，在相同反應條件下進行PCR擴增及檢測熒光強度，自動繪制動力學曲線，判讀其Ct值。根據(jù)Livak和Schmittgen的數(shù)學推導[5]，采用比較閾值法計算待測樣本中目的基因的相對拷貝數(shù)：待測樣本/校正樣本=Ex-ΔΔCt，ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct管家基因)待測樣本-(Ct目的基因-Ct管家基因)校正樣本，校正樣本是任何被選作代表1倍目的基因表達量的樣本。所以Ex-ΔΔCt表示的是待測樣本中目的基因表達相對于校正樣本的變化倍數(shù)，使用這一方法可以定量表示各樣本中Leptin的相對值。在PCR反應過程中，設定無cDNA樣品的空白管作為陰性對照。

2 結(jié)果

2.1總RNA的提取和常規(guī)PCR結(jié)果提取的各樣本總RNA的OD260/OD280值為1.8～2.1。10 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳可見28 S、18 S、5 S三條帶，無DNA污染條帶，無明顯降解條帶，表明提取的總RNA完整且純度較高(圖1)。

常規(guī)PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)20 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳，可見141 bp、106 bp電泳帶，分別對應GAPDH、Leptin引物所擴增的DNA片段長度，說明引物設計合成無誤，cDNA可用于熒光定量PCR檢測(圖2)。

2.2前脂肪成纖維細胞的體外培養(yǎng)、分化及鑒定原代培養(yǎng)3～5 d即見組織塊周圍有細胞游出，15 d左右細胞生長達到融合，每3～4 d傳代1次。前脂肪成纖維細胞對胰蛋白酶敏感，多次傳代可得到純化的細胞，呈長梭形或多角形，核較明顯(圖3)。隨著分化的進程，細胞形態(tài)逐漸變?yōu)閳A形，細胞內(nèi)出現(xiàn)越來越多的脂滴，分化10 d后，油紅染色顯示細胞內(nèi)脂滴呈紅色(圖4)。

Figure 1 Electrophoresis of orbital adipose total RNA.1:Orbital adipose of TAO patients;2:Normal humans 眼眶脂肪組織總RNA電泳圖。1：TAO患者；2：正常人

Figure 2 Electrophoresis of orbital adipose of RT-PCR amplification products.1:Normal GAPDH;2:TAO patients GAPDH;3:Normal leptin;4:TAO patients leptin;M:Formula weight maker 眼眶脂肪組織常規(guī)PCR擴增產(chǎn)物凝膠電泳圖。1：正常人GAPDH；2：TAO患者GAPDH；3：正常人Leptin;4:TAO患者Leptin;M:分子量Maker

Figure 3 Preadipocytes cultured for 20 days under inverted phase-contrast microscope(×100) 培養(yǎng)20 d的前脂肪成纖維細胞倒置相差顯微鏡表現(xiàn)(×100)

2.3組織樣本的Leptin基因的檢測經(jīng)統(tǒng)計學分析，TAO患者和正常人眼眶脂肪組織中的Leptin mRNA相對表達量分別為2.12±1.03、0.65±0.61，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；經(jīng)過協(xié)方差分析排除身體質(zhì)量指數(shù)、年齡和性別可能的混雜影響后，其相對表達量分別為2.05±0.31、0.69±0.24，這種差異仍然具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明TAO患者眼眶脂肪組織中的Leptin mRNA表達量明顯高于正常人。

Figure 4 Lipid droplets of differentiated adipocytes stained into red color by oil red(×100) 分化后脂肪細胞經(jīng)油紅染色出現(xiàn)脂滴(×100)

2.4分化后脂肪細胞Leptin基因的檢測經(jīng)統(tǒng)計學分析，TAO患者和正常人分化后第10天眼眶脂肪細胞Leptin mRNA的相對表達量分別為1.55±0.44、0.66±0.21，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，TAO患者分化后脂肪細胞的Leptin mRNA表達量明顯高于正常人。

3 討論

長期以來，TAO的研究者們都困惑于為什么類似的組織病理學改變只發(fā)生在眼眶和脛前組織而不發(fā)生在身體其他部位？為什么只有部分Graves病患者發(fā)展成為TAO？為什么有些TAO患者并沒有甲狀腺病史？為什么有的TAO患者表現(xiàn)為眶脂肪增多而一些患者則表現(xiàn)為眼外肌增大[6]？一些研究者提出了自身抗原變異[7]、創(chuàng)傷性免疫[8]、眼眶局部的骨性限制[9]、循環(huán)抗體[10]、潛在的頸淋巴旁路[11]等假設，但都不能很好地解釋TAO復雜的發(fā)病機制。研究者普遍認為在甲狀腺病變和其他免疫紊亂基礎上，存在非特異性循環(huán)抗體和針對眼眶、脛前脂肪/結(jié)締組織中自身抗原(如促甲狀腺激素受體TSHR)的自身免疫反應[12]。TAO與黏液性脛前水腫病變(pretibial dermopathy，PTD)可能就是體液、細胞免疫因素與局部因素結(jié)合的結(jié)果。

Leptin可通過受體及多種神經(jīng)肽通路發(fā)揮生物學效應，除了作用于下丘腦來控制攝食、能量消耗外，Leptin還具有調(diào)節(jié)炎癥反應、促進細胞增殖和抑制乙酰輔酶A羧化酶[13]等作用。Ozata等[14]發(fā)現(xiàn)Graves病患者和正常人的血清Leptin水平?jīng)]有明顯差異，Graves病患者和Graves眼病患者的血清Leptin水平也沒有差異，而且Graves眼病患者的血清Leptin水平與臨床指標間也沒有相關性；但TAO患者與正常人眼眶局部組織中Leptin水平是否存在差異，還缺乏研究。

本研究采用實時熒光定量PCR檢測TAO患者與正常人眼眶脂肪組織中的Leptin mRNA表達是否存在差異，發(fā)現(xiàn)TAO患者眼眶脂肪組織中Leptin mRNA表達量明顯高于正常人，差異具有統(tǒng)計學意義，說明Leptin基因在TAO患者眼眶脂肪組織的平均表達程度高于正常人。但是，因為組織樣本仍存在一些影響細胞生理代謝的體液因子，所以這種基因水平的升高是源自細胞來源的差異還是TAO特異的眼眶免疫微環(huán)境呢？

前脂肪成纖維細胞是成纖維細胞的一個亞型，主要存在于全身脂肪/結(jié)締組織的基質(zhì)-血管區(qū)域[15]。Sorisky等[16]發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的人眼眶脂肪組織中的前脂肪成纖維細胞在體外誘導分化下5%～10%能分化成含脂滴的脂肪細胞。Erickson等[17]發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的人眼眶組織前脂肪成纖維細胞的分化導致Leptin基因的表達升高，并且Leptin蛋白在分化1～5 d可以被檢測到，7～9 d達高峰。

根據(jù)組織樣本的研究，我們進一步發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的TAO患者和正常人眼眶前脂肪成纖維細胞在誘導分化刺激下均能向脂肪細胞方向分化，但TAO患者眼眶前脂肪成纖維細胞分化過程中Leptin mRNA的表達量大于正常人，這說明TAO患者和正常人的眼眶前脂肪成纖維細胞存在著細胞水平上的差異，表現(xiàn)為在相同分化刺激下，前者更容易向分化方向轉(zhuǎn)化，表達出脂肪細胞特異性基因。這種差異可能是由細胞本身的基因背景所決定的，也可能是由以前的治療過程或解剖部位特異的免疫環(huán)境引起的細胞某些表型改變所決定的，但不管怎樣，TAO患者和正常人在細胞水平上的差異，從而表現(xiàn)在組織水平上的差異，使得在同樣疾病誘發(fā)因素下，TAO患者更容易表現(xiàn)出相應的眼眶病變。

我們認為，細胞水平的差異就是局部因素的實質(zhì)，它不僅引起某種特異性自身抗原的表達，而且細胞的不同亞型也決定了不同的臨床類型、階段和病情的輕重緩急。細胞水平的差異主要是指細胞表型的不同，對眼眶組織細胞的表面標記蛋白及其作用機制的進一步研究可以幫助我們更加接近TAO的內(nèi)在發(fā)病機制。

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