高 路, 何聰芬,*, 李 萌, 張昕悅

(1.北京工商大學(xué)北京市植物資源研究開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100048;2.河北聯(lián)合大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,河北唐山 063000)

金黃色葡萄球菌(staphylococcus aureus)是食品、醫(yī)院內(nèi)感染以及化妝品領(lǐng)域重要的致病菌之一[1].金黃色葡萄球菌腸毒素現(xiàn)已成為世界性衛(wèi)生問(wèn)題,根據(jù)美國(guó)疾病預(yù)防控制中心報(bào)告,在美國(guó)整個(gè)細(xì)菌性食物中毒中由金黃色葡萄球菌腸毒素引起的為33%,加拿大更多,為45%,其他一些歐洲國(guó)家如芬蘭、匈牙利等占50%以上.我國(guó)每年由于金黃色葡萄球菌引起的中毒事件也非常多[2].由于抗生素的大量使用,促進(jìn)了耐藥性菌株的不斷出現(xiàn),尤其是耐甲氧西林菌,其中就包括了耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin resistant Staphylococcus aureus,MRSA).因此建立MRSA的檢測(cè)方法,對(duì)控制MRSA的感染是十分重要的.

1 傳統(tǒng)檢測(cè)方法

傳統(tǒng)方法[1,3]檢測(cè)金黃色葡萄球菌主要通過(guò)富集培養(yǎng)、分離純化培養(yǎng)、菌落的形態(tài)觀察和一系列的生化鑒定以及血清型鑒定等步驟進(jìn)行檢測(cè),檢測(cè)過(guò)程需時(shí)大概4～7 d,步驟煩瑣.臨床上MRSA的檢測(cè)最常采用的是傳統(tǒng)的藥物敏感試驗(yàn)方法,其中包括藥敏紙片法、β-內(nèi)酰胺酶檢測(cè)、苯唑西林鹽瓊脂篩查法、E-test和試管雙倍稀釋法等.但是MRSA的檢出很容易受到培養(yǎng)基成分,特別是氯化鈉含量、pH值、孵育時(shí)間、接種量、溫度以及培養(yǎng)基中是否加誘導(dǎo)劑等多種因素影響,方法比較費(fèi)時(shí),并且使用方法不當(dāng)時(shí),容易造成漏檢或誤檢.

2 快速檢測(cè)方法

近幾年來(lái),金黃色葡萄球菌的快速檢測(cè)及其自動(dòng)化研究進(jìn)展迅速.目前,國(guó)內(nèi)外針對(duì)金黃色葡萄球菌檢測(cè)方法分為生化檢測(cè)、免疫學(xué)檢測(cè)以及分子生物學(xué)檢測(cè)3個(gè)方面.

2.1 生化檢測(cè)

2.1.1 顯色培養(yǎng)基

1974年,Alain研發(fā)了用于檢測(cè)大腸桿菌的顯色培養(yǎng)基并于1979年申請(qǐng)專利,成立了法國(guó)科瑪嘉公司.顯色培養(yǎng)基的原理是利用微生物自身代謝產(chǎn)生的酶與相應(yīng)顯色底物反應(yīng)顯色來(lái)檢測(cè)微生物的新型培養(yǎng)基.顯色培養(yǎng)基是將目標(biāo)微生物特征酶加入到選擇培養(yǎng)基中,將微生物的特征性酶的測(cè)試和選擇性培養(yǎng)同時(shí)進(jìn)行.當(dāng)目標(biāo)微生物在培養(yǎng)基上選擇性的生長(zhǎng),其特征酶能夠降解顯色底物,并產(chǎn)生帶有特殊顏色的代謝產(chǎn)物,使得菌落呈現(xiàn)特定的顏色.與此同時(shí)干擾菌被抑制或者不產(chǎn)生特征酶而不顯色,通過(guò)顯色培養(yǎng)基上菌落顏色形態(tài)觀察或簡(jiǎn)單試驗(yàn)就可以進(jìn)行鑒別.目前市場(chǎng)上比較成熟的金葡菌顯色培養(yǎng)基產(chǎn)品主要有CHROM agar Staph aureus(生產(chǎn)商:科瑪嘉公司),BBL CHROM agar Staph aureus(生產(chǎn)商:BD公司),S.aureus ID、3M Petrifilm Staph Express Countplate(生產(chǎn)商:生物梅利埃公司)等.

2.1.2 快速測(cè)試片

快速測(cè)試片是以紙膜、紙片、膠片等作為培養(yǎng)基的載體,將特定的顯色物質(zhì)和培養(yǎng)基附著在上面,通過(guò)微生物在上面的生長(zhǎng)、顯色來(lái)檢測(cè)食品中微生物的一種快速檢測(cè)方法.

金黃色葡萄球菌的快速測(cè)試片既具有顯色培養(yǎng)基的靈敏、特異和高選擇性,并且具有紙片法的方便、經(jīng)濟(jì)與快捷的特點(diǎn),特別適合于食品中金黃色葡萄球菌的快速初篩,可以滿足金黃色葡萄球菌快速檢測(cè)的需要.

2.2 免疫學(xué)方法

免疫分析方法是利用抗體與抗原特異性結(jié)合的特性實(shí)現(xiàn)樣品檢測(cè)的方法.此法具有較高的特異性和靈敏度,可有效避免復(fù)雜樣本中雜質(zhì)干擾,簡(jiǎn)化了前處理凈化步驟.用于食品安全檢測(cè)的方法主要包括免疫凝聚和沉淀法、放射免疫法、酶聯(lián)免疫法等.

2.2.1 乳膠凝集法

1980年,Essers和 Radebold首先使用乳膠凝集的方法準(zhǔn)確檢測(cè)金黃色葡萄球菌,此方法是基于特異性檢測(cè)凝固酶活性(凝集因子)和蛋白A.過(guò)去的30年中,基于這一原理已經(jīng)研制出許多商業(yè)化檢測(cè)金黃色葡萄球菌的乳膠凝集試劑盒.Griethuysen等[4]對(duì)892株金黃色葡萄球菌樣品采用乳膠凝集試劑盒進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示此方法的靈敏度和特異性分別為98.2%和98.9%,證實(shí)了乳膠凝集試劑盒能夠有效地檢測(cè)金黃色葡萄球菌,但在一些MRSA菌株凝集檢測(cè)易出現(xiàn)假陰性.為了解決這一問(wèn)題,研究人員開發(fā)了第三代金黃色葡萄球菌乳膠凝集檢測(cè)試劑盒,此試劑盒在原有的基礎(chǔ)上同時(shí)還檢測(cè)5型和8型莢膜多糖.近年來(lái),為了進(jìn)一步提高特異性,第四代乳膠凝集試劑盒Staph Plus Latex Kit(Dia-MondiaL[DML],See,France)問(wèn)世.第四代乳膠凝集試劑盒是將開發(fā)的藍(lán)色羧基微粒與檢測(cè)凝固酶、蛋白A以及5型和8型莢膜多糖相結(jié)合.在靈敏度和特異性方面第四代乳膠凝集試劑盒能夠與第三代相媲美,且更易于鑒別金黃色葡萄球菌.

2.2.2 酶聯(lián)免疫吸附法

酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)是近年來(lái)應(yīng)用較為廣泛的免疫學(xué)方法,其原理是將酶分子與抗體(抗原)分子相結(jié)合形成酶標(biāo)記分子,這種酶標(biāo)分子既具有免疫活性,又保留酶的活性.酶標(biāo)記分子與固相免疫吸附劑中相應(yīng)的抗原(抗體)或抗原抗體結(jié)合物相遇,形成了酶抗原抗體結(jié)合物,催化加入的底物產(chǎn)生有色產(chǎn)物,可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺進(jìn)行檢測(cè).它主要包括直接法、間接法、夾心法.ELISA法應(yīng)用于檢測(cè)金黃色葡萄球菌腸毒素,國(guó)內(nèi)外有較多相關(guān)報(bào)道.隨著抗各型腸毒素單克隆抗體的成功制備,ELISA診斷試劑盒也已開始得到廣泛使用.

目前,美國(guó)食品和藥品管理局認(rèn)可使用的金黃色葡萄球菌檢測(cè)ELISA方法主要有:TECRA(生產(chǎn)商:Bio enterprises Roseville,Australia),SET-EIA(生產(chǎn)商:Toxin Technology Madison,WI和Transia Lyon,France).

2.2.3 化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測(cè)法

1977年,Halman等創(chuàng)建化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫法(chemiluminescence enzyme immunoassay,CLEIA).CLEIA法是將化學(xué)發(fā)光法和免疫分析法相結(jié)合,其原理是根據(jù)化學(xué)發(fā)光的強(qiáng)度(RLU)與反應(yīng)物(產(chǎn)物)的濃度呈正比來(lái)進(jìn)行檢測(cè).該方法既具有化學(xué)發(fā)光的高靈敏度,同時(shí)還具有免疫分析方法的高特異性,檢測(cè)的線性范圍寬,且簡(jiǎn)單快速,無(wú)放射性污染.Creton等[5]實(shí)驗(yàn)表明此方法的檢測(cè)靈敏度常高于放射免疫分析,該方法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于食品衛(wèi)生檢測(cè)、臨床標(biāo)本檢測(cè).

劉飛[6]使用常規(guī)方法制備了20株針對(duì)SEB分子的單克隆抗體,并從中篩選出兩株效價(jià)高、特異性強(qiáng),識(shí)別不同表位組的兩株單克隆抗體,組成抗體配對(duì),通過(guò)微孔板式化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫法對(duì)金黃色葡萄球菌腸毒素B進(jìn)行檢測(cè).結(jié)果顯示:此方法的檢測(cè)限達(dá)到0.01 ng/mL,具有高特異性、高靈敏度、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn).

2.3 分子生物學(xué)方法

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是1985年由Mullis等發(fā)明,采用DNA聚合酶進(jìn)行體外酶促合成、擴(kuò)增特定DNA片斷的一種方法.該技術(shù)具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、快速準(zhǔn)確、高效等特點(diǎn),因此在醫(yī)學(xué)、生命科學(xué)、農(nóng)業(yè)科學(xué)、環(huán)境科學(xué)、考古學(xué)等許多領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用.

2.3.1 多重PCR技術(shù)

隨著聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)的發(fā)展,多重PCR法在檢測(cè)金黃色葡萄球菌中得到了應(yīng)用.其基本原理是同一反應(yīng)體系中,同時(shí)加入多對(duì)引物,與此同時(shí)對(duì)多個(gè)特異性目的基因片段同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增,可以達(dá)到對(duì)多種細(xì)菌進(jìn)行同步檢測(cè)的目的,也可對(duì)多種類型的目的基因進(jìn)行分型研究.Francois等[7]采用免疫磁珠法收集金黃色葡萄球菌,利用針對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌mecA基因的特異性引物和針對(duì)金黃色葡萄球菌femA基因引物,同時(shí)用兩對(duì)引物對(duì)待測(cè)菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增.此方法大大提高了鑒定MRSA的準(zhǔn)確性.當(dāng)mecA和femA基因表達(dá)均為陽(yáng)性時(shí),可確定為MRSA.因此可與mecA基因陽(yáng)性的其他葡萄球菌屬進(jìn)行區(qū)分,此方法可同時(shí)鑒定MRSA、金黃色葡萄球菌和凝固酶陰性的葡萄球菌.鄭華妮等[8]根據(jù)金黃色葡萄球菌多種腸毒素基因的通用保守序列以及特異性序列,在3～4 h內(nèi)檢測(cè)出毒素基因A-E,檢測(cè)的效果良好,建立了金黃色葡萄球菌腸毒素A-E的多重PCR檢測(cè)法.

2.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)技術(shù)(real-time fluorescent PCR)是在常規(guī)PCR中引入液相雜交技術(shù)和熒光探針,在PCR每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物的過(guò)程中,實(shí)時(shí)檢測(cè)收集相對(duì)應(yīng)的熒光信號(hào),從而實(shí)現(xiàn)樣品(如病原菌)的定性或定量檢測(cè).因?yàn)橹恍铏z測(cè)出熒光強(qiáng)度的即時(shí)變化就可測(cè)出樣品基因的拷貝數(shù),具有快速、高特異性和高靈敏度,目前應(yīng)用比較廣泛.

蘇明權(quán)等[9]以金黃色葡萄球菌特異性femB基因序列設(shè)計(jì)引物和探針,并利用基因重組技術(shù)構(gòu)建了定量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品,建立了實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)金黃色葡萄球菌的方法,將模擬標(biāo)本與分離培養(yǎng)進(jìn)行了對(duì)比,兩者符合率為100%.表明所建立的方法具有較好的特異性、靈敏度、穩(wěn)定性和重復(fù)性.

2.3.3 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

2000年,日本科學(xué)家Notomi建立了一種新型的核酸擴(kuò)增技術(shù),即環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification,LAMP).其基本原理是針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域,設(shè)計(jì)4條特異性引物,恒溫條件,在鏈置換DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)作用下幾十分鐘就可擴(kuò)增出109～1010靶序列拷貝.核酸大量合成時(shí),大量的焦磷酸根離子從dNTP中釋放,與反應(yīng)體系中Mg2+形成了豐富的副產(chǎn)物焦磷酸鎂沉淀,可被肉眼觀察.與此同時(shí),也可以通過(guò)在體系中直接添加環(huán)引物(loop)來(lái)加快反應(yīng)的速率[10].LAMP技術(shù)具有高特異性、高靈敏性、簡(jiǎn)便快速和成本低等特點(diǎn).此技術(shù)已在動(dòng)物疫病的診斷、動(dòng)物胚胎的性別鑒定和轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)等領(lǐng)域得到了日益廣泛的應(yīng)用.

2.3.4 基因芯片檢測(cè)

生物芯片技術(shù)是20世紀(jì)90年代中期以來(lái)影響最深遠(yuǎn)的重大科技進(jìn)展之一,是融微電子學(xué)、生物學(xué)、物理學(xué)、化學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)為一體的高度交叉性新技術(shù),是基礎(chǔ)研究最有效的工具.利用基因芯片技術(shù)于臨床微生物鑒定方面,將大大提高菌株的陽(yáng)性檢出率,縮短檢驗(yàn)時(shí)間,具有現(xiàn)實(shí)的臨床意義.1996年,世界上第一塊商業(yè)化DNA芯片的問(wèn)世,標(biāo)志著基因芯片技術(shù)進(jìn)入廣泛研究和應(yīng)用的階段,此技術(shù)具有傳統(tǒng)檢測(cè)方法無(wú)法比擬的優(yōu)越性.

2.4 金黃色葡萄球菌各種檢測(cè)技術(shù)的比較

本文對(duì)各種金黃色葡萄球菌檢測(cè)技術(shù)在優(yōu)缺點(diǎn)以及應(yīng)用領(lǐng)域等方面進(jìn)行了比較,結(jié)果如表1.

2.5 金黃色葡萄球菌檢測(cè)常用的特異性基因

本文將常用的金黃色葡萄球菌檢測(cè)特異性基因進(jìn)行了總結(jié),結(jié)果如表2.

3 總結(jié)與展望

金黃色葡萄球菌致病性和侵襲力強(qiáng),其耐甲氧西林金黃色葡萄球菌株已成為主要致病菌.傳統(tǒng)的檢測(cè)金黃色葡萄球菌的方法費(fèi)時(shí)耗力,已經(jīng)難以滿足社會(huì)的需求.金黃色葡萄球菌檢測(cè)技術(shù)將向著更快速、更簡(jiǎn)易、更準(zhǔn)確的方向發(fā)展.顯色培養(yǎng)基具有靈敏、特異、簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn),雖存在假陽(yáng)性與假陰性菌株的干擾,但與其他方法聯(lián)用時(shí)可提高檢測(cè)準(zhǔn)確率;快速測(cè)試片法既具備了顯色培養(yǎng)基的優(yōu)點(diǎn),又方便快捷,成本低廉,可定量,雖然受載體材料對(duì)于計(jì)數(shù)的影響,但不影響對(duì)于金黃色葡萄球菌的定性,適合于基層單位的快速檢測(cè);免疫學(xué)方法則在對(duì)于基質(zhì)復(fù)雜的樣品檢測(cè)表現(xiàn)出一定的優(yōu)越性,其中酶聯(lián)免疫的商品化的試劑盒只能檢測(cè)到SEA～SEE,不能檢測(cè)新型的SE,且無(wú)法同時(shí)檢測(cè)多種類型的SE,與其他的方法相結(jié)合(如化學(xué)發(fā)光法等),可以達(dá)到提高檢測(cè)的靈敏度;熒光定量PCR比常規(guī)PCR靈敏度和特異性更高,更快速,但由于成本較高,使用上仍然受到限制,適用于要求特異性與靈敏度較高的定量檢測(cè);多重PCR可同時(shí)檢測(cè)多種病原菌,若與Real-time PCR相結(jié)合,不失為高效檢測(cè)金黃色葡萄球菌以及其他致病菌的另一途徑;LAMP方法不僅在檢測(cè)的特異性和靈敏度上表現(xiàn)突出,其操作十分簡(jiǎn)便,設(shè)備僅需要恒溫儀器,檢測(cè)迅速,60 min內(nèi)即可完成檢測(cè),檢測(cè)結(jié)果肉眼可見(jiàn),成本低廉.雖存在引物設(shè)計(jì)上的復(fù)雜性以及基質(zhì)復(fù)雜的樣品檢測(cè)存在一定的局限性,但LAMP法作為一種基層現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)金黃色葡萄球菌的方法,具有良好的應(yīng)用前景.

表1 金黃色葡萄球菌各種檢測(cè)技術(shù)的比較Tab.1 Comparison of Staphylococcus aureus detection technologies

表2 金黃色葡萄球菌檢測(cè)的特異性基因Tab.2 Detection of specific genes of Staphylococcus aureus

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