劉偲琪, 方佳茂, 劉紅梅, 杜金華, 孫中濤,*

(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東泰安 271018;2.廣東環(huán)西生物科技股份有限公司,廣東普寧 515300;3.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山東泰安 271018)

我國是世界上最大的蠶絲生產(chǎn)國,作為蠶絲生產(chǎn)的副產(chǎn)物,鮮蠶蛹年產(chǎn)量高達(dá)50萬t以上,占世界總產(chǎn)量的70%.蠶蛹不僅蛋白質(zhì)含量高達(dá)45%～50%,氨基酸組成合理,而且還具有保護(hù)肝臟、提高免疫力、促進(jìn)生長、降低血糖和血壓及抗癌等多種藥理作用[1].然而,蠶蛹蛋白的溶解性、乳化性和起泡性等物化特性較差,還具有特殊的氣味,限制了它在食品工業(yè)中的應(yīng)用.因此,蠶蛹目前除小部分被直接食用外,大部分被用作飼料與肥料,其資源價(jià)值未能得到充分利用[2].

對動植物蛋白原料進(jìn)行適度酶解是改善其溶解性、乳化性和起泡能力等物化性質(zhì)和提高抗氧化能力等生理活性的常用方法[3].通過酶解改性提高蠶蛹資源的利用率,提升其資源價(jià)值得到許多學(xué)者的關(guān)注.蠶蛹蛋白酶解物主要成分是蠶蛹肽和少量游離氨基酸.目前已有許多研究致力于蛋白酶的選擇與酶解工藝的優(yōu)化,以提高水解度與產(chǎn)品得率,但尚未涉及水解度對蠶蛹蛋白酶解物的溶解性、乳化性和起泡能力等物化特性與抗氧化能力的影響[4-5],這導(dǎo)致蠶蛹蛋白酶解時(shí)盲目追求高水解度,而不能按照產(chǎn)品的具體要求對水解度進(jìn)行合理控制.

本研究采用蛋白酶對蠶蛹蛋白進(jìn)行不同程度的水解,獲得不同水解度的蠶蛹蛋白酶解物,并對其溶解性、乳化性、起泡能力與抗氧化能力進(jìn)行測定,以確定水解度對其物化特性和抗氧化能力的影響,為蠶蛹蛋白酶解過程中對水解度進(jìn)行合理控制提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蠶蛹蛋白粉(脫脂蠶蛹)從泰安信得利生物工程有限公司購買,其蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為66%.復(fù)合蛋白酶由濟(jì)寧和美生物工程有限公司生產(chǎn),其酶系組成為堿性蛋白酶1×105U/g,中性蛋白酶5×104U/g.1,1-二苯基-2-苦肼基自由基(DPPH)與水楊酸購自Sigma公司,其他試劑均為國產(chǎn)分析純試劑.

1.2 儀器與設(shè)備

pHS-3C型數(shù)字酸度計(jì) ,上海雷磁儀器廠;電子天平,上海恒平科學(xué)儀器有限公司;數(shù)顯恒溫水浴鍋,國華電器有限公司;磁力攪拌器,國華電器有限公司;離心機(jī),上海安亭科學(xué)儀器廠;恒溫振蕩器,太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠;UV2800型紫外可見分光光度計(jì),上海精密科學(xué)儀器有限公司;實(shí)驗(yàn)室小型噴霧干燥機(jī),上海達(dá)成實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司.

1.3 蠶蛹蛋白的酶解

稱取50 g蠶蛹蛋白粉,加入350 mL去離子水,攪拌均勻,90℃水浴加熱10 min使蛋白質(zhì)適度變性,然后冷卻至55℃,加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的復(fù)合蛋白酶,于55℃進(jìn)行酶解,酶解結(jié)束后,升溫至90℃維持10 min進(jìn)行滅酶.酶解液經(jīng)真空抽濾獲得澄清濾液.濾液采用小型噴霧干燥機(jī)進(jìn)行噴霧干燥,進(jìn)口溫度200℃,出口溫度75℃.控制不同的酶解時(shí)間,可以獲得不同水解度的蠶蛹酶解物.

1.4 水解度的測定[6]

水解度(degree of hydrolysis,DH)是水解過程中所斷裂的肽鍵數(shù)占總肽鍵數(shù)的百分比.肽鍵斷裂后生成多肽或氨基酸,α-氨基氮含量增加,因此,水解度可根據(jù)水解過程中生成的α-氨基氮的數(shù)量,依據(jù)式(1)計(jì)算.

水解后生成的α-氨基氮的量采用甲醛滴定法測定,樣品總含氮量采用凱氏定氮法測定(參照國標(biāo)GB/T 23530—2009).

1.5 溶解性的測定

參考Parrado等[7]的測定方法.準(zhǔn)確稱取1.000 g蠶蛹蛋白酶解物,溶于99 mL去離子水中,配成1%的溶液,采用2 mol/L HCl或NaOH調(diào)節(jié)至所需的pH值,攪拌均勻,4 000 r/min離心30 min,測定上清液的氮含量.溶解性等于上清液氮含量與原始溶液氮含量的比值,通常以百分?jǐn)?shù)的形式表示.

1.6 乳化性的測定

參考Klompong等[8]的測定方法并稍有改動.將30 mL 1%的蠶蛹蛋白酶解物溶液與10 mL植物油混勻,采用2 mol/L HCl或NaOH調(diào)節(jié)至所需的pH值,用高速剪切乳化機(jī)以10 000 r/min的速度均質(zhì)1 min,制得乳狀液.分別在0,10 min時(shí)從底部吸取100 μL乳狀液,加入10 mL 0.1%的SDS(十二烷基硫酸鈉)溶液中,混勻,以0.1%的SDS作空白對照,測定其在500 nm處的吸光度A0和A10.A0即為乳化性(EA),乳化穩(wěn)定性(ES)用式(2)計(jì)算.

1.7 起泡性的測定

參考Klompong等[8]的測定方法并稍有改動.配制0.5%的蠶蛹蛋白酶解物溶液,采用2 mol/L HCl或NaOH調(diào)節(jié)至所需的pH值,吸取20 mL,用攪拌器攪拌20 min,記錄0 min與10 min時(shí)泡沫的體積A0與At.起泡性FC=(A0-B)/B×100%;起泡穩(wěn)定性用式(3)計(jì)算.式(3)中B為攪拌之前的體積.

1.8 抗氧化能力測定

1.8.1 還原力

采用Osawa等[9]的方法.吸取1.0 mL不同濃度的蠶蛹蛋白酶解物溶液,加入2.5 mL 0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液和2.5 mL 1%的鐵氰化鉀溶液,充分混合,于50℃保溫20 min,再加入2.5 mL 10%的三氯乙酸,充分混合后于3 000 r/min離心10 min.取2.5 mL上清液,加入2.5 mL蒸餾水和2.5 mL 0.l%FeCl3溶液,然后在700 nm波長下測定吸光度A700.

1.8.2 DPPH自由基清除能力

采用Yamagucei等[10]的方法.取2 mL不同濃度的蠶蛹蛋白酶解物溶液,添加至2 mL 0.2 mmol/L的DPPH的95%乙醇溶液中,混合均勻,室溫下放置30 min,于517 nm處測定吸光值A(chǔ)1.以95%乙醇溶液代替DPPH乙醇溶液,按上述方法測定吸光度A2,以蒸餾水代替蠶蛹蛋白酶解物溶液,按上述方法測定吸光度A3.DPPH自由基清除能力按式(4)計(jì)算.

1.8.3 超氧陰離子自由基清除能力

采用Nicholas等[11]的方法并稍加改動.向4.5 mL 0.05 mol/L的Tris-HCl(pH 8.2)緩沖液中加入1.0 mL蠶蛹蛋白酶解物溶液(空白組加入相同體積的蒸餾水),再加入0.3 mL 0.03 mol/L的鄰苯三酚溶液(以0.01 mol/L的HCl配制),振蕩3 min,加入50 μL 10%抗壞血酸溶液,混合均勻,迅速于325 nm處測定吸光度As(空白組的吸光度A0),并按式(5)計(jì)算超氧陰離子自由基清除能力.

1.8.4 羥基自由基清除能力[12]

取2 mL不同濃度的蠶蛹蛋白酶解物溶液(0.5～2.5 mg/mL),依次加入2 mL 6 mmol/L的硫酸亞鐵、2 mL 6 mmol/L的H2O2,混合均勻,靜置10 min,再加入2 mL 6 mmol/L的水楊酸,混勻、靜置30 min后于510 nm處測吸光度Ai.空白組以雙蒸水代替水楊酸,按上述方法測定吸光度Aj,對照組以雙蒸水代替蠶蛹蛋白酶解物溶液,按上述方法測定吸光度A0.羥自由基清除能力按式(6)計(jì)算.

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解時(shí)間對水解度的影響

蠶蛹蛋白酶解過程中水解度的變化曲線如圖1.酶解初期蛋白質(zhì)水解速度很快,水解度迅速上升,12 h后水解速率變緩,這與Jamdar等[13]報(bào)道的花生蛋白的酶解曲線類似.酶解過程中蛋白酶活力損失,酶解產(chǎn)物的反饋抑制作用和可被水解的肽鍵濃度降低均可導(dǎo)致水解速度下降,但后者是導(dǎo)致水解速率降低的主要原因[14].各種水解度的酶解物可以通過控制不同酶解時(shí)間來獲得,制備水解度為5%,15%,25%和35%的蠶蛹蛋白酶解物所需的酶解時(shí)間分別為90 min,6 h,10 h與16 h.

2.2 水解度對溶解性的影響

圖1 酶解時(shí)間與水解度的關(guān)系Fig.1 Effect of hydrolysis time on DH

不同水解度的蠶蛹蛋白酶解物在pH值為2～10時(shí)的溶解性如圖2.蠶蛹蛋白酶解后溶解性顯著提高,且水解度越大溶解性越好.這和花生蛋白、鮭魚蛋白酶解物的溶解性與水解度的相關(guān)性是一致的[13,15].提高水解度可以改善溶解性,是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)水解成肽后,親水基團(tuán)得到充分暴露,疏水性基團(tuán)的疏水作用力被親水基團(tuán)的親水作用力平衡,使溶解性增強(qiáng)[16].未經(jīng)酶解的蠶蛹蛋白在堿性條件及pH值小于3的條件下具有較好的溶解性,但受等電點(diǎn)效應(yīng)的影響,蠶蛹蛋白在pH值為4～6時(shí)溶解性較差[17].蠶蛹蛋白經(jīng)適度水解后,等電點(diǎn)效應(yīng)不再明顯,在pH值為4～6時(shí)的溶解性得到顯著改善,當(dāng)水解度≥35%時(shí),溶解性接近100%.

圖2 水解度與蠶蛹蛋白酶解物溶解性的關(guān)系Fig.2 Effect of DH on solubility of silkworm pupa protein hydrolysates

2.3 水解度對乳化性的影響

水解度對蠶蛹蛋白酶解物乳化性(EA)和乳化穩(wěn)定性(ES)的影響如圖3.蠶蛹蛋白水解后乳化性與乳化穩(wěn)定性在pH值為5～9時(shí)均有不同程度的降低,這種現(xiàn)象也見于鮭魚肌肉蛋白的酶解物[18],其原因可能是酶解后肽鏈變短,使溶液界面張力下降,不能在油-水界面形成高黏彈性的保護(hù)膜.然而,水解度為5%的蠶蛹蛋白酶解物在pH值為3時(shí)的乳化性高于蠶蛹蛋白,這可能是因?yàn)樵谒獬跗诘鞍踪|(zhì)疏水性增加,溶液的黏度下降,阻止了膠束周圍的小油滴的形成,從而提高了其乳化活性[17].

圖3 水解度與蠶蛹蛋白酶解物乳化性與乳化穩(wěn)定性的關(guān)系Fig.3 Effect of DH on emulsifying activity and emulsifying stability of silkworm pupa protein hydrolysates

2.4 水解度對起泡性的影響

水解度對蠶蛹蛋白酶解物起泡能力(FC)和起泡穩(wěn)定性(FS)的影響如圖4.在酸性和中性條件下(pH值為3～7),蠶蛹蛋白酶解后起泡能力顯著增強(qiáng),在水解度為5%時(shí),起泡能力最強(qiáng),此后隨著水解度的增加,起泡能力降低.其原因是起泡性受表面張力的影響,蛋白質(zhì)輕度水解后溶液黏度與表面張力降低,對泡沫的形成比較有利;但水解度較高時(shí),酶解產(chǎn)物的分子量過小,溶液黏度與表面張力過低,起泡能力反而下降.但在堿性pH值時(shí),蠶蛹蛋白酶解后起泡能力反而下降,其原因可能是蠶蛹蛋白在堿性條件下溶解性好,起泡性也比較高,酶解后分子量降低,溶液黏度和表面張力降低,起泡能力反而下降.水解度對起泡穩(wěn)定性的影響也十分顯著(p＜0.01),水解度為5%時(shí)起泡穩(wěn)定性遠(yuǎn)高于蠶蛹蛋白和其他水解度時(shí)的酶解物,這說明輕度水解有利于提高起泡穩(wěn)定性,但深度水解時(shí)產(chǎn)物分子量小,溶液黏度與表面張力過低,不利于溶液的起泡穩(wěn)定性.

圖4 水解度與蠶蛹蛋白酶解物起泡性與起泡穩(wěn)定性的關(guān)系Fig.4 Effect of DH on foaming activity and foaming stability of silkworm pupa protein hydrolysates

2.5 水解度對還原力的影響

還原力是抗氧化劑提供電子或氫的能力,與其抗氧化活性有直接的關(guān)系.水解度對蠶蛹蛋白酶解物還原力的影響如圖5.蠶蛹蛋白酶解后還原力顯著提高,水解度為5%時(shí),還原力最大,此后再增加水解度,還原力反而下降.蕎麥蛋白酶解時(shí),水解度對還原力的影響也存在類似的規(guī)律,在水解度為5%時(shí)還原力最大[19].不同水解度的蠶蛹蛋白酶解物在2.5 mg/mL時(shí)還原力為0.107～0.170,與相同濃度時(shí)鷹嘴豆蛋白酶解物的還原力相同,但比苜蓿葉蛋白和花生蛋白酶解物的還原力稍低[13、20-21].

2.6 水解度對DPPH自由基清除能力的影響

圖5 水解度與蠶蛹蛋白酶解物還原力的關(guān)系Fig.5 Effect of DH on reducing power of silkworm pupa protein hydrolysates

DPPH自由基在乙醇溶液中穩(wěn)定,且在517 nm處有較強(qiáng)的吸光度,可通過簡單的方法進(jìn)行定量檢測,已廣泛應(yīng)用于測定天然抗氧化劑的抗氧化能力.水解度對蠶蛹蛋白酶解物DPPH自由基清除能力的影響如圖6,水解度為5%時(shí)DPPH自由基清除能力最強(qiáng);在5%～25%的水解度范圍內(nèi)蠶蛹蛋白酶解物均具有較高的DPPH自由基清除能力,但水解度增加至35%時(shí),DPPH自由基清除力降低顯著(p＜0.1).黃條紋鲹蛋白酶解物的DPPH自由基清除能力也具有類似的變化規(guī)律[8],但花生蛋白酶解物[13]的水解度越高DPPH自由基清除能力越強(qiáng),這說明水解度對DPPH自由基清除能力的影響十分復(fù)雜,與蛋白質(zhì)原料和蛋白酶種類有關(guān).

圖6 水解度與蠶蛹蛋白酶解物DPPH自由基清除能力的關(guān)系Fig.6 Effect of DH on DPPH radical scavenging ability of silkworm pupa protein hydrolysates

2.7 水解度對超氧陰離子自由基清除能力的影響

超氧陰離子自由基毒性很強(qiáng),可以通過歧化等化學(xué)反應(yīng)生成羥基自由基和過氧化氫,引起DNA和細(xì)胞膜損傷,對超氧陰離子自由基的清除能力是表征抗氧化劑的抗氧化能力的一個重要指標(biāo).水解度對蠶蛹蛋白酶解物超氧陰離子自由基清除能力的影響如圖7.水解度較低時(shí),超氧陰離子自由基清除能力隨水解度的升高而增大,水解度15%時(shí)達(dá)到最大,繼續(xù)增大水解度,超氧陰離子自由基清除能力反而下降.據(jù)Zhang等[22]報(bào)道,花生蛋白輕度水解時(shí)超氧陰離子自由基清除能力也隨著水解度的上升而增加,這與本研究的結(jié)果是一致的,但其實(shí)驗(yàn)中花生蛋白的水解度均較小,未能觀察到超氧陰離子自由基清除能力到達(dá)最大值后會隨著水解度上升而下降的現(xiàn)象.

2.8 水解度對羥基自由基清除能力的影響

羥基自由基十分活躍,具有潛在的毒性,在人體內(nèi)很容易與氨基酸、蛋白質(zhì)和DNA發(fā)生反應(yīng)并導(dǎo)致生理上的紊亂.如圖8所示,蠶蛹蛋白酶解后清除羥基自由基的能力顯著提高(p＜0.05),水解度5%時(shí)羥基自由基清除能力最大,繼續(xù)增大水解度羥基自由基的清除能力反而下降,但下降的速度十分緩慢,至水解度35%時(shí),羥基自由基清除能力與最大值相比僅下降3.8%,仍比蠶蛹蛋白高30.64%.據(jù)You等[23]報(bào)道,泥鰍蛋白水解時(shí)羥基自由基清除力也隨著水解度上升而增加,至水解度23%時(shí)達(dá)到最大,之后再增加水解度,羥基自由基清除能力開始下降,這一規(guī)律和本研究結(jié)果是一致的.

圖8 水解度與蠶蛹蛋白酶解物羥基自由基清除能力的關(guān)系Fig.8 Effect of DH on hydroxyl radical scavenging activity of silkworm pupa protein hydrolysates

3 結(jié) 論

研究了水解度對蠶蛹蛋白酶解物的溶解性、乳化性和起泡性等物化性質(zhì)的影響,以及水解度對蠶蛹蛋白酶解物的還原力,對DPPH自由基、超氧陰離子自由基和羥基自由基清除能力等抗氧化性質(zhì)的影響.在pH值為2～10時(shí),酶解可以顯著改善蠶蛹蛋白的溶解性,且水解度越大溶解性越好,水解度至35%時(shí),蠶蛹蛋白酶解物已可以完全溶解.蠶蛹蛋白酶解后乳化性與乳化穩(wěn)定性在pH值為5～9時(shí)均有不同程度的降低.蠶蛹蛋白酶解后起泡性和起泡穩(wěn)定性在水解度為5%時(shí)達(dá)到最高,繼續(xù)水解起泡性和起泡穩(wěn)定性反而下降.蠶蛹蛋白酶解后抗氧化性提高,水解度為5%時(shí),還原力和對DPPH自由基和羥基自由基清除能力最大,但水解度為15%時(shí)超氧陰離子自由基清除能力最大,過度水解反而不利于其抗氧化能力的提高.目前對動植物蛋白酶解工藝的研究多將提高水解度作為目標(biāo),未充分考慮水解度對酶解產(chǎn)物物化性質(zhì)與抗氧化能力等生理活性的影響,這樣做是欠妥的,水解過程應(yīng)根據(jù)生產(chǎn)目的控制一個最佳水解度,并非水解度越高越好.

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