朱桂玉

泰山學(xué)院生物與釀酒工程學(xué)院,山東泰安271021

雞卵巢中ANXA2基因表達(dá)調(diào)控研究

朱桂玉

泰山學(xué)院生物與釀酒工程學(xué)院,山東泰安271021

ANXA2基因?qū)儆谀ぢ?lián)蛋白家族一員，N-末端區(qū)域包含調(diào)控PKC通路中酪氨酸和色氨酸兩種蛋白激酶磷酸化的位點(diǎn)，曾有研究發(fā)現(xiàn)ANXA2基因在高產(chǎn)蛋雞卵巢中出現(xiàn)了顯著性高表達(dá)。因此，本實(shí)驗(yàn)利用熒光定量PCR方法，研究了ANXA2基因在雞卵巢和各等級(jí)卵泡中的表達(dá)規(guī)律，發(fā)現(xiàn)此基因在開產(chǎn)雞卵巢中表達(dá)升高，并隨卵泡發(fā)育表達(dá)上調(diào)，排卵后表達(dá)量出現(xiàn)顯著性下降。通過(guò)分離培養(yǎng)雞卵泡的膜細(xì)胞，添加促卵泡生長(zhǎng)素（FSH）和促黃體素（LH）處理，提取細(xì)胞RNA和利用熒光定量PCR方法，發(fā)現(xiàn)此基因的表達(dá)升高與FSH的調(diào)控有關(guān)，卻與LH無(wú)關(guān)。此作用的具體分子機(jī)制，還待于今后進(jìn)一步的研究。

熒光定量PCR;膜聯(lián)蛋白Ⅱ;雞;卵巢

膜聯(lián)蛋白(ANXA)是一類依賴Ca2+的磷脂結(jié)合蛋白家族，現(xiàn)已在人類基因組中發(fā)現(xiàn)了13個(gè)膜聯(lián)蛋白亞家族成員。膜聯(lián)蛋白羧基端結(jié)構(gòu)域含有Ca2+結(jié)合位點(diǎn)和磷酸化位點(diǎn)，其中磷酸化位點(diǎn)區(qū)域保守，而鈣結(jié)合位點(diǎn)在不同膜聯(lián)蛋白中差異較大[1]。

細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高時(shí)，膜聯(lián)蛋白可溶性的單體會(huì)在胞質(zhì)中形成三聚體，在膜界面上集合成更有序的結(jié)構(gòu)。Ca2+是胞內(nèi)主要的第二信使之一，在動(dòng)物繁殖過(guò)程中對(duì)精子獲能、頂體反應(yīng)、卵母細(xì)胞成熟、受精及卵裂等一系列復(fù)雜的過(guò)程有非常重要的影響[2]。所以，在哺乳動(dòng)物中，膜聯(lián)蛋白除了參與囊泡運(yùn)輸、促進(jìn)膜融合、調(diào)控炎癥反應(yīng)及細(xì)胞分化等重要生物功能外，其在生殖方面的作用也已引起了人們的重視。

小鼠中，ANXA1可通過(guò)抑制磷脂酶A2的活性來(lái)影響精子的頂體反應(yīng)、精卵融合等過(guò)程[3]。另外，制備的小鼠ANXA1多抗可使其體外受精率下降[4]。羊中，其頂體可能是ANXA1的儲(chǔ)備庫(kù)，此基因參與了羊精子與卵母細(xì)胞膜的融合啟動(dòng)[5]。人中，ANXA4基因在卵巢癌中存在著異常表達(dá)[6]。

前期，本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)高通量Illusion/Solexa測(cè)序，以未開產(chǎn)的（6周齡）白來(lái)航雞卵巢為對(duì)照組，在開產(chǎn)的（23周齡）雞卵巢中篩選到了大量差異表達(dá)基因，其中包括ANXA2基因。另外，前期我們研究發(fā)現(xiàn)ANXA2基因在高產(chǎn)蛋雞卵巢中出現(xiàn)了顯著性高表達(dá)。因此，本實(shí)驗(yàn)著重研究了ANXA2基因在雞卵巢發(fā)育中的表達(dá)規(guī)律以及促性腺激素對(duì)其表達(dá)調(diào)控作用，以期為雞產(chǎn)蛋性能的改良提供理論支持。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物未開產(chǎn)（6周齡）及開產(chǎn)（23周齡，規(guī)律產(chǎn)蛋2周以上）白來(lái)航雞各20只，宰殺后取整個(gè)卵巢和各級(jí)卵泡，迅速投入液氮，-70℃保存，用于RNA的提取及熒光定量PCR的表達(dá)分析等實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 主要試劑RNA提取試劑盒(Qiangen,USA)、SYBR Premix Ex Taq定量試劑盒(TaKaRa,Japan)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Roche,USA)、M199(Gibco,USA)、FSH與LH(Sigma,USA)。

1.2 引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank上雞ANXA2基因的mRNA序列(NM_205351.1)和持家基因GAPDH的mRNA序列(NM_204305.1)，在各自的跨外顯子區(qū)設(shè)計(jì)特異的熒光定量PCR引物，二對(duì)引物均由上海生物工程有限公司合成，引物序列見表1

表1 ANXA2和GAPDH基因的引物序列Table 1 Primers sequences of ANXA2 and GAPDH genes

1.3 RNA的提取與定量

根據(jù)Qiagen公司的RNA提取試劑盒說(shuō)明，分別提取卵巢組織、各等級(jí)卵泡、等級(jí)卵泡（F2-F4）的顆粒細(xì)胞、膜細(xì)胞及促性腺激素（FSH和LH）處理前后膜細(xì)胞的RNA，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定總RNA濃度及純度，A260/A280=1.8～2.0時(shí)，所得RNA-70℃保存，將所提取總RNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，可見所提取總RNA效果較好。

1.4 cDNA合成

根據(jù)Roche反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說(shuō)明，取1μg總RNA，以O(shè)ligo-dT18為引物，完成反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，最后反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物于-20℃保存。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real–time PCR)

在Stratagene Mx3000P熒光定量PCR儀上進(jìn)行熒光定量PCR分析，反應(yīng)利用Takara的熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行，15μL體系包括cDNA2μL，引物0.1μL，Rox0.3μL，反應(yīng)程序?yàn)?5℃10 min；95℃30 s，56℃30 s，72℃30 s；72℃讀板，40個(gè)循環(huán)。構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，驗(yàn)證所有引物的擴(kuò)增效率，目的基因跟持家基因擴(kuò)增效率均要達(dá)到90%～100%之間，檢看它們是否具有線性擴(kuò)增的關(guān)系。以GAPDH為內(nèi)參，至少做6個(gè)重復(fù)，最后用2-△△CT的方法計(jì)算基因的表達(dá)相對(duì)量。

1.6 顆粒細(xì)胞、膜細(xì)胞的分離培養(yǎng)與激素處理

取產(chǎn)蛋高峰期母雞，處死后剖開腹腔，取下整個(gè)卵巢，放進(jìn)盛有青鏈霉素的PBS液的滅菌燒杯中。根據(jù)Gilbert文獻(xiàn)[7]介紹方法，分別剝離排卵前等級(jí)卵泡（F2-F4）的顆粒細(xì)胞層和膜細(xì)胞層，剪碎后，分別加入0.1%Ⅱ型膠原酶，放入37℃CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行消化。其中，顆粒細(xì)胞消化時(shí)間為6 min左右，膜細(xì)胞消化時(shí)間為20 min左右。然后，用200目銅網(wǎng)過(guò)濾離心，收集細(xì)胞沉淀，分別提取顆粒細(xì)胞和膜細(xì)胞的RNA，用于ANXA2基因定量表達(dá)分析。一部分膜細(xì)胞，按2×106密度接種于24孔培養(yǎng)板中，38℃靜置培養(yǎng)，CO2濃度5%，然后分別添加5 ng/mL、10 ng/mL、50 ng/mL的FSH與LH進(jìn)行處理24 h，然后倒掉培養(yǎng)基，用PBS沖洗后裂解提取細(xì)胞中的RNA。

1.7 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各組數(shù)據(jù)用平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)誤表示，不同組之間利用單因素方差A(yù)NOVA和鄧肯式檢驗(yàn)進(jìn)行，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 提取RNA的質(zhì)量鑒定

如圖1所示，總RNA的凝膠電泳結(jié)果顯示清晰的28S與18S條帶，說(shuō)明RNA完整無(wú)降解。

圖1 總RNA電泳結(jié)果Fig.1 Gel electrophoresis of total RNA

2.2 ANXA2基因在雞不同發(fā)育階段卵巢組織中的表達(dá)

從圖2可以看出，ANXA2基因在未開產(chǎn)雞卵巢（6周齡）中表達(dá)較低，而在雞開產(chǎn)卵巢（23周齡）中出現(xiàn)了顯著性高表達(dá)（P＜0.05）。

2.3 ANXA2基因在雞開產(chǎn)卵巢各級(jí)卵泡中的表達(dá)

如圖3所示，ANXA2基因表達(dá)在小白卵泡（small-white follicle,SWF）中的表達(dá)較低，隨著卵泡發(fā)育成熟，其表達(dá)量在F1（the first-largest follicle）卵泡中出現(xiàn)了極顯著性增高，而排卵后卵泡（the first post-ovalutory follicle,POF1）表達(dá)量出現(xiàn)了顯著性下調(diào)（P＜0.05）。

圖2 ANXA2基因在不同發(fā)育階段雞卵巢組織中的表達(dá)，字母不同者表示差異顯著(P＜0.05),以下同F(xiàn)ig.2 The levels of ANXA2 gene expression in diff erent developmental stages of chicken ovary.Bars with different superscript letters are significantly d ifferent(P＜0.05),the same as below

圖3 ANXA2基因在雞卵巢不同等級(jí)卵泡中的表達(dá)Fig.3 The levels of ANXA2 gene expression in different developmental follicles of chicken ovary

2.4ANXA2基因在卵泡顆粒細(xì)胞和膜細(xì)胞中的表達(dá)

分離培養(yǎng)排卵前等級(jí)卵泡（F2-F4）中的顆粒細(xì)胞和膜細(xì)胞，如圖4所示，研究發(fā)現(xiàn)ANXA2基因在等級(jí)卵泡中的膜細(xì)胞出現(xiàn)了顯著性高表達(dá)，而在顆粒細(xì)胞中表達(dá)較低。

2.5 FSH和LH對(duì)ANXA2基因表達(dá)調(diào)控的作用

分離培養(yǎng)排卵前等級(jí)卵泡（F2-F4）的膜細(xì)胞，添加高、中、低三種不同濃度(ng/mL)的FSH和LH進(jìn)行處理，24 h后，收集細(xì)胞，通過(guò)熒光定量PCR發(fā)現(xiàn)三種濃度的FSH均能上調(diào)ANXA2基因的表達(dá)，用10 ng/mL的FSH處理后，出現(xiàn)了顯著性表達(dá)升高。與此相反，低和中等濃度的LH處理后，ANXA2基因的表達(dá)卻出現(xiàn)了顯著性下調(diào)，如圖5所示。

圖4 ANXA2基因在卵泡顆粒細(xì)胞和膜細(xì)胞中的表達(dá)(A)顆粒細(xì)胞;(B)膜細(xì)胞;(C)ANXA2基因在膜細(xì)胞和顆粒細(xì)胞中的表達(dá)(放大倍數(shù):200x)Fig.4 The level of of ANXA2 gene expression in the granulosa cells and theca cells (A)The granulosa cells;(B)The theca cells;(C)The expression ofANXA2 mRNA in the theca and granulose cells(The number of magnification:200x)

圖5 不同濃度的FSH和LH對(duì)ANXA2基因表達(dá)的影響Fig.5 Effects of different concentrations of FSH and LH on ANXA2 expression in theca cells

3 討論與結(jié)論

卵巢是雌性動(dòng)物的重要生殖器官，卵巢的功能是產(chǎn)生卵以及類固醇激素。卵泡是卵巢結(jié)構(gòu)和功能的基本單位，卵泡發(fā)育是一個(gè)伴隨著顆粒細(xì)胞增殖分化，內(nèi)膜細(xì)胞出現(xiàn)及卵母細(xì)胞成熟的過(guò)程。這個(gè)過(guò)程中各種因子和細(xì)胞相互作用，協(xié)同增殖和分化，間接或直接參與調(diào)節(jié)卵泡發(fā)生和發(fā)育直至排卵[8]。在畜牧業(yè)生產(chǎn)中，研究禽類卵巢以及卵泡發(fā)育調(diào)控機(jī)制對(duì)于提高家禽的繁殖性能，改善蛋禽的產(chǎn)蛋性能，提高生產(chǎn)效率具有重要意義[9]。

禽類卵巢與哺乳動(dòng)物存在很大差別，成熟的禽類卵巢外觀象一串葡萄，含有發(fā)育不同階段的許多卵泡。性成熟后，排卵周期中的卵巢體積非常大，卵巢皮質(zhì)常含有4～6個(gè)伸向腹腔的體積依次遞減的最大直徑可達(dá)40 mm的等級(jí)卵泡（分別用F1、F2、F3…表示）和無(wú)數(shù)等級(jí)前小白卵泡（the small-white follicle,SWF），以及排卵后卵泡(the post-ovulatory follicle,POF)等卵泡組成[10]。在雞的產(chǎn)蛋期，為了維持每天的排卵進(jìn)程，在一個(gè)產(chǎn)蛋序列中必須每天有一個(gè)卵泡從等級(jí)前卵泡池中被募集出來(lái)，進(jìn)入排卵前的快速發(fā)育階段，直至發(fā)育成熟排卵。因此，鳥類成熟卵泡可能是高等脊椎動(dòng)物中生長(zhǎng)最快的結(jié)構(gòu)，小卵泡在幾天內(nèi)可增長(zhǎng)150～200倍[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，在雞中，隨卵巢和卵泡的發(fā)育成熟，ANXA2基因出現(xiàn)了顯著性上調(diào)表達(dá)，而排卵后其表達(dá)出現(xiàn)了顯著性的下調(diào)。在豬和大鼠中，Cui等[12]研究發(fā)現(xiàn)此基因也隨卵母細(xì)胞成熟和早期胚胎發(fā)育進(jìn)行了高表達(dá)，尤其是在減數(shù)分裂的生發(fā)泡期。Yang等曾以蛋雞和肉雞的母系雞卵巢為高產(chǎn)蛋率雞和低產(chǎn)蛋率雞模型，分別建立了兩個(gè)相應(yīng)的CDNA文庫(kù)。最后，在高產(chǎn)蛋率雞卵巢中共篩選出了4個(gè)高表達(dá)的基因，其中就包括ANXA2基因[13]。有研究表明，ANXA2基因的羧基核心區(qū)包括Ca2+和F-肌動(dòng)蛋白等重要因子的結(jié)合位點(diǎn)[14]，而卵母細(xì)胞的成熟尤其是第二次減數(shù)分裂的啟動(dòng)恢復(fù)都需要Ca2+的參與。另?yè)?jù)研究表明，ANXA2基因主要參與了細(xì)胞的胞吐、膜蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)、纖維蛋白溶解以及血管的形成等生理過(guò)程[15]。在雞中，從小白卵泡發(fā)育到最大卵泡，卵泡組織需要發(fā)生較大的動(dòng)態(tài)變更，此過(guò)程要求細(xì)胞外基質(zhì)發(fā)生不斷的降解、重建和大量供應(yīng)營(yíng)養(yǎng)的新血管生成。因此，我們推測(cè)隨雞卵泡成熟發(fā)育表達(dá)上調(diào)的ANXA2基因，有可能在促進(jìn)卵泡血管發(fā)育、激發(fā)卵母細(xì)胞成熟和卵泡細(xì)胞增殖等過(guò)程中起了重要作用。禽類排卵后的卵泡不形成真正的黃體，而是發(fā)生快速的吸收退化，這種退化對(duì)于下個(gè)卵子的排出及連續(xù)性產(chǎn)卵卻是必須的[16]。因此，我們推測(cè)ANXA2基因在排卵后卵泡表達(dá)顯著性下調(diào)可能與卵泡的這種退化吸收過(guò)程中不再需要大量胞外基質(zhì)的新建與新血管形成有關(guān)。

既然，ANXA2基因表達(dá)隨著卵泡發(fā)育成熟出現(xiàn)了顯著性升高，那么問(wèn)題是究竟哪種因子上調(diào)了ANXA2基因的表達(dá)呢？眾所周知，F(xiàn)SH和LH是兩種調(diào)控卵巢發(fā)育的促性腺激素。雌禽中，F(xiàn)SH主要促進(jìn)卵巢內(nèi)卵泡的生長(zhǎng)和發(fā)育，增加卵泡壁攝氧量，促進(jìn)沉積卵黃物質(zhì)，增加卵泡的重量和體積。研究發(fā)現(xiàn)，在雞產(chǎn)蛋期若注射FSH則可繼續(xù)促進(jìn)卵泡的生長(zhǎng)。產(chǎn)蛋率低下的母雞，注射FSH可增加小黃卵泡和大白卵泡的數(shù)量，減少閉鎖的小黃卵泡和大白卵泡的數(shù)量[17]。而LH主要作用是促進(jìn)卵泡成熟和排卵，刺激孕酮的分泌。LH能夠誘導(dǎo)成熟卵泡顆粒細(xì)胞和膜細(xì)胞中cAMP的升高，刺激類固醇激素的合成。卵泡發(fā)育至12～15 mm時(shí)，顆粒細(xì)胞開始呈現(xiàn)對(duì)LH刺激的反應(yīng)，而逐漸失去對(duì)FSH刺激的反應(yīng)[18,19]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)分離培養(yǎng)等級(jí)卵泡（F2-F4）膜細(xì)胞進(jìn)行FSH和LH處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)適當(dāng)濃度的FSH能夠顯著性刺激ANXA2基因上調(diào)表達(dá)，而LH卻對(duì)它的表達(dá)起了抑制作用。FSH和LH在雞卵巢中的精確而復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制，使卵泡能正常發(fā)育而排卵，本試驗(yàn)結(jié)果表明FSH和LH有可能利用了膜細(xì)胞中的不同的信號(hào)通路，激活了不同的轉(zhuǎn)錄因子，最終協(xié)同作用于ANXA2基因的轉(zhuǎn)錄激活與抑制。FSH和LH的受體FSHR和LHR都屬于G蛋白偶聯(lián)受體，其在膜細(xì)胞中的特異結(jié)合蛋白有可能傳導(dǎo)不同的信號(hào)來(lái)激活特異的轉(zhuǎn)錄因子[20]。今后，我們還將進(jìn)一步分析ANXA2的啟動(dòng)子序列中的順式作用元件，深入分析FSH和LH是如何達(dá)到相反的轉(zhuǎn)錄調(diào)控的。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)主要研究了ANXA2基因在雞卵巢成熟和卵泡發(fā)育中的表達(dá)規(guī)律，由于禽類卵巢和卵泡發(fā)育又受到自分泌－旁分泌的精準(zhǔn)調(diào)節(jié)，本實(shí)驗(yàn)表明卵泡膜細(xì)胞中ANXA2基因的上調(diào)受到了FSH的促進(jìn)?？傊?，通過(guò)以上研究，我們希望能為更系統(tǒng)、全面的揭示家禽卵泡發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)制，為篩選出有價(jià)值的DNA標(biāo)記及改善雞的繁殖性能和提高的持續(xù)產(chǎn)蛋能力等提供一定的理論基礎(chǔ)。

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The Expression and Regulation of ANXA2 Gene in the Chicken Ovary

ZHU Gui-yu
Department of Biology Science and Technology,Taishan University,Tai-an 271021,China

ANXA2 is a family member of the membrane-bound proteins.The N-terminal region contains the tyrosine and threonine phosphorylation sites for protein kinase activation in PKC pathway regulations.Previous studies showed that ANXA2 gene is overexpressed in hens with high ovulation efficiency.This paper has studied the expression patters of ANXA2 gene during the chicken ovary and follicles development by the real-time PCR.The results showed that the expression of ANXA2 increased with the chicken ovary maturation.In hierarchy follicles,ANXA2 mRNA increased significantly as follicular development proceeds in pre-ovulatory follicles,reached the peak expression at the time of ovulation then decreased significantly after ovulation.Then,the theca cells of pre-ovulatory follicles were isolated,and treated with different concentrations of FSH or LH.We found that the theca cell ANXA2 expression was stimulated by FSH but not LH.The molecular mechanism of theANXA2 regulation in chicken ovary should be studied further.

Real-time PCR;ANXA2;chicken;ovary

S831.2

A

1000-2324(2014)03-0347-05

2013-03-12

2013-04-05

山東省自然科學(xué)基金(ZR2013CQ002)

朱桂玉(1976-),女,講師,主要從事動(dòng)物繁殖育種工作.E-mail:zgy0706@163.com