李 岑，劉惠寧

（1.江蘇省揚(yáng)州市第一人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，江蘇 揚(yáng)州 225000；2.中南大學(xué)附屬湘雅醫(yī)院婦科，湖南 長沙 410000）

紫杉醇對絨癌JEG-3細(xì)胞增殖與凋亡的影響

李 岑1，2，劉惠寧2

（1.江蘇省揚(yáng)州市第一人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，江蘇 揚(yáng)州 225000；2.中南大學(xué)附屬湘雅醫(yī)院婦科，湖南 長沙 410000）

目的 該文圍繞紫杉醇對人絨毛膜癌細(xì)胞 JEG-3的增殖與凋亡的影響進(jìn)行研究。方法 通過 MTT法檢測細(xì)胞增殖及流式細(xì)胞術(shù)檢測不同濃度紫杉醇作用下細(xì)胞的凋亡及其對細(xì)胞周期的影響。結(jié)果 隨紫杉醇濃度的增加或時(shí)間的延長，JEG-3細(xì)胞增殖抑制率及凋亡率均增大，各組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論 該次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示紫杉醇在抑制絨癌細(xì)胞 JEG-3增殖及促凋亡方面均有顯著的作用。

紫杉醇；JEG-3細(xì)胞；增殖；凋亡

絨毛膜癌（choriocarcinoma，CC）是一種繼發(fā)于妊娠之后的滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤。取代以滋養(yǎng)細(xì)胞形成絨毛或水泡狀結(jié)構(gòu)，絨癌細(xì)胞呈片狀高度增生，并廣泛侵入子宮肌層，破壞子宮肌層內(nèi)血管，一方面造成組織缺血壞死，另一方面通過侵蝕血管，絨癌細(xì)胞隨血液轉(zhuǎn)移至肺、陰道等處并在轉(zhuǎn)移部位繼續(xù)侵蝕血管造成局部出血。區(qū)別于其他婦科惡性腫瘤，化療藥對絨癌的治療效果極好，F(xiàn)IGO評分低危的患者基本可全部治愈，高危患者治療失敗率也僅15%左右［1］。目前國內(nèi)常用的化療藥物有甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶（5-FU）等，其毒副作用較大，嘔吐等化療副反應(yīng)常導(dǎo)致患者無法堅(jiān)持全療程化療，且耐藥問題逐漸明顯［2］，故尋找新的、有效的、低毒反應(yīng)的治療絨癌藥物的需求逐漸迫切。紫杉烷類藥物是一種三環(huán)二萜化合物［3］，起初由Wani等從短葉紅豆杉的樹皮中分離出天然紫杉醇［4］，隨后，由法國羅納普朗克·樂安公司經(jīng)半合成漿果紫杉針葉中的提取物得到多西紫杉醇即半合成紫杉醇。最初，Harwitz等于20世紀(jì)70年代末初步揭示了紫杉醇獨(dú)特的抗腫瘤機(jī)制，此后，各國研究人員相繼證明了其在治療卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、肺癌、食管癌、乳腺癌及直腸癌等多種癌癥中的明確作用［5-6］及其作用機(jī)制［7］，這些研究結(jié)果被應(yīng)用于臨床，目前紫杉醇已成為晚期乳腺癌、小細(xì)胞肺癌、卵巢癌等治療的一線藥物。本研究的目的是通過研究紫杉醇影響絨癌 JEG-3細(xì)胞的增殖能力與誘導(dǎo)凋亡情況，為應(yīng)用紫杉醇治療絨癌提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株來源 人絨毛膜癌細(xì)胞系 JEG-3為北京中國科學(xué)院動(dòng)物研究所“計(jì)劃生育及生殖生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室”購得后于湘雅醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室傳代保存。

1.1.2 主要試劑 多西紫杉醇自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司購買；胎牛血清、RMPI-1640由湘雅醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供；胰蛋白酶購買于美國 Sigma公司。

1.2 絨癌細(xì)胞株 JEG-3細(xì)胞培養(yǎng) 在含有15%胎牛血清-RPMI1640培養(yǎng)液中貼壁培養(yǎng)JEG-3細(xì)胞。環(huán)境溫度37℃，CO2濃度5%，飽和濕度。隔天更換培養(yǎng)液一次。細(xì)胞覆蓋率達(dá)到 70%～80%時(shí)消化傳代，用對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 方法

1.3.1 MTT法檢測多西紫杉醇對 JEG-3細(xì)胞增殖的影響 實(shí)驗(yàn)分組：根據(jù)作用于細(xì)胞的多西紫杉醇濃度不同將實(shí)驗(yàn)分為7組，樣本數(shù) 4個(gè)（濃度分組：0.0、0.001、0.01、0.1、1、10、100 mg·L-1）。藥物作用時(shí)間分別為 24、48、72 h；實(shí)驗(yàn)方法：制備單細(xì)胞懸液→96孔板內(nèi)培養(yǎng)至貼壁生長→根據(jù)分組加入藥物溶液→繼續(xù)培養(yǎng) 24、48、72 h→MTT法測定細(xì)胞增殖抑制率。

1.3.2 流式細(xì)胞儀檢測多西紫杉醇對絨癌 JEG-3細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的影響 實(shí)驗(yàn)分組：根據(jù)作用于細(xì)胞的多西紫杉醇濃度不同將實(shí)驗(yàn)分為 4組。樣本數(shù)4個(gè)（濃度分組：0.0、0.001、0.01、0.1 mg· L-1）。藥物作用時(shí)間分別為：24、48 h；實(shí)驗(yàn)方法：制備單細(xì)胞懸液→培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)至貼壁生長→根據(jù)分組加入藥物溶液→繼續(xù)培養(yǎng) 24、48 h→將培養(yǎng)瓶內(nèi)細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液并固定細(xì)胞→細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期情況檢測（由流式細(xì)胞儀完成）。

1.4 數(shù)據(jù)整理與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)經(jīng) SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件統(tǒng)計(jì)分析，組內(nèi)數(shù)據(jù)行正態(tài)分布性檢驗(yàn)，組間數(shù)據(jù)經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)后行方差分析；Spearman分析各變量之間的相關(guān)性；IC50用probit回歸分析計(jì)算，P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 MTT法檢測 JEG-3細(xì)胞增殖抑制率 見表1。用不同濃度多西紫杉醇處理 JEG-3細(xì)胞 24、48 和72 h后的細(xì)胞增殖抑制率。各多西紫杉醇作用組細(xì)胞增殖抑制率與空白對照組比較（P＜0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義）。同一濃度多西紫杉醇作用下，時(shí)間延長與細(xì)胞增殖抑制率與同一作用時(shí)間下，多西紫杉醇濃度增加與細(xì)胞增殖抑制率均呈直線相關(guān)（P ＜0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義），相關(guān)系數(shù) r＞0.8，P＜0.05。多西紫杉醇作用 24、48、72 h的IC50分別為99.6、4.1、0.1 mg·L-1。

2.2 流式細(xì)胞儀檢測絨癌 JEG-3細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期

2.2.1 細(xì)胞凋亡率的統(tǒng)計(jì) 根據(jù)流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果分析：用呈 10倍增加濃度的多西紫杉醇處理JEG-3細(xì)胞24和48 h后的細(xì)胞凋亡率（表 2）。各多西紫杉醇作用組細(xì)胞凋亡率均大于空白對照組，且細(xì)胞凋亡率隨多西紫杉醇作用濃度的增加和作用時(shí)間的延長而增大（P＜0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義）。凋亡曲線圖顯示凋亡峰于G1期前出現(xiàn)（圖1，2）。

表1 不同濃度多西紫杉醇作用24、48、72 h后的 JEG-3細(xì)胞增殖抑制率%［（±s），n＝4］

表1 不同濃度多西紫杉醇作用24、48、72 h后的 JEG-3細(xì)胞增殖抑制率%［（±s），n＝4］

注：按a＝0.05水準(zhǔn)，同一濃度不同時(shí)間組及同一時(shí)間不同濃度組與對照組增殖抑制率比較（P＜0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義）。

多西紫杉醇濃度／mg·L-1作用時(shí)間／h 24 48 72 0.0 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.001 11.43±0.27 14.21±0.24 20.89±0.25 0.01 14.95±0.33 25.99±0.74 34.04±0.26 0.1 19.05±0.34 34.03±0.66 49.98±0.43 1 31.79±0.45 45.23±0.27 67.03±0.31 10 39.54±0.47 63.27±0.28 81.53±0.28 100 52.33±0.62 84.57±0.56 97.12±0.22

表2 不同濃度多西紫杉醇作用24、48 h后的JEG-3細(xì)胞凋亡率%［（±s），n＝4］

表2 不同濃度多西紫杉醇作用24、48 h后的JEG-3細(xì)胞凋亡率%［（±s），n＝4］

注：按a＝0.05水準(zhǔn)，同一濃度不同時(shí)間組及同一時(shí)間不同濃度組與對照組凋亡率比較，P＜0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，不同時(shí)間組間及不同濃度組間兩兩比較，P＜0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

多西紫杉醇濃度／mg·L-1作用時(shí)間／h 24 48 0.0 1.35±0.32 1.36±0.35 0.001 11.02±0.22 12.48±0.33 0.01 13.94±0.26 23.46±0.46 0.1 17.01±0.48 32.03±0.29

圖1 不同濃度多西紫杉醇作用24 h后 JEG-3細(xì)胞凋亡圖

圖2 不同濃度多西紫杉醇作用48 h后 JEG-3細(xì)胞凋亡圖

2.2.2 細(xì)胞周期分析 分別用終濃度為0.001、0.01、0.1 mg·L-1的多西紫杉醇處理 JEG-3細(xì)胞24和48 h后的JEG-3細(xì)胞周期百分比（見表 3、圖3，4）。不同濃度多西紫杉醇作用于JEG-3細(xì)胞后G2／M期的百分比與對照組比較均增加（P＜0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義），且 G2／M期 JEG-3細(xì)胞百分率隨多西紫杉醇濃度增高而遞增。

表3 不同濃度多西紫杉醇處理 JEG-3細(xì)胞24和48 h后的細(xì)胞周期百分比［（±s），n＝3］

表3 不同濃度多西紫杉醇處理 JEG-3細(xì)胞24和48 h后的細(xì)胞周期百分比［（±s），n＝3］

注：按a＝0.05水準(zhǔn)，同一時(shí)間不同濃度組G2／M期細(xì)胞百分比均大于對照組，P＜0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。*為實(shí)驗(yàn)誤差。

作用時(shí)間 G0／G1S G2／M

圖3 不同濃度多西紫杉醇作用24 h后 JEG-3細(xì)胞周期圖

圖4 不同濃度多西紫杉醇作用48 h后 JEG-3細(xì)胞周期圖

3 討論

本實(shí)驗(yàn)經(jīng)由 MTT比色法，檢測出多西紫杉醇作用后，存活的絨癌 JEG-3細(xì)胞減少，存活絨癌 JEG-3細(xì)胞的百分比隨藥物濃度的增加及作用時(shí)間的延長而下降，呈明顯時(shí)間、濃度相關(guān)，多西紫杉醇作用于 JEG-3細(xì)胞 72 h的IC50為 0.1 mg·L-1，與該類藥物對其敏感的惡性腫瘤細(xì)胞的IC50相近［8］。

紫杉醇是典型的細(xì)胞毒劑，藥物通過作用于細(xì)胞質(zhì)中的細(xì)胞微管網(wǎng)，結(jié)合至微管蛋白 N端第 217 ～231位和第31位氨基酸，促進(jìn)微管蛋白的聚合并抑制其解聚，使組成微觀的細(xì)胞內(nèi)骨架的合成停止而形成穩(wěn)定的非功能性微管束，微觀組織中心與非功能性微觀束連接增加，與功能性維管束的相互連接被阻斷，細(xì)胞有絲分裂停止于 G2／M期后死亡［9］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)多西紫杉醇作用于絨癌細(xì)胞后，JEG-3細(xì)胞的有絲分裂停止于 G2／M期，且細(xì)胞凋亡與藥物具有時(shí)間—濃度依賴性，支持該種觀點(diǎn)。另有觀點(diǎn)認(rèn)為紫杉醇還能與巨噬細(xì)胞上的腫瘤壞死因子（TNF）受體結(jié)合，使細(xì)胞釋放TNF-α1、INF-α、INF-β、IL-1、IL-2、IL-6增加，而達(dá)到對腫瘤細(xì)胞抑制和殺傷的作用［10］。紫杉醇能否經(jīng)此種方法誘導(dǎo) JEG-3細(xì)胞凋亡，本次試驗(yàn)未涉及，有待進(jìn)一步試驗(yàn)明確。

［1］ Blutt SE，Mc Donnell TJ，Polek TC，et al.Calcitriol induced apoptosis in LNCaP cells is blockde by overexpression of Bcl-2［J］.Endocrinology，2000，141（1）：10-17.

［2］ Feng SS，Mu L，Chen BH，et al.Polymeric nanospheres fabricated with natural emulsifiers for clinical administration of an anticancer drug paclitaxel（Taxol）［J］.Mater Sci Eng，2002，20（122）：85-89.

［3］ 肖崇厚.中藥化學(xué)［M］.上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1997：461 -463.

［4］ Wani MC，Taylor HL，Wall WE，et al.Plant antitumor agents VI：The isolation and structure of Taxol，a novel antileukemic and antitumor agent from Taxus brevifolia［J］.J Am Chem soc，1971，93 （9）：2325-2327.

［5］ 李世偉，季楚舒，何義富.紫杉醇方案治療晚期食管癌的臨床研究進(jìn)展［J］.安徽醫(yī)藥，2012，16（11）：1561-1563.

［6］ 楊慧玲，李 軍.多西他賽單藥一線治療晚期非小細(xì)胞肺癌臨床研究［J］.實(shí)用臨床醫(yī)藥雜志，2012，16（17）：109-111.

［7］ 余景星，劉 心，徐 波.多西他賽誘導(dǎo) HL-60／ADR細(xì)胞凋亡對P-gp、BCL-2、BAX蛋白表達(dá)的影響［J］.中國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志，2010，18（2）：311-316.

［8］ Stierle A，Strobel G，Stierle D，et al.The search for taxol producing microorganisms among the endophytic fungi of the Pacific yew.Taxus Brevifolia［J］.J Nat Prod，1995，58：1315-1324.

［9］ Schiff PB，F(xiàn)ant J，Horwitz SB.Promotion of microtubule assembly in vitro by taxol［J］.Nature，1979，277（5698）：665-667.

［10］Extra JM，Rousseau F，Bruno R，et al.PhaseⅠ and pharmacokinetic study of Taxotere（RP 5697；NSC 628503）give as a short intravenous infusion［J］.Cancer Res，1993，53（5）：1037-1042.

Effect of Docetaxel on the proliferation and apoptosis of choriocarcinoma JEG-3 cells

LI Cen1，2，LIU Hui-ning2
（1.Department of Obstetrics and Gynecology，F(xiàn)irst People’s Hospital of Yangzhou，Jiangsu 225000，China；2.Xiangya Hospital，Changsha，Hunan 410000，China）

Objective To explore the effect of Docetaxel on the proliferation and apoptosis of choriocarcinoma JEG-3 cells.Methods MTT assay was used to detect the proliferation of choriocarcinoma JEG-3 cells and flow cytometry to detect the effect of Docetaxel under different concentrations on apoptosis and cell cycle.Results With the increase of drug concentration in Docetaxel and drug action time，the degree of inhibition and apoptosis of human choriocarcinoma JEG-3 cells was significantly increased（P＜0.05）.Conclusions The experimental results show that Docetaxel has significant effect on inhibiting proliferation and promote apoptosis of choriocarcinoma JEG-3 cells.

Docetaxol；JEG-3 cells；proliferation；apoptosis

10.3969／j.issn.1009-6469.2014.05.049

2013-12-28，

2014-03-06）