劉彭坤，郝吉慶

（安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，安徽 合肥 230022）

PARP-1、P-gp和LRP在肺腺癌中的表達和相關(guān)性研究

劉彭坤，郝吉慶

（安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，安徽 合肥 230022）

目的 探討聚腺苷酸二磷酸核糖聚合酶-1（PARP-1）蛋白與 P糖蛋白（P-gp）、肺耐藥相關(guān)蛋白（LRP）在肺腺癌中的表達和相關(guān)性。方法 采用免疫組化SP法檢測61例肺腺癌組織和20例癌旁正常肺組織中 PARP-1、P-gp和 LRP的表達結(jié)果。結(jié)果 PARP-1、P-gp和LRP的陽性表達率分別為77.05%、50.82%、67.21%，與周圍癌旁組織差異有顯著性（P＜0.05）。LRP的表達與肺腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)（P＜0.05），P-gp、PARP-1與臨床病理特征無明顯相關(guān)（P＞0.05）。P-gp與 LRP、PARP-1與 LRP之間呈正相關(guān)（r分別為0.525、0.269，P＜0.05），P-gp與 PARP-1之間無明顯相關(guān)性（r＝0.223，P＝0.084）。結(jié)論

P-gp、LRP和 PARP-1在肺腺癌中的表達有一定的相關(guān)性，聯(lián)合檢測三者可作為判斷肺腺癌惡性程度的生物學指標。

肺腺癌；免疫組化；聚腺苷酸二磷酸核糖聚合酶-1；P-糖蛋白；肺耐藥相關(guān)蛋白

肺癌是世界上對人類致死率較高的惡性腫瘤之一［1］。肺癌按組織學可分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌（non-small-cell carcinoma，NSCLC），NSCLC又主要分為鱗癌、腺癌、大細胞癌等。其中肺腺癌較易發(fā)生于女性及不抽煙者，且對化療、放療敏感性均較差。目前對于晚期肺腺癌患者，順鉑為主的方案聯(lián)合化療是其主要治療手段之一，但常常因為耐藥問題的存在使其療效不盡如人意。肺癌對化療藥物的耐藥性是一個多因素參與的復雜過程，而且各種因素之間相互依賴、相互制約、相互調(diào)節(jié)。目前有關(guān)肺癌耐藥機制研究較多的主要有 P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp），肺耐藥相關(guān)蛋白（lung resistance-related protein，LRP），此外，聚腺苷酸二磷酸核糖聚合酶 ［poly（ADP ribose）polymerase，PARP］也與化療耐藥有一定的相關(guān)性［2］。目前，PARP-1與P-gp、LRP在肺腺癌組織中的表達及相關(guān)性關(guān)系尚未見報道。本研究采用免疫組化方法檢測PARP-1、P-gp及 LRP在肺腺癌組織中的表達分析其相關(guān)性及與臨床病理特點之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院2007年1月—2010年12月間，有完整病例資料的肺腺癌患者61例。所有患者術(shù)前均未接受放療和化療，調(diào)出患者組織石蠟切片，選取癌旁正常肺組織切片20例作為對照。所有病例均依據(jù)病理學診斷（手術(shù)后病理）為肺腺癌。收集記錄患者的一般資料（如性別、年齡），分化程度，臨床病理分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理特征。

1.2 免疫組織化學法檢測 PARP-1、P-gp及 LRP蛋白的表達 標本蠟塊制備成 4 μm連續(xù)切片，貼于防滑脫載玻片上。按照免疫組化試劑盒上的操作步驟進行 SP法染色。切片常規(guī)脫蠟至水，雙蒸水沖2×5 min，加過碘酸室溫孵育 30 s～1 min，雙蒸水沖2×5 min；3%pH 6.0檸檬酸鹽緩沖液微波20 min抗原修復；PBS沖3×3 min；滴加正常封閉用山羊血清工作液10 min；傾去，勿洗，滴加一定比例的一抗，4℃過夜；37℃溫箱孵育30 min，PBS沖3× 3 min；滴加二抗工作液，室溫孵育 10 min；PBS沖 3 ×3 min；滴加辣根酶標記的鏈霉卵白素工作液，室溫孵育10 min；PBS沖3×3 min；DAB顯色，鏡下控制顯色時間；蘇木素襯染，鹽酸酒精分化，中性樹膠封片。用已知陽性切片作為陽性對照，PBS緩沖液（0.01 mmol·L-1，pH 7.4）代替一抗作為陰性對照。

1.3 結(jié)果判定 實驗結(jié)果由3位病理科醫(yī)師盲法閱片，進行結(jié)果評估。采用半定量法判斷肺腺癌組織中PARP-1、P-gp及LRP的表達情況：PARP-1蛋白胞核或胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性表達，P-gP和LRP蛋白胞膜或胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性表達。每張切片在200倍普通光鏡下隨機選取5個視野，每個視野計數(shù)100個細胞。計算每個視野中的陽性細胞的平均百分率作為該切片陽性細胞的百分率。在此基礎(chǔ)上，參照文獻評分方法［3］，首先對染色強度進行評分：淡黃色為1分，黃色為2分，棕黃色為3分；再按陽性細胞所占的百分率進行評分：陽性細胞＜25%為1分，25%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分。將每一標本兩項得分相乘得出總分，0～3分記為 -，4～8分記為+，9～12分記為 ++。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用 χ2檢驗、四格表精確概率法和Spearman相關(guān)性分析進行統(tǒng)計，所有數(shù)據(jù)均在SPSS 19.0統(tǒng)計軟件上處理。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 PARP-1、P-gp、LRP在肺腺癌組織中的表達情況 肺腺癌組織中PARP-1的陽性表達率77.05%（47／61）高于癌旁組織 30%（6／20），差異有統(tǒng)計學意義（χ2＝14.741，P＜0.001）；P-gp在肺腺癌組織中的陽性表達率是50.82%（31／61），高于癌旁組織20%（4／20），差異有統(tǒng)計學意義（χ2＝5.830，P＝0.016）；癌組織中LRP的陽性表達率67.21%（41／61）高于癌旁組織25%（5／20），差異有統(tǒng)計學意義（χ2＝10.937，P＝0.001）。見圖1～3及表1。

圖1 P-gp在肺腺癌中的陽性表達（SP×200）

圖2 LRP在肺腺癌中的陽性表達（SP×200）

圖3 PARP-1在肺腺癌中的陽性表達（SP×200）

表1 肺腺癌和癌旁組織中PARP-1、P-gp和LRP的表達

2.2 PARP-1、P-gp和 LRP在肺腺癌中的表達與臨床病理特征之間的關(guān)系 LRP蛋白表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)（χ2＝12.634，P＜0.001）；其他病 理特征組中三者表達均無明顯差異。見表2。

表2 PARP-1、P-gp和LRP表達與肺腺癌臨床病理特征之間的關(guān)系

2.3 肺腺癌組織中 P-gp、PARP-1和 LRP之間表達的相關(guān)性 肺腺癌組織中P-gp與 LRP的表達呈正相關(guān)（r＝0.525，P＜0.001）；PARP-1與LRP的表達呈正相關(guān)（r＝0.269，P＝0.036）；PAR-1P與 P-gp的表達無明顯相關(guān)性（r＝0.223，P＝0.084）。見表3～5。

表3 肺腺癌組織中 P-gp與 LRP表達之間的相關(guān)性

表4 肺腺癌組織中 PARP-1與 LRP表達之間的相關(guān)性

表5 肺腺癌組織中PARP-1與P-gp表達之間的相關(guān)性

3 討論

肺癌是全球范圍內(nèi)病死率較高的惡性腫瘤之一，預后差。2008年在對全球 182個國家的 27種腫瘤的發(fā)病率和死亡率的統(tǒng)計中顯示，最常見的惡性腫瘤為肺癌，161萬，占總數(shù)的12.7%；因惡性腫瘤死亡的最常見的原因為肺癌，138萬，占總數(shù)的18.2%［4］。其中化療藥物的失敗是影響患者預后一個重要因素。腫瘤細胞對多種化療藥物產(chǎn)生交叉耐藥性，稱多藥耐藥，是造成腫瘤化療失敗的主要原因［5］。已 發(fā)現(xiàn) 的 參 與耐 藥 的 轉(zhuǎn)運 蛋 白 有PARP、P-gp和 LRP等。

國內(nèi)外文獻報道，PARP是存在于真核細胞中催化聚 ADP核糖化的細胞核酶，在 DNA損傷檢測和修復、染色體重塑、有絲分裂器形成和細胞死亡中發(fā)揮重要作用，已知 PARP的過激活與許多疾病有關(guān)，尤其是PARP-1在DNA損傷修復過程中發(fā)揮重要作用，而這種 DNA損傷修復功能與腫瘤的發(fā)生、化療耐藥性等有一定的關(guān)系?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn) PARP蛋白家族包括18個成員，其中PARP-1是在 PARP蛋白家族中含量最豐富、最重要的一員。PARP-1通過堿基切除修復途徑對 DNA單鏈損傷進行修復［6］。PARP-1被損傷的 DNA激活，裂解煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）+產(chǎn)生煙堿及ADP核糖，ADP核糖進一步形成聚腺苷二磷酸核糖（poly ADP-ribose，PAR），PAR與受體蛋白共價結(jié)合，受體蛋白包括PARP-1自身，組蛋白及一些其他DNA修復蛋白等。當 PARP經(jīng)ADP核糖聚合物自身修飾后，能從DNA斷裂處解離，之后聚合物與DNA缺口相黏附。這些帶大量負電荷的聚合物能招募一些在 BER-SSBs途徑中發(fā)揮重要作用的蛋白如 XRCC1，其它一些參與染色體空間結(jié)構(gòu)形成、DNA修復及復制的蛋白，亦能與PAR非共價結(jié)合，共同發(fā)揮對 DNA損傷修復作用。新近研究發(fā)現(xiàn)PARP在DNA損傷修復中還有更多功能，如能招募 MRE11、ATM；能夠通過抑制 E2F4和 P130復合物而影響 BRCA1和 RAD51的表達［7］；能夠與雙鏈 DNA損傷修復途徑中非同源末端連接（non-homologous end joining，NHEJ）中的蛋白激酶復合物相互作用［8］。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)經(jīng)烷化劑處理的細胞，再經(jīng)PARP抑制劑處理或通過 RNA干擾技術(shù)抑制 PARP的表達，所導致的 SSBs損傷修復效果不同［9］。PARP-1活化后能夠催化合成 PAR對細胞內(nèi)眾多蛋白質(zhì)進行翻譯后修飾，發(fā)揮其生物學功能。此外目前研究較多的 P-gp是由 MDR1基因編碼的分子量為170 kDa的跨膜糖蛋白，是ABC轉(zhuǎn)運蛋白（ATP結(jié)合膜轉(zhuǎn)運蛋白）超家族的重要成員，可以利用 ATP供能，介導多種藥物在細胞內(nèi)外的轉(zhuǎn)運，使化療藥物在腫瘤細胞內(nèi)的濃度降低，從而產(chǎn)生MDR［10］。LRP是一種位于細胞質(zhì)和核膜上的穹窿體蛋白，LRP介導腫瘤細胞產(chǎn)生 MDR（多藥耐藥）的主要機制是通過胞吐小泡的胞吐作用或者分子泵機制將細胞內(nèi)的藥物泵出胞外，降低細胞內(nèi)的藥物濃度［11］。

本研究發(fā)現(xiàn)，PARP-1、P-gp和 LRP在肺腺癌組織中的陽性表達率分別為77.05%、50.82%、67.21%，均顯著高于癌旁組織（P＜0.05），提示從未接受放化療的肺腺癌患者存在較高的原發(fā)性耐藥。LRP的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)（P＜0.05），與其他病理特征無明顯相關(guān)，該結(jié)論與國內(nèi)李英杰［12］等用免疫組化法所做的 LRP在非小細胞肺癌中的表達與臨床病理特征間的關(guān)系結(jié)論是一致的。同時 P-gp、PARP與臨床病理特征無明顯相關(guān)（P＞0.05），提示這3種蛋白均可引起肺腺癌患者耐藥。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，P-gp與 LRP、PARP與LRP之間呈正相關(guān)（r分別為0.525、0.269，P＜0.05），說明PARP、P-gp和 LRP在肺癌耐藥的過程中可能有一定的相互協(xié)同作用。

綜上所述，由于PARP-1、P-gp和LRP蛋白在肺腺癌的表達特征及意義不同，因此，聯(lián)合檢測有助于綜合判斷病情、合理選擇藥物及評估預后。本研究發(fā)現(xiàn) LRP與肺腺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，P-gp與LRP、LRP與PARP在耐藥過程中有相互協(xié)同作用，提示肺癌多藥耐藥的形成可能是多因子、多途徑的復雜過程，并且可能存在其他因素參與或相互影響，具體機制還需要進一步的深入研究。深入探討肺癌多藥耐藥發(fā)生的現(xiàn)象及機制對于肺癌患者化療方案的制定及提高化療療效有一定的指導意義。

［1］ Karachaliou N，Mayo C，Costa C，et al.KRAS mutations in lung cancer［J］.Clin Lung Cancer，2013，14（3）：205-214.

［2］ Ganesan S.MYC，PARP1，and chemoresistance：BIN there，done that？［J］.Sci Signal，2011，4（166）：15.

［3］ Tormanen-Napankangas U，Soini Y，Kahlos K，et al.Expression of caspases-3，-6 and-8 and their relation to apoptosis in nonsmall cell lung carcinoma［J］.Int J Cancer，2001，93（2）：192-198.

［4］ Ferlay J，Shin HR，Bray F，et al.Estimates of worldwide burden of cancer in 2008：GLOBOCAN 2008［J］.Int J Cancer，2010，127 （12）：2893-2917.

［5］ 竇紅漫，程 平，吳賽青，等.多藥耐藥蛋白 P-gP，Topo-II與p53蛋白在胃癌組織中的表達及意義［J］.安徽醫(yī)藥，2010，14 （11）：1294-1296.

［6］ Rouleau M，Patel A，Hendzel MJ，et al.PARP inhibition：PARP1 and beyond［J］.Nat Rev Cancer，2010，10（4）：293-301.

［7］ Hegan DC，Lu Y，Stachelek GC，et al.Inhibition of poly（ADP-ribose）polymerase down-regulates BRCA1 and RAD51 in a pathway mediated by E2F4 and p130［J］.Proc Natl Acad Sci，2010，107（5）：2201-2206.

［8］ Patel AG，Sarkaria JN，Kaufmann SH.Nonhomologous end joining drives poly（ADP-ribose）polymerase（PARP）inhibitor lethality in homologous recombination-deficient cells［J］.Proc Natl Acad Sci，2011，108（8）：3406-3411.

［9］ Strom CE，Johansson F，Uhlen M，et al.Poly（ADP-ribose）polymerase（PARP）is not involved in base excision repair but PARP inhibition traps a single-strand intermediate［J］.Nucleic Acids Res，2011，39（8）：3166-3175.

［10］Kim EH，Min HY，Chung HJ，et al.Anti-proliferative activity and suppression of P-glycoprotein by（-）-antofine，a natural phenanthroindolizidine alkaloid，in paclitaxel-resistant human lung cancer cells［J］.Food Chem Toxicol，2012，50（3／4）：1060-1065.

［11］Wang J，Zhang J，Zhang L，et al.Expression of P-gp，MRP，LRP，GST-π and TopoIIα and intrinsic resistance in human lung cancer cell lines［J］.Oncol Rep，2011，26（5）：1081-1089.

［12］李英杰，于長海，張 文.COX-2與LRP在非小細胞肺癌中的表達與肺癌預后的關(guān)系［J］.臨床肺科雜志，2010，15（12）：1797-1798.

The expression of PARP-1，P-gp，LRP and their correlation in lung adenocarcinoma

LIU Peng-kun，HAO Ji-qing
（The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022，China）

Objective To investigate the expression and correlation of PARP-1，P-gp and LRP in lung adenocarcinoma.Methods The expression of PARP-1，P-gp and LRP in 61 adenocarcinoma of lung tissues and 20 adjacent tissues was detected by immunohistochemical SP method.Results The positive expression rate of PARP-1，P-gp and LRP in patients with lung cancer were 77.05%，50.82% and 67.21%respectively.The expression of PARP-1，P-gp and LRP in lung adenocarcinoma was significantly different from that in adjacent tissues（P＜0.05）.The expression of LRP was only closely correlated with lymph node metastasis（P＜0.05）.While the expression of P-gp and PARP-1 was not correlated with the clinic pathological characteristics.LRP expression was positively correlated with PARP-1 and P-gp.There was no significant correlation between P-gp and PARP-1（r＝0.223，P＝0.084）.Conclusion The drug resistance in lung cancer patients is affected by various factors.THE expression of PARP-1，P-gp and LRP have some correlation in lung adenocarcinoma.The expression of LRP was closely related to lymph node metastasis.

lung adenocarcinoma；immunohistochemistry；PARP-1；P-gp；LRP

10.3969／j.issn.1009-6469.2014.05.017

2013-11-19，

2014-01-15）

安徽省自然科學基金項目計劃（No 1308085MH142）

劉彭坤，男，碩士研究生

郝吉慶，女，主任醫(yī)師，碩士生導師，研究方向：肺癌的個體化治療，E-mail：ayfy_hjq＠163.com