巖林蘋，曹燕麗，吳晶晶，王 婷，蘇 華，任海祥

（南京軍區(qū)南京總醫(yī)院制劑科，江蘇 南京 210002）

調(diào)節(jié)不同pH值的免疫吸附洗脫液的細(xì)菌內(nèi)毒素測定

巖林蘋，曹燕麗，吳晶晶，王 婷，蘇 華，任海祥

（南京軍區(qū)南京總醫(yī)院制劑科，江蘇 南京 210002）

目的 選擇不同濃度的氫氧化鈉堿性調(diào)節(jié)劑或直接稀釋法對免疫吸附洗脫液的 pH值進(jìn)行調(diào)節(jié)比較，建立免疫吸附洗脫液的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法。方法 根據(jù)《中國藥典》2010年版第二部附錄收載的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法，采用鱟試劑法對免疫吸附洗脫液進(jìn)行干擾試驗。結(jié)果 稀釋32倍的免疫吸附洗脫液對細(xì)菌內(nèi)毒素與鱟試劑的反應(yīng)無干擾，選擇靈敏度為0.015 EU·mL-1的鱟試劑進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。結(jié)論 選擇直接稀釋法調(diào)節(jié)供試品的 pH值更優(yōu)于低濃度氫氧化鈉堿性調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)供試品的pH值對其進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素的檢查。

免疫吸附洗脫液；細(xì)菌內(nèi)毒素；pH值；氫氧化鈉堿性調(diào)節(jié)劑

免疫吸附洗脫液是南京軍區(qū)南京總醫(yī)院自制制劑，其臨床上用于免疫性疾病，腎移植，中毒，腎小球疾病等。由于此藥的pH值過低，考慮到pH值過大或過小均可抑制鱟試劑與細(xì)菌內(nèi)毒素的反應(yīng)，其原因可能是pH值過大或過小均可破壞極微量的內(nèi)毒素，因此為了保證免疫吸附洗脫液的用藥安全，控制藥品的生產(chǎn)質(zhì)量，我們對如何調(diào)節(jié)本品的pH值進(jìn)行了方法探討。

1 試驗儀器與試藥

1.1 儀器 ET-96細(xì)菌內(nèi)毒素凝膠法測定儀（天津天大天發(fā)科技有限公司）；ZH-2自動漩渦混合器（天津藥典標(biāo)準(zhǔn)儀器廠）；試驗所用玻璃儀器均經(jīng)過250℃干烤2 h。

1.2 試藥 細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（CSE）（規(guī)格：120 EU·mL-1批號：150601-200859，中國食品藥品檢定研究院）；鱟試劑（TAL）（規(guī)格：每支0.1 mL，靈敏度：0.062 5 EU·mL-1，廣東湛江安度斯生物有限公司，批號：1201110；廣東湛江博康海洋生物有限公司，批號：1207193）；鱟試劑（TAL）（規(guī)格：每支0.1 mL，靈敏度：0.015 EU·mL-1，廣東湛江安度斯生物有限公司，批號：1201103；廣東湛江博康海洋生物有限公司，批號：1203050）；細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（BET）（規(guī)格：每支5 mL，廣東湛江博康海洋有限公司，批號：1201180）；無水氫氧化鈉（規(guī)格：500 g，分析純，上海實意化學(xué)試劑有限公司，批號：090610）；免疫吸附洗脫液（規(guī)格：每袋500 mL，南京軍區(qū)南京總醫(yī)院自制藥品，批號：120911、120916、120924）。

2 方法和結(jié)果

2.1 鱟試劑靈敏度復(fù)核實驗 按照《中國藥典》2010年版二部附錄XIE規(guī)定的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法規(guī)定［1］，進(jìn)行鱟試劑的標(biāo)示靈敏度復(fù)核，結(jié)果見表1。所用的鱟試劑靈敏度均符合規(guī)定，可用于細(xì)菌內(nèi)毒素的檢查。

2.2 細(xì)菌內(nèi)毒素限值（L）的確定 根據(jù)免疫吸附洗脫液說明書得知本品最大用量為80 mL／（60 kg ·h）。根據(jù)公式：細(xì)菌內(nèi)毒素限值（L）＝K／M。K為人用每公斤體重每小時最大可接受的內(nèi)毒素劑量，本注射劑為 K＝5 EU·kg-1·h-1，其中 M為人用每公斤每小時的最大供試品量本品為80 mL／（60 kg·h），則 L＝3.75 EU·mL-1?？紤]到臨床聯(lián)合用藥的安全性和細(xì)菌內(nèi)毒素的累加性，在上述計算限制的基礎(chǔ)上將限值提高7.5倍，由此確定免疫吸附洗脫液的細(xì)菌內(nèi)毒素限值為 0.5 EU·mL-1［2］。

表1 鱟試劑靈敏度復(fù)核

2.3 凝膠半定量法測定 將 3批免疫吸附洗脫液，用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水在去除內(nèi)毒素的容器中配制成兩種不同濃度（0.1、0.05 mol·L-1）的氫氧化鈉堿性調(diào)節(jié)劑，分別對原液、稀釋后的2、4、8倍供試品溶液進(jìn)行 pH值調(diào)節(jié)至大約為6.5左右［3］（調(diào)節(jié)過程：分別取供試品每個梯度溶液1 mL于試管中，滴一滴酚酞指示劑，用刻度移液管緩緩加入氫氧化鈉堿性調(diào)節(jié)劑，溶液變色時分別記下氫氧化鈉堿性調(diào)節(jié)劑的用量；再另取去除熱原的試管，直接按前一步驟記錄的氫氧化鈉堿性調(diào)節(jié)劑的用量分別加入供試品的每個梯度中）。采用兩個廠家 λ為0.062 5 EU·mL-1的鱟試劑，按《中國藥典》2010年版二部附錄XIE規(guī)定的細(xì)菌內(nèi)毒素凝膠半定量檢查法進(jìn)行檢測［4］。

表 2 細(xì)菌內(nèi)毒素凝膠半定量法檢測結(jié)果 （0.1 mol·L-1NaOH）

由表 2可知，（0.1 mol·L-1）氫氧化鈉堿性調(diào)節(jié)劑對3批免疫吸附洗脫液進(jìn)行 pH值調(diào)節(jié)，結(jié)果雖能有效調(diào)節(jié)pH值，但供試品陽性對照（PPC）管均為陰性，表明內(nèi)毒素失去活性，可能因為氫氧化鈉堿性調(diào)節(jié)劑濃度過高，破壞內(nèi)毒素，使其失活，此方法不可行。因此選擇低濃度（0.05 mol·L-1）氫氧化鈉堿性調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)供試品pH值，再進(jìn)行半定量檢測。

表3結(jié)果表明，（0.05 mol·L-1）氫氧化鈉堿性調(diào)節(jié)劑對3批免疫吸附洗脫液進(jìn)行 pH值調(diào)節(jié)，既能有效調(diào)節(jié)供試品 pH值，又可保留內(nèi)毒素活性，通過計算［公式CE＝antilg（∑X／2）］，系列溶液內(nèi)毒素濃度的幾何平行值（CE）均在規(guī)定范圍內(nèi)，方法可行。

2.4 選擇高靈敏度的鱟試劑，采用直接稀釋法對免疫吸附洗脫液進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素驗證［5-7］

2.4.1 干擾預(yù)試驗 取3批免疫吸附洗脫液用BET水分別稀釋為2、4、8、16、32倍稀釋液，將此系列濃度溶液記為供試品陰性對照（NPC）。另制備同樣系列濃度的供試液，并使2、4、8、16、32倍稀釋液的供試品中均含有 2 λ濃度的細(xì)菌內(nèi)毒素，將此系列溶液記為供試品陽性對照（PPC）。取2個廠家靈敏度為 0.015 EU·mL-1的鱟試劑，分別與上述PPC和 NPC進(jìn)行反應(yīng)，每一濃度重復(fù)兩管，并設(shè)陽性對照（PC）和陰性對照（NC），對其進(jìn)行干擾預(yù)試 驗，結(jié)果見表4。

表3 細(xì)菌內(nèi)毒素凝膠半定量法檢測結(jié)果（0.05 mol·L-1NaOH）

表4 免疫吸附洗脫液干擾預(yù)試驗

從表4預(yù)試驗結(jié)果表明，供試品在32倍以上的稀釋倍數(shù)時，和 BET相容性較好，沒有干擾，將其初步判斷為供試品無干擾濃度。

表5 免疫吸附洗脫液的干擾試驗

2.4.2 正式干擾試驗 為了最終確認(rèn)是否存在抑制因素的影響，進(jìn)行正式干擾試驗。取3批免疫吸附洗脫液用 BET水分別稀釋為32倍，用32倍稀釋液和BET水分別將CSE稀釋制得 0.03（2 λ）、0.015（λ）、0.007 5（0.5 λ）、0.003 75（0.25 λ）EU· mL-1系列內(nèi)毒素濃度溶液，與2個廠家靈敏度為0.015 EU·mL-1的鱟試劑反應(yīng)，每一濃度平行做 4管。另取0.1 mL BET水或供試品 32倍稀釋液加入0.1 mL BET水復(fù)溶的TAL安瓿中，各平行做兩管，作為陰性對照（NC）。按 2010年版中國藥典細(xì)菌內(nèi)毒素檢查供試品干擾試驗進(jìn)行試驗，結(jié)果見表5。

表5表明，上述3批供試品對兩個廠家鱟試劑的 Et均在 0.5～2.0 Es之間，因此供試品在 32倍稀釋時對鱟試劑試驗均無干擾，可進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。

2.4.3 供試品細(xì)菌內(nèi)毒素凝膠法檢查 取上述 3批供試品分別稀釋32倍，使用兩批不同廠家靈敏度為0.015 EU·mL-1的TAL，按2010年版中國藥典細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法檢查，并同時設(shè)立陰性對照（NC）和陽性對照（PC），結(jié)果見表6。結(jié)果符合規(guī)定。

表6 免疫吸附洗脫液的細(xì)菌內(nèi)毒素凝膠法檢查

3 討論

免疫吸附洗脫液的酸性較大，細(xì)菌內(nèi)毒素檢測時干擾嚴(yán)重。目前認(rèn)為強堿物質(zhì)本身不存在內(nèi)毒素，可使用于酸度調(diào)節(jié)［8］，本試驗用自制的 0.1、0.05 mol·L-1的氫氧化鈉堿性調(diào)節(jié)劑，分別調(diào)節(jié)本品 pH值約至6.5，即可排除干擾。

根據(jù)2010年版《中國藥典》規(guī)定，細(xì)菌內(nèi)毒檢查法中鱟試劑的反應(yīng)混合液（TAL+供試品）的 pH值應(yīng)在6～8范圍內(nèi)，本品的 pH值為 2.4左右，稀釋成2、4、8倍后，相應(yīng)的 pH值3.3、4.2、4.8左右，仍不在范圍內(nèi)，采用（0.1 mol·L-1）和（0.05 mol· L-1）兩個濃度的無熱原的氫氧化鈉堿性調(diào)節(jié)劑將供試品的pH值調(diào)節(jié)至 6.5左右，進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素凝膠半定量檢查試驗，表 2、表 3結(jié)果表明，用于調(diào)節(jié)供試品溶液pH值的氫氧化鈉堿性調(diào)節(jié)劑濃度越小，就會使內(nèi)毒素失去活性的幾率越小。

考慮到氫氧化鈉堿性調(diào)節(jié)劑雖無熱原，但仍屬于外添加物質(zhì)，于是在不添加氫氧化鈉堿性調(diào)節(jié)劑的情況下，對3批供試品進(jìn)行向下稀釋，現(xiàn)用BET水在容許范圍內(nèi)對供試品進(jìn)行稀釋，目前市售的普通鱟試劑 λ通常在 0.5～0.062 5 EU·mL-1之間，但鱟試劑 λ為0.062 5 EU·mL-1時，最大稀釋倍數(shù)為16倍的供試品 pH值為5.2左右，不在藥典規(guī)定的 pH范圍內(nèi)（6～8），因此選擇兩家高靈敏度的鱟試劑（0.015 EU·mL-1），對供試品進(jìn)行相對應(yīng)的進(jìn)一步稀釋，得2、4、8、16、32倍的溶液，測得32倍稀釋液的pH值為 5.8左右，比較接近藥典規(guī)定的pH值范圍。而 BET水和鱟試劑本身對供試品 pH值具有一定的緩沖作用，干擾預(yù)試驗的結(jié)果顯示供試品在32倍稀釋時與 BET相容性較好，沒有干擾，可以進(jìn)行正式的干擾試驗。

本試驗結(jié)果表明，選用低濃度的氫氧化鈉堿性調(diào)節(jié)劑對供試品進(jìn)行 pH值調(diào)節(jié)，方法可行，可節(jié)約成本，目前普遍采用該法。但每次試驗均需臨時配制，配制出的溶液 pH值都會不同，且每次均需測試酸堿調(diào)節(jié)劑用量，相當(dāng)繁瑣，更重要的是不能保證配制過程沒有污染。而選用高靈敏度鱟試劑，直接稀釋法可簡化流程，排除干擾，且干擾試驗是成立的，所以認(rèn)為此方法是可行并成立的。

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Bacterial endotoxin test with immune adsorption eluent by adjusting pH value

YAN Lin-ping，CAO Yan-li，WU Jing-jing，et al
（Department of Preparation，Nanjing General Hospital of Nanjing Military Command，Nanjing，Jiangsu 210002，China）

Objective To establish a method for testing bacterial endotoxin with immune adsorption eluent by adjusting pH value with sodium hydroxide at different concentration as an alkalinity regulator or by direct dilution method.Methods The interference experiments with tachypleus amebocyte lysate（TAL）method on the immune adsorption eluents were performed according to the bacterial endotoxin test in Chinese Pharmacopoeia 2010（Section 2）.Results The immune adsorption eluent did not interfere with the bacterial endotoxins test when it was diluted 32 times.Tachypleus amebocyte lysate was used with the sensitivity of 0.015 EU·mL-1.Conclusions It is better to adjust pH value by direct dilution method for testing bacterial endotoxin of immune adsorption eluent than with sodium hydroxide as an alkalinity regulator.

immune adsorption eluent；bacterial endotoxins；pH；sodium hydroxide alkalinity regulator

10.3969／j.issn.1009-6469.2014.05.012

2013-08-14，

2014-01-06）

任海祥，男，副主任藥師，研究方向：醫(yī)院制劑，E-mail：suhuash＠sina.com.cn