何 文，劉 貝，郭咸希

（1.武漢大學(xué)人民醫(yī)院藥學(xué)部；2.武漢大學(xué)藥學(xué)院，湖北 武漢 430060）

不同取代度的寡聚精氨酸殼聚糖的合成與鑒定

何 文1，劉 貝2，郭咸希1

（1.武漢大學(xué)人民醫(yī)院藥學(xué)部；2.武漢大學(xué)藥學(xué)院，湖北 武漢 430060）

目的 合成不同分子量、不同取代度的寡聚精氨酸殼聚糖（CS-PR），并對其化學(xué)結(jié)構(gòu)及取代度進(jìn)行鑒定。方法 用高分子量殼聚糖（HCS）、低分子量殼聚糖（LCS）和寡聚精氨酸（R9）為主要原料，通過改變反應(yīng)物的摩爾比，合成不同取代度 CSPR，應(yīng)用FTIR及1H-NMR對其結(jié)構(gòu)及取代度進(jìn)行分析。結(jié)果 通過改變反應(yīng)物的摩爾比，獲得了取代度為 0.96和 1.87的HCS-R9，以及取代度為2.61和10.10的 LCS-R9。結(jié)論 不同分子量不同取代度的 CS-PR合成成功，為進(jìn)一步實驗奠定了基礎(chǔ)。

殼聚糖；寡聚精氨酸；合成；分子量；取代度

殼聚糖（chitosan，CS）是一種天然聚陽離子多糖，具有良好的生物降解性和生物相容性，是自然界唯一的堿性多糖，且來源廣泛，為地球上僅次于纖維素的第二大再生資源。CS分子不溶于一般的有機溶劑和水，在一定程度上限制了它的廣泛應(yīng)用。利用 CS重復(fù)單元上的氨基，可對其進(jìn)行化學(xué)改性，制備出具有不同理化特性的 CS衍生物，一方面可改善它們的溶解性能，更重要的是不同取代基的引入可賦予 CS更多的功能，從而延伸了 CS的應(yīng)用領(lǐng)域和范圍。研究［1-3］表明：CS及其衍生物可促進(jìn)藥物的透皮吸收，其效果甚至優(yōu)于同濃度的氮酮。

細(xì)胞穿透肽（cell penetration peptides，CPP）是由10～30個氨基酸組成的短肽，可攜帶多種物質(zhì)進(jìn)行細(xì)胞間或細(xì)胞內(nèi)傳輸，是一種新型的不引起細(xì)胞膜永久性損傷的載體，目前在細(xì)胞生物、基因治療學(xué)及制藥工程領(lǐng)域均顯示巨大的研究價 值［4-5］。CPP是以氨基酸為單位，多含有帶正電荷的精氨酸和賴氨酸，帶有大量的正電荷。本實驗所選用的具有細(xì)胞穿透肽的一般性質(zhì)。近年來，有研究嘗試將CPP作為透皮吸收促進(jìn)劑用于透皮給藥系統(tǒng)中。CPP通過干擾緊密的角質(zhì)層結(jié)構(gòu)，促進(jìn)藥物的透皮吸 收［6-9］。

本實驗室前期將高分子量的殼聚糖（high molecular weight chitosan，HCS）與精氨酸九聚體（nonaarginine，R9）進(jìn)行化學(xué)結(jié)合，即以HCS為載體，氨基側(cè)鏈采用親水性基團(tuán) R9進(jìn)行修飾，已成功合成HCS-R9，并初步驗證了其透皮吸收促進(jìn)作用。本實驗擬選用 HCS及低分子量的殼聚糖（low molecular weight chitosan，LCS），并通過調(diào)節(jié) CS與 R9的摩爾比合成不同取代度的 CS-R9，為后期考察 CS分子量、取代度等因素對 CS-R9透皮吸收促進(jìn)作用的影響奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 TG328A電子分析天平（上海天平儀器廠）；RE-52C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；Alpha-4冷凍干燥機（德國Martin Christ）；HJ-3恒溫磁力攪拌器（江蘇金壇醫(yī)療儀器廠）；HH.S精密恒溫水浴鍋（江蘇金壇醫(yī)療儀器廠）；A-VATAR360傅立葉紅外光譜儀（美國Thermo Nicolet公司）；Varian unity-600核磁共 振 譜儀 （美國 Varian公 司）；ZKF030電熱真空干燥箱（上海實驗儀器廠）；透析袋（MW8000-14000，USA）。

1.2 試藥 HCS（MW 5.9×105，DD≥95%，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號：20121112）；LCS（MW 5.0×104，DD≥85%，浙江金殼藥業(yè)有限公司，批號：D130531089）；R9（95%，委托南京金斯瑞公司合成）；N-羥基硫代琥珀酰亞胺（NHS，分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號：20120830）；1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC·HCl，99%，上 海 共 價 化 學(xué) 科 技 有 限 公 司，批號：20121009）；二碳酸二叔丁酯（Boc，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號：20121210）；氧化氘（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號：20120220）；氘代乙酸（北京百靈威科技有限公司，批號：LS30N38）。

2 方法

2.1 CS-R9的合成［10-11］本實驗的合成思路如圖1。基本思路是 R9的羧基經(jīng) EDC和 Sulfo-NHS的活化與 CS的氨基發(fā)生反應(yīng)，反應(yīng)在室溫下進(jìn)行。

圖1 CS-PR的合成路線

2.1.1 低取代 HCS-R9的制備 取 20 mg R9溶于10 mL去離子水中，另取16 mg Boc溶于10 mL四氫呋喃中，將溶有 Boc酸酐的四氫呋喃溶液加入到R9的水溶液中，攪拌均勻，用1 mol·L-1的NaOH溶液調(diào)節(jié)混合溶液的pH值至9～10，恒溫攪拌反應(yīng)24 h后，停止反應(yīng)。將反應(yīng)液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上除去部分四氫呋喃—水混合液，取適量去離子水將其溶解，得反應(yīng)液1。

稱取281 mg HCS加入到30 mL的1%的冰醋酸水溶液中，室溫攪拌12 h，使 HCS完全溶解，用電子分析天平稱取5.6 mg NHS和24 mg EDC，加入到HCS溶液中，再將反應(yīng)液1加入到此溶液中，調(diào) pH 為6.0，開啟磁力攪拌，在室溫下攪拌反應(yīng) 48 h后，停止攪拌。加入1%的 CF3COOH消除 Boc保護(hù)。加入50%羥胺使其終濃度為 10 mM，調(diào)節(jié)pH至8.0，使反應(yīng)停止。流反應(yīng) R9與 HCS摩爾比為10∶1。

將反應(yīng)液裝入透析袋（MW＝8 000～14 000）中，浸沒在去離子水中透析 48 h，然后冷凍干燥，得到產(chǎn)物HCS-R9-1。

2.1.2 高取代 HCS-R9的制備 采用 2.1.1中的方法使 R9與 HCS以40∶1的摩爾比發(fā)生反應(yīng)，經(jīng)過透析、冷凍干燥，得到產(chǎn)物HCS-R9-2。

2.1.3 低取代 LCS-R9的制備 采用2.1.1中的方法使R9與 LCS以 5∶1的摩爾比發(fā)生反應(yīng)，經(jīng)過透析、冷凍干燥，得到產(chǎn)物 LCS-R9-1。

2.1.4 高取代 LCS-R9的制備 采用 2.1.1中的方法使R9與LCS以35∶1的摩爾比發(fā)生反應(yīng)，經(jīng)過透析、冷凍干燥，得到產(chǎn)物L(fēng)CS-R9-2。

2.2 CS-PR的結(jié)構(gòu)鑒定［12］

2.2.1 傅里葉紅外光譜分析（FTIR） 分別取適量的CS、R9、HCS-R9-1、HCS-R9-2、LCS-R9-1、LCS-R9-2凍干粉末，與干燥的 KBr粉末以 1∶100的質(zhì)量比混勻并溶于適量去離子水，烘干，用瑪瑙研缽研成細(xì)粉末，將此混合物壓片，置于傅氏轉(zhuǎn)換紅外線光譜分析儀（FTIR）內(nèi)掃描，掃描范圍：4 000～400 cm-1，記錄其紅外光譜。

2.2.21H-核磁共振譜（1H-NMR） 取適量的 CS、R9、HCS-R9-1、HCS-R9-2、LCS-R9-1、LCS-R9-2，分別溶于體積比為 5∶95的 CD3COOD∶D2O中，在 150 MHz頻率照射，20℃下核磁共振儀記錄圖譜。

3 結(jié)果

3.1 產(chǎn)物的紅外譜圖 見圖 2。由圖 2可知，R9 在1 652和1 153 cm-1處分別有R9的胍基 C＝N特征峰和C-C-N鍵的非對稱伸縮吸收峰，1 271 cm-1處有 C（O）-O的伸縮振動吸收峰，1 139 cm-1處有C-N伸縮振動吸收峰；HCS及LCS在1 637 cm-1處有 NH2鍵的彎曲振動吸收峰，1 563 cm-1處有C＝O鍵的非對稱伸縮振動吸收特征峰，1 077 cm-1處有吡喃環(huán)上的 C-O伸縮振動吸收峰，1 153 cm-1處有C-C-N鍵的非對稱彎曲振動吸收峰；HCS-R9-1和HCS-R9-2以及 LCS-R9-1和 LCS-R9-2在 1 580 cm-1處有酰胺鍵的吸收峰，這表明 HCS和 LCS與R9形成酰胺鍵［13］。通過紅外光譜的測試分析，能夠初步判斷HCS-R9及 LCS-R9的成功連接。

圖2 化合物的 FTIR譜圖

3.2 產(chǎn)物的核磁譜圖 為進(jìn)一步確證HCS、LCS與R9的連接成功，進(jìn)行了核磁共振氫譜的測定。由圖3中未修飾的殼聚糖的譜圖，在以下位置可觀測到化學(xué)位移：δ＝5.23（H 1），δ＝3.0（H 2），δ＝3.50～3.80（H 3，H 4，H 5，H 6），δ＝1.90 ppm（NHCOCH3）。經(jīng)修飾后，化學(xué)位移在 δ＝1.5（CONHCHCH2CH2-）、δ＝1.7（CONH-CHCH2-）處出現(xiàn)的質(zhì)子峰，在 δ＝4.2（CONH-CH-）處出現(xiàn)的骨架質(zhì)子峰，都可以表明 R9連接到了 CS上［14］。

圖3 A：CS-PR結(jié)構(gòu)式；B：R9、CS、CS-R9的1H-NMR譜圖 （其中圓圈代表δ＝3.0，CS上2號碳上的質(zhì)子，-CH-；星號代表δ＝4.2，R9上2號碳上的質(zhì)子，-CH-）

3.3 產(chǎn)物取代度的確定 CS-PR的取代度，定義為R9與 CS的 100個葡聚糖單體的摩爾比［15］。由圖4可知，HCS-R9-1、HCS-R9-2、LCS-R9-1、LCS-R9-2的 R9上2號碳上質(zhì)子與 CS上 2號碳上質(zhì)子的積分面積比分別為1∶11.58、1∶5.95、1∶4.25、1∶1.1。由此根據(jù)以下公式：

圖4 各化合物的質(zhì)子積分面積

其中：［substituent］：取代基團(tuán)R9上2號碳的質(zhì)子數(shù)；［H］：CS上2號碳的質(zhì)子數(shù)；n：取代基團(tuán)上2號碳的總數(shù)。由此可以計算出本實驗所合成的CS-PR的取代度如下：HCS-R9-1：0.96；HCS-R9-2：1.87；LCS-R9-1：2.61；LCS-R9-2：10.10。

4 討論

本實驗所選用的起始原料殼聚糖和寡聚精氨酸均具有促進(jìn)透皮吸收的作用，故猜想殼聚糖的寡聚精氨酸修飾物具有更強的促進(jìn)作用。而前期所做的實驗，也驗證了HCS-R9具有一定的促進(jìn)透皮吸收的作用。分子量對于高分子化合物的性質(zhì)會有很大的影響。因此本實驗選用了不同分子量的 CS與 R9結(jié)合，并通過改變其摩爾比成功合成了不同取代度的CS-R9。先前查閱了一些文獻(xiàn)，有研究［11］表明通過改變反應(yīng)物的摩爾比可以改變?nèi)〈?，但尚未見有摩爾比與取代度具體對應(yīng)關(guān)系的報道。本實驗室之前嘗試過 R9與 HCS摩爾比為5∶1的反應(yīng)，但因其取代度較低，1H-NMR的譜圖與未取代的 HCS幾乎無差異，且考慮到HCS分子遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于R9分子，如若取代度過低，不能使產(chǎn)物發(fā)揮預(yù)期的優(yōu)于反應(yīng)物的透皮吸收促進(jìn)作用，于是提高了摩爾比，以獲得取代度更高的HCS-PR。因之前未進(jìn)行過 LCS與 R9的反應(yīng)，不知其摩爾比與取代度關(guān)系如何，因此本實驗進(jìn)行了摩爾比差異較大的兩組實驗。本實驗為后期研究反應(yīng)物的摩爾比與取代度的關(guān)系以及考察殼聚糖分子量、取代度對透皮吸收促進(jìn)作用的影響奠定了基礎(chǔ)。

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Synthesis and characterization of chitosan modified nonaarginine with different degrees of substitution

HE Wen1，LIU Bei2，GUO Xian-xi1
（1.Department of Pharmacy，Renmin Hospital of Wuhan University；2.School of Pharmaceutical Sciences，Wuhan University，Wuhan，Hubei 430060，China）

Objective To synthesize chitosan modified nonaarginine（CS-R9）with different degrees of substitution（DS）and to characterize the structure and DS by FTIR and 1H-NMR.Methods R9 and CS with high molecular weight（HCS）or low molecular weight （LCS）as the raw materials，a series of CS-R9 with different DS were synthesized by changing the mole ratio between them.The structure and DS of CS-R9 was characterized by FTIR and1HNMR.Results A series of CS-R9 was synthesized including HCS-R9 with the DS of 0.96 and 1.87，LCS-R9 with the DS of 2.61 and 10.10，respectively.Conclusions CS-R9 with different DS was synthesized successfully，which provides the basis for the further studies.

chitosan；nonaarginine；synthesis；molecular weight；substitution

10.3969／j.issn.1009-6469.2014.05.010

2013-10-29）