程開生，楊 祥，臧洪梅

（1.杭州銳思醫(yī)藥科技有限公司，浙江 杭州 310052；2.安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230032）

◇藥物分析◇

GC法檢測(cè)布洛芬注射液中雜質(zhì)F

程開生1，楊 祥1，臧洪梅2

（1.杭州銳思醫(yī)藥科技有限公司，浙江 杭州 310052；2.安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230032）

目的 建立氣相色譜法測(cè)定布洛芬注射液中的雜質(zhì) F。方法 采用氣相色譜法，色譜柱：DB-WAXetr毛細(xì)管柱（25 m× 0.53 mm ×2 μm），載氣為氦氣，流速5.0 mL·min-1，檢測(cè)器為火焰離子化檢測(cè)器，檢測(cè)器溫度為250℃，進(jìn)樣溫度為200℃。結(jié)果 在選定的條件下布洛芬和雜質(zhì)完全分離，雜質(zhì) F的檢測(cè)限為 2.5 mg·L-1，檢測(cè)方法的精密度、準(zhǔn)確度、靈敏度均達(dá)到了預(yù)定的分析要求。結(jié)論 建立的方法準(zhǔn)確、靈敏，適用于檢測(cè)布洛芬注射液中的雜質(zhì) F。

氣相色譜法；布洛芬；雜質(zhì)

布洛芬是一種臨床上廣泛使用的非甾體抗炎藥，屬于芳基烷酸類藥物，主要用于感冒、風(fēng)濕和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等疾病中炎癥和疼痛的控制。該藥劑型種類多，但國內(nèi)目前均為布洛芬片劑、混懸劑、膠囊劑等口服制劑［1-2］，為了解決難以口服藥物患者的用藥需求，研制布洛芬靜脈注射液用于治療疼痛和發(fā)熱具有一定的臨床意義。文獻(xiàn)報(bào)道布洛芬中可能存在的有關(guān)物質(zhì)有10余種，其中兩種降解產(chǎn)物具有成纖維細(xì)胞和紅細(xì)胞毒性［3-4］。國外藥典采用 HPLC方法對(duì)布洛芬原料中各種有關(guān)物質(zhì)設(shè)定了質(zhì)量檢查項(xiàng)，美國藥典（USP34）［5］對(duì)雜質(zhì)C、最大單雜和總雜進(jìn)行了限定，英國藥典（BP2009）［6］對(duì)雜質(zhì)A、F、J、N作為特定雜質(zhì)（specified impurity）控制，其中雜質(zhì)F采用GC法檢測(cè)，限度為0.1%。中國藥典2010版［7］僅對(duì)布洛芬原料設(shè)置了自身對(duì)照的薄層色譜法檢查有關(guān)物質(zhì)，對(duì)布洛芬制劑均未設(shè)置有關(guān)物質(zhì)檢查項(xiàng)。注射液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求比普通口服制劑要求高，特別是雜質(zhì)限度，本文擬對(duì)制劑中雜質(zhì) F的限度和檢測(cè)方法進(jìn)行探討，旨在為開發(fā)安全有效的布洛芬制劑提供借鑒。

布洛芬中的雜質(zhì) F，結(jié)構(gòu)和布洛芬極為相似（見圖1），采用薄層色譜和高效液相色譜不易將二者區(qū)分開來，英國藥典 BP采用 GC方法對(duì)原料中的雜質(zhì)F進(jìn)行了含量測(cè)定，但是由于注射液含有水分，不利于GC的檢測(cè)，因此筆者對(duì)該方法進(jìn)行了改進(jìn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示該方法快速、靈敏、準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性均較好，可以用于檢測(cè)制劑中雜質(zhì)F的含量，尤其是含水的制劑。

圖1 布洛芬和雜質(zhì) F的結(jié)構(gòu)

1 儀器與試藥

安捷倫7890A氣相色譜儀，包括安捷倫 chem-station色譜工作站、G7683B自動(dòng)進(jìn)樣器（美國）等；Mettler-Toledo XS-105十萬分之一電子天平。

乙酸乙酯（EtOAc）、N，N-二甲基甲酰胺二甲縮醛（DMF-DMA）、吡啶等為分析純。布洛芬注射液自制（規(guī)格 8 mL：0.8 g，批號(hào) 110401、110402、110403；規(guī)格4 mL：0.4 g，批號(hào) 110404、110405、110406）；布洛芬注射液市售（美國 Cumberland公司，4 mL：0.4 g，批號(hào)W029420AA）。布洛芬對(duì)照品（中國藥品生物制品檢驗(yàn)檢定所，批號(hào)100179-200804，含量99.5%）；雜質(zhì)F對(duì)照品（EUROPEAN PHARMACOPOEIA REFERENCE STANDARD；LGC GmbH，批號(hào)：1.4；Cat.No.Y0000140）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：DB-WAXetr毛細(xì)管柱（25 m×0.53 mm×2 μm）；載氣：氦氣，流速5.0 mL· min-1；檢測(cè)器：火焰離子化檢測(cè)器（尾吹：He：30 mL ·min-1，空氣：300 mL·min-1，H2：30 mL·min-1）；柱溫：157℃；檢測(cè)器溫度：250℃；進(jìn)樣溫度：200℃。

2.2 供試品溶液的配制

2.2.1 布洛芬注射液供試品溶液配制過程優(yōu)化

（1）布洛芬提取方法優(yōu)化：布洛芬注射液中的布洛芬與氨基酸成鹽，采用鹽酸將布洛芬置換沉淀出來，再用乙酸乙酯萃取沉淀即得布洛芬。

取本品適量（約相當(dāng)于布洛芬800 mg）加稀鹽酸適量酸化至無白色沉淀物出現(xiàn)，用乙酸乙酯 10 mL萃取，取乙酸乙酯層，氮?dú)獯蹈桑?0℃干燥，稱重，酸化萃取3次。見表1。

表1 酸化萃取優(yōu)化結(jié)果

上述研究表明，加2 mL稀鹽酸酸化后用乙酸乙酯萃取3次已基本萃取完全。

（2）乙酸乙酯萃取物純度檢查：按照布洛芬注射液注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)中含量檢查法（HPLC法）檢查布洛芬注射液和乙酸乙酯萃取物中布洛芬的含量，結(jié)果含量均大于99%，符合要求。

（3）甲基化試劑用量的選擇：取萃取次數(shù)選擇項(xiàng)下干燥物約50 mg，加入甲基化溶液1.0、1.5、2.0 mL溶解，密封，在100℃加熱20 min，冷卻至室溫，氮?dú)獯蹈?，將殘留物? mL乙酸乙酯溶解，作為供試品溶液。分別取1 μL注入氣相色譜儀，記錄色譜圖，考察不同用量甲基化試劑對(duì)衍生化反應(yīng)的影響。結(jié)果峰面積分別為28 579、27 597、28 950，表明甲基化試劑1.0 mL能使反應(yīng)順利完成，加大用量不影響布洛芬峰面積。因此，甲基化試劑用量應(yīng)為1.0 mL。

（4）衍生化時(shí)間選擇：取萃取次數(shù)選擇項(xiàng)下干燥物約50 mg，3份，分別加入1 mL的甲基化溶液溶解，密封，分別在100℃加熱10、20、30 min，冷卻至室溫，氮?dú)獯蹈?，將殘留物? mL乙酸乙酯溶解，作為供試品溶液。分別取 1 μL注入氣相色譜儀，記錄色譜圖，考察不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)衍生化反應(yīng)的影響。研究表明，反應(yīng)20 min能使反應(yīng)基本完成。

2.2.2 供試樣品按配制方法 Ⅰ、DMF-DMA的乙酸乙酯溶液：取甲基化溶液1 mL，加入4 mL乙酸乙酯搖勻，即得。

Ⅱ、布洛芬乙酸乙酯溶液：取布洛芬對(duì)照品50 mg用5 mL乙酸乙酯溶解，即得。

Ⅲ、雜質(zhì)F溶液：另取雜質(zhì)F（內(nèi)標(biāo)液）1 mL加入1 mL的甲基化溶液溶解，密封，分別在100℃加熱20 min，冷卻至室溫，氮?dú)獯蹈桑瑢埩粑镉? mL乙酸乙酯溶解。

Ⅳ、系統(tǒng)適用性溶液：取布洛芬注射液（約相當(dāng)于布洛芬800 mg），加雜質(zhì)F內(nèi)標(biāo)液，再加稀鹽酸2 mL酸化后，用乙酸乙酯萃取3次，每次10 mL，各份分別合并乙酸乙酯層，氮?dú)獯蹈桑?0℃干燥。取干燥物約50 mg，加入1 mL的甲基化溶液溶解，密封，分別在100℃加熱 20 min，冷卻至室溫，氮?dú)獯蹈桑瑢埩粑镉? mL乙酸乙酯溶解，作為供試品溶液。

Ⅴ、精氨酸溶液：取精氨酸678 mg加水8 mL溶解，加稀鹽酸2 mL酸化后，用乙酸乙酯萃取3次，每次10 mL，合并乙酸乙酯層，氮?dú)獯蹈?。結(jié)果無任何殘?jiān)?，表明萃取過程中已排除了精氨酸的干擾。不再進(jìn)樣。2.3 專屬性 按上述色譜條件，取上述溶液Ⅰ～Ⅳ，測(cè)定，結(jié)果見圖2。Ⅰ在2～5 min有峰，與系統(tǒng)適應(yīng)性對(duì)應(yīng)的布洛芬峰和雜質(zhì)F峰處無峰。Ⅱ在系統(tǒng)適應(yīng)性對(duì)應(yīng)的布洛芬峰處（tR＝16.65 min）有峰，雜質(zhì)F峰處無峰。Ⅲ在系統(tǒng)適應(yīng)性對(duì)應(yīng)的雜質(zhì)F處（tR＝25.55 min）有峰，布洛芬處無峰。Ⅳ在布洛芬和雜質(zhì) F分別出峰。結(jié)果表明，試劑、輔料均不干擾雜質(zhì)F測(cè)定，本法專屬性良好。

圖2 氣相色譜分離圖

2.4 穩(wěn)定性 系統(tǒng)適應(yīng)性溶液在室溫下放置，在0、18、24 h時(shí)，分別精密量取1 μL，注入色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果顯示試驗(yàn)表明，雜質(zhì) F在18 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 回收率 取本品9份，每份適量（約相當(dāng)于布洛芬 800 mg），分別加雜質(zhì) F內(nèi)標(biāo)液 19.2 mL （120%濃度）、16 mL（100%濃度）、8 mL（50%濃度），分別再加稀鹽酸 2 mL酸化后，用乙酸乙酯萃取3次，每次10 mL，各份分別合并乙酸乙酯層，氮?dú)獯蹈桑?0℃干燥。取干燥物約 50 mg，加入 1 mL的甲基化溶液溶解，密封，分別在 100℃加熱 20 min，冷卻至室溫，氮?dú)獯蹈?，將殘留物? mL乙酸乙酯溶解，作為供試品溶液。每份均按上述方法配制。

另取雜質(zhì)F（內(nèi)標(biāo)液）1 mL加入1 mL的甲基化溶液溶解，密封，分別在100℃加熱20 min，冷卻至室溫，氮?dú)獯蹈?，將殘留物?5 mL乙酸乙酯溶解，作為雜質(zhì) F溶液。

分別取1 μL注入氣相色譜儀，記錄色譜圖，考察回收率，結(jié)果見表2。

表 2 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝3）

樣品名稱 量／mg 峰面積 測(cè)得量／mg加入 回收率／%平均回收率／%RSD／%雜質(zhì)F 0.05 15.4— —50%濃度100%濃度106.2 3.50 120%濃度0.025 0.025 0.025 0.05 0.05 0.05 0.06 0.06 8.3 8.1 8.9 16.1 16.3 16.0 19.4 19.4 0.027 0.026 0.029 0.052 0.053 0.052 0.063 0.063 107.8 105.2 115.6 104.5 105.8 103.9 105.0 105.0 0.0619.10.062103.4

可見本法中，雜質(zhì)F的平均回收率為 106.2%，回收率良好。

2.6 檢測(cè)限 取回收率項(xiàng)下50%濃度樣品1 mL，加入乙酸乙酯1 mL，搖勻，精密量取1 μL進(jìn)樣。結(jié)果信噪比約為3∶1，此法雜質(zhì)F檢測(cè)限為 2.5 mg· L-1。

2.7 雜質(zhì) F檢查 取本品自制兩個(gè)規(guī)格（六批）和市售兩個(gè)規(guī)格（兩批），按上述方法檢驗(yàn)結(jié)果見表3。

研究表明，本品自制樣品和市售樣品的雜質(zhì) F均小于0.1%。

表3 布洛芬注射液有關(guān)物質(zhì)測(cè)定結(jié)果（%）

3 討論

英國藥典（BP2009）中布洛芬的雜質(zhì)F的GC檢測(cè)方法適用于無水樣品，因此筆者以BP2009為基礎(chǔ)，優(yōu)化布洛芬注射液中雜質(zhì) F的檢查方法，并進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。

布洛芬注射液為水溶液，不利于 GC毛細(xì)管柱分析；甲基化試劑（DMF-DMA）極易水解，布洛芬和精氨酸以鹽的形式存在，不利于衍生化反應(yīng)；因此需對(duì)供試樣品配制方法進(jìn)行改進(jìn)：先用酸化法，將布洛芬和雜質(zhì) F將其置換出來，利用相似相溶原理，采用乙酸乙酯將布洛芬和雜質(zhì) F提取出來，得到其混合物，通過甲基（酯）化反應(yīng)，利用布洛芬和雜質(zhì)F甲基化產(chǎn)物沸點(diǎn)不同，通過 GC將其分離。

因此本文對(duì)供試品的配置中鹽酸的用量和萃取的次數(shù)，提取物的純度，衍生化條件進(jìn)行考察。

文中所用的GC法測(cè)定精氨酸布洛芬注射液中雜質(zhì)F的含量，其重復(fù)性好，操作簡便，可用于訂立精氨酸布洛芬注射液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。雜質(zhì) F加樣回收率大于100%可能與樣品中含有低于檢測(cè)限的雜質(zhì)F有關(guān)。

［1］ 裴小龍，宋愿智，楊 欣.布洛芬不同劑型微生物限度檢查方法驗(yàn)證匯總［J］.安徽醫(yī)藥，2013，17（10）：1681-1682.

［2］ 劉 瑞，劉福利，羅國平，等.HPLC法測(cè)定布洛芬注射液中精氨酸的含量［J］.西北藥學(xué)雜志，2013，28（4）：361-365.

［3］ Dondoni A，Dall＇Occo T，F(xiàn)anyin G，et al.Studies on the actual and potential impurities in ibuprofen［J］.Farmaco Prat，1986，41（7）：237-244.

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［5］ 美國藥典委員會(huì).美國藥典（USP32 NF27）［S］，2009：2607.

［6］ 歐洲藥品質(zhì)量委員會(huì).歐洲藥典［S］，6.8版，2008：5953.

［7］ 國家藥典委員會(huì).中國藥典：二部［S］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：120.

Determination of impurity F in ibuprofen injection by gas chromatography

CHENG Kai-sheng1，YANG Xiang1，ZANG Hong-mei2
（1.Hangzhou Raise Medical Technology Co.，Ltd，Hangzhou 310052，China；2.College of Pharmaceutics，Anhui Medical University，Hefei 230032，China）

Objective To establish a GC method to determine the impurity F in ibuprofen and its preparations.Methods The GC method was performed on a ZB-WAXetr capillary column（25 m×0.53 mm×2 μm）and FID detector.The carrier gas was He with flow rate at 5 ml／min.The injector temperature and the detector temperature were 200℃ and 250℃，respectively.Results Under the described chromatographic condition，The impurity F was completely separated from ibuprofen.The LOD of impurity F was 2.5 mg· L-1.Conclusions The analytical method is simple，accurate and sensitive with good reproducibility.It can be used to determine impurity F in ibuprofen and its preparations.

gas chromatography；ibuprofen；impurity

10.3969／j.issn.1009-6469.2014.05.009

2013-11-08，

2014-01-20）

科技部中小企業(yè)創(chuàng)新基金課題（No 09C26223304082）；杭州市種子基金課題（No 20090531K10）