章安源 馮 濤 陳 玲 李淑花 牛華星 張志民 劉霄飛 劉道中（山東省獸藥質(zhì)量檢驗(yàn)所 山東 濟(jì)南 250022）

內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法測(cè)定氟尼辛葡甲胺注射液含量的比較分析

章安源 馮 濤 陳 玲 李淑花 牛華星 張志民 劉霄飛 劉道中（山東省獸藥質(zhì)量檢驗(yàn)所 山東 濟(jì)南 250022）

比較內(nèi)標(biāo)定量法和外標(biāo)定量法在測(cè)定氟尼辛葡甲胺注射液含量的差異。運(yùn)用高效液相色譜法對(duì)樣品進(jìn)行分析，然后分別采用內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法計(jì)算其含量。內(nèi)標(biāo)法的準(zhǔn)確度和精密度均優(yōu)于外標(biāo)法，內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法之間無(wú)顯著性差異。高效液相色譜法分析含量，采用內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法的定量方式獲得的結(jié)果均能滿足檢測(cè)要求。分析人員可根據(jù)實(shí)際情況視實(shí)驗(yàn)室條件而使用相應(yīng)的定量方式。

氟尼辛葡甲胺注射液 含量 高效液相色譜法 內(nèi)標(biāo)法 外標(biāo)法

氟尼辛葡甲胺注射液含量能準(zhǔn)確定量分析的標(biāo)準(zhǔn)方法是《2010版藥典》高效液相色譜法內(nèi)標(biāo)定量，雖然內(nèi)標(biāo)法是標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)方法，但操作過(guò)程較復(fù)雜，并且還需要使用內(nèi)標(biāo)物。為求實(shí)驗(yàn)方法簡(jiǎn)便、快捷、準(zhǔn)確，以提高效率，本文采用外標(biāo)定量法來(lái)檢測(cè)同一規(guī)格、10個(gè)廠家共計(jì)10批的氟尼辛葡甲胺注射液含量，并和內(nèi)標(biāo)定量法做出比較，測(cè)定結(jié)果無(wú)顯著性差異，在檢測(cè)大批量的樣品時(shí)，外標(biāo)法為工作帶來(lái)了實(shí)效。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

WatersE2695高效液相色譜儀，waters2998紫外檢測(cè)器；氟尼辛葡甲胺對(duì)照品(中國(guó)獸藥藥品監(jiān)察所，批號(hào)H0611111，含量99.9%)。氟尼辛葡甲胺注射液(不同廠家規(guī)格相同(5%)10批：批號(hào)分別為(2013)2251山東天振藥業(yè)有限公司、(2013)4486齊魯動(dòng)物保健品有限公司、(2013)5230山東魯抗立科藥物化學(xué)有限公司、(2013)5824煙臺(tái)綠葉動(dòng)物保健品有限公司、(2013)7696山東誼源動(dòng)物藥業(yè)有限公司、(2014)0211文登市雨澤銀豐動(dòng)物藥業(yè)有限公司、(2014)0688齊魯動(dòng)物保健品有限公司、(2014)2773濰坊富邦藥業(yè)有限公司、(2014)2929山東中牧獸藥有限公司、(2014)3406文登市雨澤銀豐動(dòng)物藥業(yè)有限公司)。甲醇(色譜純)水為三級(jí)水，其余試劑均為分析純。

1.2 色譜條件

色譜柱：Waters symmetryC18.5μm 4.8×150mmm columon；流動(dòng)相：甲醇-水-冰醋酸(70∶30∶1)；柱溫：25℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：254nm；流速：1.0mol/L/min；進(jìn)樣體積：20μl。

1.3 內(nèi)標(biāo)法

1.3.1 內(nèi)標(biāo)溶液的制備[1]取苯甲酸鈉適量，加水溶解并稀釋制成每1ml中含33mg的溶液，作為內(nèi)標(biāo)溶液。

1.3.2 校正因子[1]的測(cè)定 另取氟尼辛葡甲胺對(duì)照品約83mg(約相當(dāng)于氟尼辛50mg)，精密稱定，置50ml量瓶中，加適量甲醇-水(7∶3)使溶解，精密加入內(nèi)標(biāo)溶液5ml，用甲醇-水(7∶3)稀釋至刻度，搖勻；精密量取5ml，置25ml量瓶中，用甲醇-水（7∶3）稀釋至刻度，搖勻，取20μl注入液相色譜儀，計(jì)算校正因子。

1.3.3 供試品溶液制備 精密量取本品適量(約相當(dāng)于氟尼辛50mg)，置50ml量瓶中，加適量甲醇-水(7∶3)使溶解，精密加入內(nèi)標(biāo)溶液5ml，用甲醇-水(7∶3)稀釋至刻度，搖勻；精密量取5ml，置25ml量瓶中，用甲醇-水(7∶3)稀釋至刻度，搖勻，取20μl注入液相色譜儀，測(cè)定、計(jì)算。

2 結(jié)果與討論

2.1 專屬性試驗(yàn)[2]

用內(nèi)標(biāo)法分別對(duì)10個(gè)相同規(guī)格的氟尼辛葡甲胺供試品進(jìn)行測(cè)定；按照內(nèi)標(biāo)溶液的制備方法，取內(nèi)標(biāo)溶液苯甲酸鈉10μl加入供試品中，內(nèi)標(biāo)溶液出峰快，見(jiàn)圖1.內(nèi)標(biāo)峰和氟尼辛葡甲胺注射液對(duì)照品、供試品完全分離。見(jiàn)圖2，圖3。

圖1 苯甲酸鈉內(nèi)標(biāo)

圖2 內(nèi)標(biāo)法-氟尼辛葡甲胺對(duì)照品

圖3 內(nèi)標(biāo)法-供試品(4486齊魯動(dòng)物保健品有限公司)

2.2 外標(biāo)法

2.2.1 對(duì)照品溶液 取對(duì)照品50mg，置50ml量瓶中，加適量甲醇-水(7∶3)使溶解，用甲醇-水(7∶3)稀釋至刻度，搖勻；精密量取5ml，置25ml量瓶中，用甲醇-水(7∶3)稀釋至刻度，搖勻，精密量取20μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖，見(jiàn)圖4。

2.2.2 供試品溶液 約相當(dāng)于氟尼辛50mg，置50ml量瓶中，加適量甲醇-水(7∶3)使溶解，用甲醇-水(7∶3)稀釋至刻度，搖勻；精密量取5ml，置25ml量瓶中，用甲醇-水(7∶3)稀釋至刻度，搖勻，精密量取20μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖，見(jiàn)圖5。

圖4 外標(biāo)法-氟尼辛葡甲胺對(duì)照品

圖5 外標(biāo)法-供試品(4486齊魯動(dòng)物保健品有限公司)

2.3 線性關(guān)系分析

精密稱取氟尼辛葡甲胺對(duì)照品適量，分別制成濃度為0.5、1、2、4、20、40、80μg/ml的溶液，按照外標(biāo)含量測(cè)定項(xiàng)下的方法進(jìn)行測(cè)定，取以上7個(gè)濃度對(duì)照品5μl注入液相色譜儀，平行進(jìn)樣各兩次，以兩次峰面積平均值為縱坐標(biāo)，以濃度C(μg/ml)為橫坐標(biāo)(見(jiàn)圖5），并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，得到氟尼辛葡甲胺對(duì)照品的回歸方程為y=0.0245x-0.0056 (R2=0.9996，n=7)，線性范圍為0.5～80μg/ml。表明線性良好。

2.4 精密度

取對(duì)照品溶液在上述色譜條件下，重復(fù)進(jìn)樣6次，每次1μl，峰面積的RSD為0.3%。

2.5 重復(fù)性

取同一供試品(4486齊魯動(dòng)物保健品有限公司)約1g，精密稱定，按供試品制備方法制備6份供試品溶液，測(cè)定，結(jié)果平均含量為99.2%，RSD為1%，重復(fù)性好。

圖5 氟尼辛葡甲胺對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.6 穩(wěn)定性

取同一份供試品溶液，間隔0,1,2,4,6,8,10h分別記錄，記錄峰面積，結(jié)果RSD為3%，表明被測(cè)溶液在10h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.7 含量結(jié)果

2.7.1 內(nèi)標(biāo)法、外標(biāo)法含量 參照《中國(guó)獸藥典2010》二部對(duì)氟尼辛葡甲胺注射液含量測(cè)定方法(內(nèi)標(biāo)法)及外標(biāo)法對(duì)收集的樣品進(jìn)行含量測(cè)定，每個(gè)供試品進(jìn)樣6次。含量結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 內(nèi)標(biāo)法與外標(biāo)法測(cè)定氟尼辛葡甲胺甲胺注射液含量 (%)

內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法的相對(duì)偏差無(wú)規(guī)律，相對(duì)偏差集中在0.27%～1.84%之間，偏差幅度不一致，表明內(nèi)標(biāo)法與外標(biāo)法之間不可能存在系統(tǒng)誤差。

2.7.2 精密度和準(zhǔn)確度的比較 對(duì)內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法測(cè)得的氟尼辛葡甲胺含量數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)和準(zhǔn)確度等數(shù)據(jù)列于表2.內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法測(cè)得的10個(gè)樣品含量水平的RSD和相對(duì)誤差均小于5%，滿足檢測(cè)工作需要。但內(nèi)標(biāo)法的RSD顯然小于外標(biāo)法的RSD，即精密度方面內(nèi)標(biāo)法優(yōu)于外標(biāo)法；準(zhǔn)確度方面，內(nèi)標(biāo)法也要優(yōu)于外標(biāo)法。

2.7.3 顯著性差異分析 對(duì)內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法測(cè)得的氟尼辛葡甲胺注射液含量數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)分析，以判斷兩者之間是否存在顯著性差異[3]，結(jié)果見(jiàn)表2。顯然，內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法測(cè)得的10組數(shù)據(jù)之間無(wú)顯著差異(P＞0.05)。

3 結(jié)論

3.1 外標(biāo)法的優(yōu)缺點(diǎn) 外標(biāo)法操作簡(jiǎn)便，十分合適大量樣品分析。但進(jìn)樣量要求十分準(zhǔn)確，要嚴(yán)格控制在與對(duì)照品相同的操作條件下進(jìn)行，分析誤差易人為造成，經(jīng)常得不到準(zhǔn)確的測(cè)量結(jié)果。每次樣品分析的相同的操作條件下進(jìn)行很難完全相同，如流動(dòng)相的配制、室溫、檢測(cè)器的響應(yīng)性能等，否則造成分析誤差，得不到準(zhǔn)確的測(cè)量結(jié)果。

表2 內(nèi)標(biāo)法與外標(biāo)法測(cè)定氟尼辛葡甲胺注射液含量結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析(%)

3.2 內(nèi)標(biāo)法的優(yōu)缺點(diǎn) 測(cè)定的結(jié)果較為準(zhǔn)確，由于通過(guò)測(cè)量?jī)?nèi)標(biāo)物(即校正因子)及欲測(cè)組分的峰面積的相對(duì)值來(lái)進(jìn)行計(jì)算，因而在一定程度上消除了操作條件(如進(jìn)樣量的變化、色譜條件的微小變化)等的變化所引起的誤差，別是在樣品前處理前加入內(nèi)標(biāo)物，然后再進(jìn)行前處理，可部分補(bǔ)償欲測(cè)組分在樣品前處理時(shí)的損失。內(nèi)標(biāo)法結(jié)果的精密度和準(zhǔn)確度均較好，但操作較為麻煩。

內(nèi)標(biāo)與外標(biāo)都是定量的一種方法，應(yīng)用內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法分析氟尼辛葡甲胺注射液的含量結(jié)果，本試驗(yàn)兩者之間也不存在顯著性差異(P＞0.05)。本試驗(yàn)內(nèi)外標(biāo)法的準(zhǔn)確度、精密度均滿足檢測(cè)工作需要(RSD＞0.05)，至于哪一種方法好不能一概而論，應(yīng)根據(jù)不同的分析要求，以及實(shí)驗(yàn)室的條件(如有無(wú)自動(dòng)進(jìn)樣設(shè)備、有無(wú)所需的試劑)等情況來(lái)決定。應(yīng)用外標(biāo)法如果能夠滿足要求，可以優(yōu)先考慮外標(biāo)法，簡(jiǎn)單而省事，進(jìn)樣體積的重現(xiàn)性很好，不用內(nèi)標(biāo)也具很好的分析精度，加入內(nèi)標(biāo)反而對(duì)分析不利[4]。對(duì)于精密度要求比較高、結(jié)果準(zhǔn)確度會(huì)產(chǎn)生重大影響、實(shí)驗(yàn)室條件不是很理想的條件下，用內(nèi)標(biāo)法還是必要的。無(wú)論應(yīng)用那種定量方法，都應(yīng)做好方法的驗(yàn)證和確認(rèn)工作，只要是按照程序經(jīng)過(guò)驗(yàn)證和確認(rèn)的方法，都可以應(yīng)用[5]。

[1] 中國(guó)獸藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)獸藥典2010版2部[S].

[2] 邱凈英, 梁光義, 蔣品等. 高效毛細(xì)管電泳內(nèi)標(biāo)法與外標(biāo)法含量測(cè)定的比較[J]. 光譜實(shí)驗(yàn)室, 2012, 29(5)∶ 2616-2621.

[3] 徐靜, 黃建軍. 氣相色譜檢測(cè)白酒中乙酸乙酯內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法的比較研究[J]. 柳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報(bào), 2006, 6(4)∶ 61-63.

[4] 涂新軍, 譚奧, 徐明輝. 內(nèi)標(biāo)法在液相色譜應(yīng)用中的局限性[J]. 中國(guó)藥事, 1998, 12(6)∶ 387-388.

[5] 黃誠(chéng), 盧麗明, 劉國(guó)平. 內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法測(cè)定血液中乙醇含量的比較分析[J]. 生命科學(xué)儀器, 2008,6(3)∶ 41-43.

S859.7

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1007-1733(2014)11-0003-03

2014–08–12）