邢玉新 王 衛(wèi) 桑曉旻 趙元順 張春澤

靶向Ang-1的siRNA片段逆轉(zhuǎn)人胃腺癌細(xì)胞株BGC-823侵襲表型的研究

邢玉新1王 衛(wèi)2桑曉旻2趙元順3張春澤4△

目的 利用RNA干擾技術(shù)沉默人胃腺癌細(xì)胞株BGC-823中血管生成因子1（Ang-1）的表達(dá)，觀察其對(duì)腫瘤侵襲性的抑制效果。方法設(shè)計(jì)靶向Ang-1的siRNA片段并轉(zhuǎn)染人胃腺癌細(xì)胞株BGC-823；RT-PCR方法檢測(cè)Ang-1的mRNA水平；Western Blot和細(xì)胞免疫熒光方法檢測(cè)整合素β1、CD44V6和Ang-1的蛋白表達(dá)量和細(xì)胞定位；細(xì)胞黏附試驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞黏附能力；Matrigel膠及Transwell雙室培養(yǎng)體系檢測(cè)癌細(xì)胞侵襲能力。結(jié)果RTPCR結(jié)果顯示所設(shè)計(jì)的siRNA片段可有效沉默Ang-1的mRNA表達(dá)；整合素β1、CD44V6和Ang-1蛋白主要定位于腫瘤細(xì)胞胞漿和胞膜，其表達(dá)水平較轉(zhuǎn)染siRNA片段前均有不同程度降低；細(xì)胞黏附能力和侵襲能力均明顯降低（P＜0.01）。結(jié)論靶向Ang-1的siRNA技術(shù)可有效降低人胃腺癌細(xì)胞株BGC-823的侵襲能力，為胃癌基因治療提供了新的思路。

血管生成素1；RNA干擾；胃腫瘤；腫瘤侵潤(rùn)；抗原,CD29；抗原,CD44

瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的重要表征，也是腫瘤術(shù)后復(fù)發(fā)的主要原因[1]。血管生成因子1（angiopoietin-1,Ang-1）在促進(jìn)腫瘤新生血管形成、降解周圍基質(zhì)和腫瘤細(xì)胞遷移過(guò)程中發(fā)揮重要作用，被視為腫瘤基因治療的重要靶點(diǎn)[2]。RNA干擾（RNA interference，RNAi）是一種由雙鏈RNA誘發(fā)的基因沉默現(xiàn)象，其機(jī)制是通過(guò)阻礙特定基因轉(zhuǎn)錄來(lái)抑制基因表達(dá)。本研究利用RNAi技術(shù)沉默人胃腺癌細(xì)胞株BGC-823中Ang-1的表達(dá)，從多角度觀察其對(duì)胃腺癌細(xì)胞侵襲性的抑制效果。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 人胃腺癌細(xì)胞株BGC-823購(gòu)自中科院上海生物細(xì)胞研究所；胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司；DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、Transwell培養(yǎng)皿購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；山羊抗人整合素β1抗體和兔抗人CD44V6抗體購(gòu)自美國(guó)SANTA公司；兔抗人Ang-1抗體和免疫熒光檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購(gòu)自Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與siRNA轉(zhuǎn)染 胃腺癌細(xì)胞株BGC-823在含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)液中加入100 U/mL青霉素和100 g/mL鏈霉素。每4～5 d傳代1次。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的BGC-823細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組轉(zhuǎn)染siRNA-Cotrol，實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染siRNA-Ang-1，分別將siRNA-Cotrol和siRNA-Ang-1與Lipofectamine 2000在無(wú)血清DMEM中輕柔混合后靜置20 min備用，用DMEM漂洗2次，加入Lipofectamine 2000-siRNA復(fù)合物，37℃、5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 h，加入胎牛血清終止轉(zhuǎn)染。Ang-1的siRNA靶序列為：5′-GCGATCCTTAGCACACTTGTAA-3′（登記號(hào)：AB009873），由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。

1.2.2 RT-PCR檢測(cè)Ang-1 mRNA表達(dá) 采用Trizol試劑一步法提取細(xì)胞總RNA，用分光光度計(jì)驗(yàn)證RNA純度；逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以β-actin為內(nèi)參進(jìn)行PCR擴(kuò)增。Ang-1引物：上游為5′-CAACGGTTGACTGGCTG-3′，下游為5′-GAATCGGTCTAAGACC-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為193 bp；β-actin引物：上游為5′-GGCTGGGTTTCTGCTACGCT-3′，下游為5′-CATGTCTCGATCCCACTTAAC-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為357 bp。反應(yīng)參數(shù)：94℃預(yù)變性5 min，然后94℃50 s，56℃45 s，72℃45 s，共32個(gè)循環(huán)，再72℃延伸5 min；PCR產(chǎn)物于2％瓊脂糖凝膠電泳分離，凝膠成像系統(tǒng)掃描成像，紫外燈下觀察電泳條帶，求得每個(gè)待測(cè)產(chǎn)物與β-actin產(chǎn)物吸光度（A）值之比，進(jìn)行半定量分析。

1.2.3 Western Blot檢測(cè)整合素β1、CD44V6和Ang-1蛋白表達(dá) 提取總蛋白，Bradford法蛋白定量。PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)染色蛋白分離滿意，將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜上，Western封閉液封閉，滴加抗體4℃水平搖床過(guò)夜，各抗體稀釋度為整合素β1（1∶1 000）、CD44V6（1∶1 500）、Ang-1（1∶500），次日加入辣根酶標(biāo)記二抗?；瘜W(xué)發(fā)光試劑盒顯影，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)掃描化學(xué)發(fā)光光密度值，Quantity One軟件分析。

1.2.4 細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)整合素β1、CD44V6和Ang-1蛋白定位 轉(zhuǎn)染前進(jìn)行細(xì)胞爬片，3％H2O2消除過(guò)氧化物酶，山羊血清封閉30 min，加入一抗4℃過(guò)夜，各抗體稀釋度為整合素β1（1∶1 000）、CD44V6（1∶1 500）、Ang-1（1∶500），加入羅丹明或綠色熒光素酶標(biāo)記二抗（1∶200），hoechst 33258復(fù)染，封片后鏡下觀察。

1.2.5 細(xì)胞黏附試驗(yàn) 纖黏蛋白基底以50μL/孔包被96孔板，4℃過(guò)夜。胎牛血清白蛋白作為對(duì)照。0.25％胰蛋白酶消化細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，濃度為1×105/mL，每孔100μL，37℃培養(yǎng)1 h。用磷酸鹽緩沖液輕柔洗去未黏附細(xì)胞，加入無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液150μL，MTT液50μL，37℃培養(yǎng)4 h，每孔加入二甲基亞砜原液100μL，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔570 nm波長(zhǎng)處A值，按以下公式計(jì)算出黏附率：黏附率=（實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞A570值/對(duì)照組細(xì)胞A570值－1）×100％。

1.2.6 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 在Transwell上室的聚碳酸酯膜上加入Matrigel基質(zhì)膠60 μL，37℃、30 min使基質(zhì)膠凝固；將轉(zhuǎn)染與未轉(zhuǎn)染Ang-1 siRNA的BGC-823細(xì)胞按104個(gè)細(xì)胞/孔接種于Transwell上室，下室加入600 μL含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。48 h后取出上室，濕棉簽拭去膜表面未穿過(guò)膜的細(xì)胞，蘇木素染色后封片。倒置顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)穿過(guò)膜的細(xì)胞數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 16.0軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Ang-1 mRNA表達(dá) siRNA-Ang-1轉(zhuǎn)染24 h后，BGC-823細(xì)胞表達(dá)的Ang-1 mRNA水平明顯降低，至第48 h后開(kāi)始持續(xù)在較低水平，但至72 h后又逐漸升高，見(jiàn)圖1。

Fig.1 Ang-1 mRNA transcription after siRNA-Ang-1 transfection圖1 siRNA-Ang-1轉(zhuǎn)染后Ang-1 mRNA表達(dá)電泳圖

2.2 整合素β1、CD44V6和Ang-1蛋白表達(dá) 提取的細(xì)胞總蛋白的時(shí)間點(diǎn)選在siRNA轉(zhuǎn)染后48 h進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)組中整合素β1、CD44V6和Ang-1蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組降低，見(jiàn)圖2。

Fig.2 Expression of invasion related protein in siRNA-Ang-1 and siRNA-control group圖2 Western Blot檢測(cè)2組細(xì)胞侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)

2.3 細(xì)胞免疫熒光結(jié)果 整合素β1、CD44V6和Ang-1主要表達(dá)于細(xì)胞漿和細(xì)胞膜部位，siRNAAng-1轉(zhuǎn)染48 h后，上述各蛋白質(zhì)對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度均有明顯降低，見(jiàn)圖3。

2.4 細(xì)胞黏附及侵襲能力比較 對(duì)照組BGC-823細(xì)胞黏附率為（74.67±12.44）％，高于實(shí)驗(yàn)組的（30.34±7.27）％，（t=8.702，P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)組從Transwell上室向下室遷移的細(xì)胞數(shù)量（17.29± 4.73）％，較對(duì)照組（45.71±9.13）％明顯減少（t=7.818，P＜0.05），見(jiàn)圖4。

3 討論

胃癌是嚴(yán)重威脅人類生命健康的惡性腫瘤之一，當(dāng)前臨床多采用以手術(shù)為主，聯(lián)合放、化療等的綜合措施予以治療，但晚期胃癌患者術(shù)后5年生存率仍不足15％[3]。研究表明，胃癌的侵襲生長(zhǎng)特性與瘤細(xì)胞的無(wú)控性增殖、周圍基質(zhì)降解、細(xì)胞黏附力增強(qiáng)及新生血管形成等有關(guān)[4]。通過(guò)基因干預(yù)手段影響上述分子事件發(fā)生和進(jìn)展，對(duì)于降低癌細(xì)胞侵襲性，延長(zhǎng)患者生命，爭(zhēng)取手術(shù)最佳切除或二次手術(shù)機(jī)會(huì)有重要意義。

3.1 RNAi的作用及機(jī)制 RNAi是細(xì)胞本身固有的對(duì)抗外源基因及其侵害的一種自我保護(hù)現(xiàn)象，是雙鏈RNA(dsRNA)分子在mRNA水平關(guān)閉相應(yīng)序列及基因的表達(dá)使其沉默的過(guò)程。當(dāng)細(xì)胞中導(dǎo)入與內(nèi)源性mRNA編碼區(qū)同源的dsRNA時(shí)，該mRNA發(fā)生降解而導(dǎo)致基因表達(dá)沉默[5]。RNAi具有高效性、高特異性、高穩(wěn)定性和高穿透性等特點(diǎn)[6]。RNAi抑制基因表達(dá)的效應(yīng)可以穿過(guò)細(xì)胞界限，在不同細(xì)胞間長(zhǎng)距離傳遞和維持。本研究針對(duì)Ang-1進(jìn)行RNA干擾治療，觀察其對(duì)胃腺癌細(xì)胞侵襲性的影響。

3.2 Ang-1在胃癌細(xì)胞中的作用及機(jī)制 Ang-1是血管內(nèi)皮細(xì)胞上酪氨酸激酶受體家族Tie2受體的配體，和血管表皮生長(zhǎng)因子不同，Ang-1和Tie2受體的結(jié)合并不促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，而是通過(guò)調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞與周圍間質(zhì)細(xì)胞的相互作用而發(fā)揮維持血管穩(wěn)定、促進(jìn)新生血管成熟化的作用。阻斷Ang-1 和Tie2受體的結(jié)合可以發(fā)現(xiàn)腫瘤內(nèi)新生血管內(nèi)皮細(xì)胞和周圍間質(zhì)細(xì)胞缺乏緊密連接，血管分支不足且不能形成完整的管狀結(jié)構(gòu)[7]。細(xì)胞運(yùn)動(dòng)是腫瘤轉(zhuǎn)移的基本條件，在整合素β家族中以整合素β1與胃癌轉(zhuǎn)移關(guān)系最為密切，其介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與基質(zhì)之間的反應(yīng)，參與細(xì)胞黏附和遷移等多個(gè)生理過(guò)程。新近研究發(fā)現(xiàn)，整合素β1也可作為受體與Ang-1結(jié)合，介導(dǎo)Ang-1的促黏附作用[8]。CD44V屬于另一類黏附分子家族，分為CD44V（1～10）10種亞型，與透明質(zhì)酸等配體結(jié)合，介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與基質(zhì)之間的黏附功能。陳慧娟等[9]研究發(fā)現(xiàn)Ang-l能明顯提高人胃癌細(xì)胞BGC-823中整合素β1、 CD44V6的mRNA水平，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的黏附和轉(zhuǎn)移。本研究通過(guò)siRNA技術(shù)有效沉默了Ang-1 mRNA及蛋白水平的表達(dá)，并檢測(cè)了其對(duì)整合素β1 和CD44V6的表達(dá)影響，結(jié)果顯示經(jīng)有效沉默人胃腺癌細(xì)胞株BGC-823中Ang-1的表達(dá)后，整合素β1 和CD44V6的表達(dá)水平發(fā)生同向性降低，提示Ang-1可能通過(guò)直接或間接協(xié)同作用，與整合素β1和CD44V6一起參與胃癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程，而靶向Ang-1的siRNA技術(shù)可有效抑制該惡性表型。

本實(shí)驗(yàn)所選用的Transwell雙室培養(yǎng)皿的濾膜孔徑為8 μm，由于膜孔被Matrigel覆蓋，細(xì)胞不能自由穿過(guò)，必須分泌水解酶，并通過(guò)變形運(yùn)動(dòng)穿過(guò)這種鋪有Martrigel的濾膜。以上兩種材料的結(jié)合應(yīng)用已成為當(dāng)前研究腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移能力的重要工具。本研究通過(guò)沉默人胃腺癌細(xì)胞株BGC-823中Ang-1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞系的侵襲和遷移能力明顯降低。接下來(lái)課題組將嘗試將這一技術(shù)在動(dòng)物荷瘤鼠模型中加以驗(yàn)證。

Fig.3 The subcellular localization of invasion-related protein in siRNA-Ang-1 and siRNA-control group shown by cell Immunofluorescence(×400)圖3 2組中侵襲相關(guān)蛋白的細(xì)胞定位表達(dá)(×400)

Fig.4 Cell migration and invasion were assessed using transwell migration and invasion assays in siRNA-Ang-1 and siRNA-control group(×200)圖4 Transwell檢測(cè)2組腫瘤細(xì)胞的遷移能力(×200)

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（2013-09-03收稿 2014-03-13修回）

（本文編輯 李鵬）

Study of Reversing Invasion of Human Gastric Cancer Cell Line BGC-823 by Targeting Angiopoietin-1 Using siRNA

XING Yuxin1，WANG Wei2，SANG Xianmin2，ZHAO Yuanshun3，ZHANG Chunze4
1 Department of General Surgery,Tianjin Occupational Prevention and Treatment Hospital＆Tianjin Worker’s Hospital, Tianjin 300011,China；2 Department of Anus＆Intestine Surgery,Tianjin Dagang Oil Field General Hospital；3 Department of Hepatobiliary Surgery and Liver Transplantation Center,Beijing YouAn Hospital,Capital Medical University；4 Department of Anus＆Intestine Surgery,Tianjin People’s Hospital ZHANG Chunze,E-mail:zhangchunzetj@163.com

ObjectiveTo knock down angiopoietin-1 expression in human gastric cancer cell line BGC-823 and to observe its effect of reversing tumor invasion.MethodssiRNA sequence fragments was designed to target angiopoietin-1 and transferred into human gastric cancer cell line BGC-823.RT-PCR was used to assess the transcription level of angiopoietin-1 mRNA,then western blot and immunofluorescence were used to examine the expression level of three invasion-associated proteins include integrin β1,CD44V6 and Ang-1.Cell adhesion ability was evaluated by cell adhesion assay and cell invation was determined by matrigel and transwell plastic dual-chamber culture system.ResultsAng-1 mRNA was knocked down by siRNA showed by RT-PCR.The expression of integrin β1,CD44V6 and Ang-1 were significantly lower than control group（P＜0.05）,so did the cellular adhesion and invasion abilities（P＜0.05）.ConclusionKnocking down angiopoietin-1 by siRNA can reverse invasion of human gastric cancer cell line BGC-823 and may provide new ideas and reference for gene therapy of gastric cancer in the future.

angiopoietin-1；RNA interference；stomach neoplasms；neoplasm invasiveness；antigens,CD29；antigens,CD44

R735.2

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.08.005

1天津市職業(yè)病防治院，天津市工人醫(yī)院普通外科（郵編300011）；2天津海濱人民醫(yī)院（大港油田總醫(yī)院）肛腸外科；3首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院肝臟移植中心；4天津市人民醫(yī)院肛腸外科

△通訊作者 E-mail:zhangchunzetj@163.com