劉 紅 祝 軍 張 真

A-NK細胞抗口腔舌鱗狀細胞癌的實驗研究

劉 紅 祝 軍△張 真

目的 觀察黏附性自然殺傷（A-NK）細胞體外生長與增殖能力，探討其治療裸鼠舌鱗狀細胞癌移植瘤的效果及其作用機制，為臨床治療鱗癌提供理論依據(jù)。方法抽取健康人外周血，分選出A-NK細胞和非黏附性自然殺傷（NA-NK）細胞體外培養(yǎng)，鏡下觀察細胞生長情況。建立裸鼠舌鱗癌皮下移植瘤模型，隨機分成3組，每組7只小鼠，分別瘤旁注射生理鹽水、A-NK細胞和NA-NK細胞，觀察腫瘤體積變化，33 d后，處死裸鼠，剝離移植瘤，稱瘤質(zhì)量，繪制腫瘤生長曲線。結(jié)果鏡下觀察，A-NK細胞在第15天達到增殖高峰，NA-NK細胞于第12天達到增殖高峰。培養(yǎng)3周后，A-NK細胞共增加39.33倍，NA-NK細胞僅增加16.33倍。生理鹽水組裸鼠口腔舌鱗癌移植瘤體積大于NA-NK細胞組和A-NK細胞組，NA-NK細胞組大于A-NK細胞組，3組裸鼠腫瘤體積在組間、時間和交互效應(yīng)上差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。第33天，生理鹽水組裸鼠瘤質(zhì)量大于NA-NK細胞組和A-NK細胞組，NA-NK細胞組大于A-NK細胞組（P＜0.05）。結(jié)論A-NK細胞和NA-NK細胞均可在裸鼠體內(nèi)誘導(dǎo)明顯的抗腫瘤效應(yīng)，且A-NK的抑瘤作用大于NA-NK細胞。

殺傷細胞,天然；舌腫瘤；癌,鱗狀細胞；A-NK細胞；NA-NK細胞；裸鼠移植瘤;抗腫瘤效應(yīng)

口腔舌鱗狀細胞癌是口腔頜面部發(fā)病率較高的惡性腫瘤，侵襲性強，局部復(fù)發(fā)與遠處轉(zhuǎn)移率高，患者預(yù)后較差，生存率低，嚴重危害人類健康。免疫治療在腫瘤綜合序列治療中作為繼手術(shù)、放療與化療之后的又一種新型治療手段，越來越受到重視。但由于口腔舌鱗癌細胞缺乏特異性的腫瘤抗原，因而免疫治療仍處于瓶頸時期[1]，亟待研究和開發(fā)新型免疫治療方法和靶點。自然殺傷（natural killer cell，NK）細胞及其在抗腫瘤免疫效應(yīng)機制中的作用是近年來研究的熱點[2-3]，黏附性自然殺傷（adherent natural killer cell，A-NK）細胞被認為是一類表型和功能獨特的NK細胞亞群，具有高水平的NK細胞毒性和增殖能力。本課題旨在探索A-NK細胞在口腔舌鱗癌治療中的作用效果，為A-NK細胞的臨床應(yīng)用提供動物實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器及試劑 人舌鱗狀細胞癌細胞系Tca8113-Tb（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院腫瘤生物實驗室）；裸鼠，SCID/BG系，SPF級，4～5周齡，體質(zhì)量10～20 g，雌性，購自上海斯萊克實驗動物有限公司；磁珠分選儀（國美天旎生物技術(shù)有限公司）；淋巴細胞分離液（sigma公司），rhIL-2（南京軍區(qū)軍事醫(yī)學(xué)研究所）；RPMI1640培養(yǎng)液（Gibco）。

1.2 實驗方法

1.2.1 NK細胞的分離純化 無菌抽取正常人群外周血，用淋巴細胞分離液分離出單個核細胞，經(jīng)貼壁黏附和尼龍毛柱黏附去除單核細胞和B細胞。將上述分離去除單核細胞和B細胞后取得的單個核細胞（PBMC）溶紅素處理，平衡鹽充分洗滌后，加入到CD56單抗包被的磁珠系統(tǒng)中孵育，平衡鹽再次洗滌，于miniMACS分離器磁場中上柱分選，平衡鹽洗柱收集細胞。免疫磁珠儀檢測所得細胞表面CD3、CD56分子，分析NK細胞回收率和純化率。

1.2.2 A-NK和非黏附性NK（NA-NK）細胞的分離 取免疫磁珠分選的高純度NK細胞，用α-MEM培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度為2×106/mL，置于無菌塑料平皿中，與6 000 U/mL IL-2水平培養(yǎng)3 h（37℃5％CO2）。用溫α-MEM培養(yǎng)基洗脫收集NA-NK 4次。加入PBS（含0.02 W/V EDTA）4℃放置10 min，冷α-MEM洗3次，收集A-NK細胞。

1.2.3 A-NK細胞和NA-NK細胞的體外擴增 分別將收集的A-NK細胞和NA-NK細胞，用α-MEM培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度為2×106/mL，加入200 U/mL IL-2，培養(yǎng)于24孔板中。每3 d更換新鮮培養(yǎng)液，補充細胞因子，保持細胞因子終濃度不變，細胞濃度在（3～4）×106/mL，并計數(shù)細胞，繪制細胞生長曲線。

1.2.4 人舌鱗癌細胞皮下成瘤裸鼠模型的建立 取指數(shù)增殖期Tca8113細胞，用0.25％胰蛋白酶消化制成單細胞懸液，調(diào)整細胞密度至1.0×107/mL，臺盼藍染色計數(shù)活細胞占95％以上。于每只裸鼠右前肢背部皮下接種2.0×106個（0.2 mL）細胞，33 d后處死，分離移植瘤，10％福爾馬林固定、脫水、石蠟包埋、制片（4 μm厚），HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.2.5 A-NK細胞免疫功能增強對口腔癌的效應(yīng) 動物接種Tca8113細胞方法同人舌鱗癌細胞皮下成瘤裸鼠模型的建立。接種后第3天，將裸鼠隨機分為3組，每組7只，分別為對照組、NA-NK細胞組和A-NK細胞組。對照組每2 d于接種腫瘤細胞的局部皮下注射0.1 mL生理鹽水，NA-NK細胞組和A-NK細胞組每2 d于接種腫瘤細胞的局部皮下分別注射相應(yīng)細胞0.1 mL（5.0×106個），共注射3次。于接種腫瘤細胞2周后每3 d用游標卡尺測量移植瘤的最小徑a、最大徑b，計算出移植瘤體積V=a2·b/2，并得出裸鼠移植瘤體積生長曲線。第33天斷頸處死小鼠，剝?nèi)∫浦擦龇Q質(zhì)量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 18.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量資料采用±s表示，2組間比較采用獨立樣本t檢驗，不同時期計量資料之間比較采用重復(fù)測量資料的方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 分離A-NK細胞和NA-NK細胞 血樣標本顯示5×107個外周血單個核細胞經(jīng)免疫磁珠分選后，可得到1.6×107個NK細胞（其中A-NK細胞為41％，NA-NK細胞為59％），流式細胞儀檢測細胞存活率達98.6％，NK細胞的純度由純化前的（29.66± 2.31）％增加至（95.37±1.93）％。

2.2 A-NK細胞的體外增殖能力 A-NK細胞在α-MEM培養(yǎng)基中生長良好，細胞透亮有光澤，貼附于器皿底部，見圖1。加入IL-2刺激因子后，A-NK細胞于0～15 d增殖速度較快，NA-NK細胞于0～12 d增殖速度較快，以后增殖速度均減慢，培養(yǎng)3周后，A-NK細胞共增加39.33倍，NA-NK細胞僅增加16.33倍，見圖2。

Fig.1 A-NK cells cultured in vitro(×20)圖1 A-NK細胞的體外培養(yǎng)（×20）

Fig.2 The growth culture of A-NK cells vesus with NA-NK cells圖2 A-NK細胞與NA-NK細胞生長曲線比較

2.3 人舌鱗癌細胞皮下成瘤裸鼠模型的建立 剛接種舌鱗癌細胞的裸鼠均可見圓形小皮丘，第2天后消退，接種腫瘤細胞2周后，腫瘤開始緩慢生長，于18 d后出現(xiàn)快速生長期。HE染色可見大量的舌鱗狀細胞癌細胞，細胞巢狀排列，呈多角型，核大、深染，部分腫瘤細胞蛻變壞死，并伴有淋巴細胞浸潤，提示建模成功，見圖3。

2.4 A-NK細胞對裸鼠移植瘤的抑制作用 局部應(yīng)用A-NK細胞和NA-NK細胞對裸鼠口腔鱗癌移植瘤均有明顯的抑制作用，且A-NK細胞組對腫瘤的抑制作用強于NA-NK細胞組,見圖4。

Fig.3 HE staining of tongue squamous cancer cells（×200）圖3 舌鱗癌細胞的HE染色（×200）

Fig.4 Growth curve of transplanted tumors in nude mice圖4 裸鼠移植瘤體積生長曲線

2.5 2組裸鼠的瘤質(zhì)量比較 第33天，3組裸鼠瘤質(zhì)量差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（F=19.333，P＜0.01），對照組大于NA-NK細胞組和A-NK細胞組（g：3.74± 1.22 vs 2.03±0.71 vs 0.96±0.38），NA-NK細胞組大于A-NK細胞組（均P＜0.05）。

3 討論

口腔舌鱗狀細胞癌占口腔鱗癌第一位，由于惡性程度高，術(shù)后預(yù)后差，近年探索其新型有效的治療方法成為研究熱點[4]。NK細胞具有較高的體外增殖能力和抗腫瘤能力[5]，能夠侵入到實體瘤內(nèi)部殺傷腫瘤細胞，為口腔舌鱗狀細胞癌治療帶來了新的希望。

3.1 A-NK細胞和NA-NK細胞的體外增殖能力 NK細胞以22 μmol/L IL-2誘導(dǎo)下是否能迅速黏附到實體表面的能力被分為A-NK細胞和NANK細胞，它們均具有高水平的NK細胞毒性和增殖能力。但其在人體血液中數(shù)量較少，需體外擴增以達到臨床級別的細胞數(shù)量[6]。體外培養(yǎng)NK細胞主要分為2個過程：貼壁和生長，細胞黏附至培養(yǎng)介質(zhì)上，進而鋪展，這是貼壁細胞生長的必要條件。須玨華等[7]對兔骨髓間充質(zhì)干細胞在DMEM高糖培養(yǎng)基（DMEM-HG）、DMEM低糖培養(yǎng)基（DMEM-LG）、α-MEM三種培養(yǎng)基中貼壁效果進行實驗研究，發(fā)現(xiàn)α-MEM有利于細胞貼附。本研究中采用α-MEM培養(yǎng)基，A-NK和NA-NK細胞貼附于培養(yǎng)基底，生長狀態(tài)良好。A-NK細胞具有強大的體外擴增能力，有研究報道在IL-2參與下96 h A-NK細胞增殖快于NA-NK細胞[8]，本研究中A-NK細胞和NA-NK細胞培養(yǎng)3周后，A-NK細胞共增加39.33倍，NA-NK細胞僅增加16.33倍，提示A-NK細胞的增殖能力強于NA-NK細胞，也證實了這一實驗研究。

3.2 SCID/BG小鼠移植瘤模型的建立 本研究選用的是SCID/BG小鼠，它是BALB/c-beige/beige同源近交系小鼠將beige基因引入C.B-17 SCID小鼠體內(nèi)，研究表明其體內(nèi)各項免疫指標均低于實驗常用的SCID（Severe Combined Immune-deficiency）小鼠和BALB/c nu-nu小鼠，可成為腫瘤免疫治療的良好活體承載系統(tǒng)[9]。本研究中SCID/BG小鼠接種腫瘤細胞2周后，腫瘤開始緩慢生長，18 d后出現(xiàn)快速生長期，HE染色可見大量的舌鱗狀細胞癌細胞，證明其可為本實驗提供較可靠的移植瘤模型。

3.3 A-NK細胞與NA-NK細胞抗腫瘤的可能機制 本研究結(jié)果提示局部應(yīng)用A-NK細胞和NANK細胞對裸鼠口腔舌鱗癌移植瘤均有明顯的抑制作用，且A-NK細胞組對腫瘤的抑制作用強于NANK細胞組。分析原因，A-NK細胞可能通過多種機制抑制腫瘤細胞：（1）通過穿孔素和顆粒酶介導(dǎo)途徑，二者的協(xié)同作用可使A-NK細胞產(chǎn)生最佳效應(yīng)的細胞毒作用。（2）直接接觸腫瘤細胞發(fā)揮殺傷作用，NK細胞表達的腫瘤壞死因子（TNF）死亡配體可與腫瘤表面的死亡受體相結(jié)合發(fā)揮殺傷效應(yīng)。（3）細胞因子介導(dǎo)途徑，A-NK細胞分泌多種細胞因子，通過破壞腫瘤微循環(huán)或改變靶細胞表面的pH值、糖代謝等方式殺死腫瘤細胞。（4）在A-NK細胞刺激下，其他的內(nèi)源性效應(yīng)細胞和細胞毒分子滲出，引起腫瘤出血壞死[10]。本實驗中發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞凋亡與壞死同時存在，推斷可能是多種機制共同作用的結(jié)果。

本研究提示A-NK細胞能有效抑制裸鼠舌鱗癌移植瘤的生長，但目前國內(nèi)外對其研究還停留在基礎(chǔ)實驗階段，其具體作用機制尚不明確，因此還需對A-NK細胞免疫功能重建進行深入研究。

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（2014-02-27收稿 2014-07-15修回）

（本文編輯 李鵬）

Study of Anti-Tumor Effect of NK Cells on Oral Tongue Squamous Cell Carcinoma

LIU Hong，ZHU Jun△，ZHANG Zhen
Department of Stomatology,Affiliated Traditional Chinese Medicine Hospital,Xinjiang Medical University, Xinjiang 830000，China
△

E-mail：ZJ29518@126.com

ObjectiveTo explore the treatment effect and mechanism of A-NK cells on the subcutaneous transplanted tumor of oral tongue squamous cell carcinoma in nude mice through observing the external growth and hyperplasia of A-NK cells and to provide theoretical evidence for squamous cell carcinoma treatment.MethodsA-NK cells and NA-NK cells were both derived from healthy human peripheral blood and cultured in vitro.Cell growth was observed under microscope.The squamous cell carcinoma model in nude mice was established through subcutaneous implanting of Tca8113 cells. Then they were randomly assigned into three groups who were injected with either saline solution,or A-NK cells or NA-NK cells paraneoplastically.All animals were sacrificed after 33 days when tumor were isolated then weight and change in tumor size were assessed.Finally curve of tumor growth was drawn.ResultsUnder the microscope,the proliferation of A-NK cells peak in 15 days and NA-NK cells peak in 12 days.After 3 weeks,the number of A-NK cells increased by 39.33 times while the number of NA-NK cells increased by 16.33 times.The Volume of tongue squamous cell carcinoma in saline solution group was larger than that in A-NK cells and NA-NK cells groups,and volume in the NA-NK cells group was larger than that in A-NK cells group.The volume of tongue neoplasms in different groups,time,and interaction effects are statistically significant(P＜0.01).The tongue neoplasms weight in the saline solution group was greater than that in the A-NK cells and NA-NK cells group,and the weight in NA-NK cells group was greater than that in A-NK cells group,and the difference are statistically significant(P＜0.05).ConclusionA-NK cells and NA-NK cells can significantly inhibit the subcutaneous transplanted tumors in nude mice and the anti tumor effect of A-NK group is stronger than NA-NK.

killer cells,natural；tongue neoplasms；carcinoma,squamous cell；A-NK cells；NA-NK cells；nude mice model；anti-tumor effect

R739.8

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.12.010

自治區(qū)科技支疆項目（201191158）

新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院口腔科（郵編830000）△

E-mail：ZJ29518@126.com