曹 軍 何 陽 劉洪強(qiáng) 王賽博 趙保成 鄭曉輝 程英升

吉西他濱聯(lián)合順鉑不同給藥途徑對人肺癌A549細(xì)胞的抑制作用

曹 軍1，2何 陽2劉洪強(qiáng)2王賽博2趙保成2鄭曉輝2程英升3△

目的 對比吉西他濱聯(lián)合順鉑動脈化療與靜脈化療對人肺腺癌生長的抑制作用，探索最佳給藥途徑。方法選取裸大鼠40只，將人源肺腺癌A549細(xì)胞系經(jīng)傳代培養(yǎng)后，移植于祼大鼠以建立肺癌模型。將荷瘤鼠均分為荷瘤對照組、假手術(shù)對照組、靜脈化療組與動脈化療組；荷瘤對照組尾靜脈注入生理鹽水；動脈化療組經(jīng)動脈注入吉西他濱150 mg/kg+順鉑10 mg/kg；靜脈化療組經(jīng)靜脈注入吉西他濱150 mg/kg+順鉑10 mg/kg；假手術(shù)對照組經(jīng)動脈注入生理鹽水。觀察干預(yù)前后4組大鼠腫瘤體積的變化，計(jì)算荷瘤鼠的抑瘤率，采用Western blot檢測Bcl-2與半胱氨酸蛋白酶（Caspase）-3蛋白在腫瘤中的表達(dá)水平。結(jié)果動脈化療組與靜脈化療組移植瘤生長均受到不同程度的抑制，動脈化療組抑制尤為明顯。動脈化療組、靜脈化療組的瘤體質(zhì)量均低于荷瘤對照組（g：1.91±0.19、2.61±0.21 vs 4.58±0.46）,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,動脈化療組、靜脈化療組的抑瘤率分別為57.6％、42.4％。經(jīng)靜脈與動脈給藥后，Bcl-2蛋白水平均下降，Caspase-3蛋白水平均上升，以動脈給藥效果更明顯。結(jié)論吉西他濱聯(lián)合順鉑經(jīng)動脈灌注更能有效控制人肺癌細(xì)胞生長，經(jīng)動脈化療途徑在肺癌治療中更具優(yōu)勢。

吉西他濱；順鉑；動脈化療；靜脈化療；肺腺癌

肺癌死亡率在我國惡性腫瘤死亡率中居第一位，其發(fā)病率仍逐年上升。肺癌分為非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）和小細(xì)胞肺癌。NSCLC占肺癌總數(shù)的85％，其中肺腺癌占NSCLC的30％～40％[1]。大多數(shù)肺癌患者臨床確診時往往已屬中晚期，喪失了手術(shù)治療時機(jī)，因此，在肺癌的治療方案選擇中化療仍是其主要方法。吉西他濱聯(lián)合順鉑治療肺癌的確切療效在一些國內(nèi)外研究中已得到驗(yàn)證[2-3]，但是關(guān)于這2種藥物的不同給藥途徑治療肺癌的效果卻鮮有報(bào)道。本研究通過比較吉西他濱聯(lián)合順鉑動脈化療與靜脈化療對人肺腺癌生長的抑制作用，比較動脈和靜脈給藥途徑的療效。

1 材料與方法

1.1 材料 人肺癌細(xì)胞株A549購自上海市腫瘤研究所。SPF級裸大鼠40只，8～10周齡，體質(zhì)量（180±15）g，雌雄各半，購自上海市公共衛(wèi)生臨床中心實(shí)驗(yàn)動物部。飼養(yǎng)條件:各組均同等自由飲水、攝食，溫度22～25℃，相對濕度40％～50％。吉西他濱(澤菲，江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司)；順鉑（德州德藥制藥有限公司）。Bcl-2、半胱氨酸蛋白酶（Caspase)-3、GAPDH抗體均購自Santa cruz，鼠抗人二抗購自碧云天。ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自BestBIO公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將人肺癌A549細(xì)胞復(fù)蘇，用含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，取生長良好的細(xì)胞用0.25％胰蛋白酶消化、離心，收集細(xì)胞用1 mL冰PBS稀釋，濃度調(diào)整為5×106/mL，以0.2 mL接種于每只小鼠右腋皮下，待腫瘤長至體積約為10 mm×10 mm×10 mm時移植于裸大鼠耳后造模。

1.2.2 造模及分組 選擇生長良好、瘤結(jié)無破潰的荷瘤裸鼠，處死后無菌條件下完整剝離瘤結(jié)，剪開瘤結(jié)，清除中心壞死組織，在用生理鹽水中，用剪刀切成2 mm×2 mm×2 mm瘤組織塊，將此組織塊接種于裸大鼠右耳后皮下。正常飼養(yǎng)8 d后接種腫瘤成功，待3周后腫瘤長至2 650～2 800 mm3時，見圖1，在保證各組腫瘤平均體積無明顯差異的條件下，對荷瘤實(shí)驗(yàn)裸大鼠根據(jù)性別分層后分組：荷瘤對照組、假手術(shù)對照組、靜脈化療組和動脈化療組，每組10只。

1.2.3 給藥方法 （1）荷瘤對照組，尾靜脈注入生理鹽水0.5 mL。（2）動脈化療組，荷瘤大鼠經(jīng)10％水合氯醛（3.5 g/kg）腹腔注射麻醉后，沿頸部正中切開皮膚，暴露右頸動脈，見圖2；于右頸動脈采用改良Seldinger技術(shù)插管，見圖3；先造影證實(shí)腫瘤供血動脈，見圖4；再經(jīng)導(dǎo)管灌注吉西他濱150 mg/kg，順鉑10 mg/kg，緩慢推注，縫合皮膚。（3）靜脈化療組，吉西他濱150 mg/kg聯(lián)合順鉑10 mg/kg由尾靜脈注入，見圖5。（4）假手術(shù)對照組，操作同動脈化療組，經(jīng)導(dǎo)管注入等劑量生理鹽水。

1.2.4 指標(biāo)測量方法 藥物處理前后每天用毫米游標(biāo)卡尺測量腫瘤長徑及短徑。計(jì)算腫瘤體積（mm3）=腫瘤長徑×腫瘤短徑2/2。于用藥后第16天，頸椎脫臼法處死各組荷瘤裸大鼠，完整分離、取出皮下腫瘤組織，見圖6，稱質(zhì)量，計(jì)算各組抑瘤率=（l-藥物組瘤質(zhì)量/荷瘤對照組瘤質(zhì)量）×100％。

1.2.5 Western blot檢測Bcl-2和Caspase-3表達(dá)水平 12％ SDS-PAGE分離膠電泳120 V，15 min；4％SDS-PAGE濃縮膠電泳80 V，1 h。PVDF膜半干轉(zhuǎn)100 V，30 min。5％脫脂奶粉封閉過夜。一抗?jié)舛?∶1 000孵育2 h或過夜，二抗?jié)舛?∶5 000孵育1 h。按化學(xué)發(fā)光操作試劑盒說明,檢測Bcl-2和Caspase-3表達(dá)情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用F檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 裸大鼠一般情況 40只裸大鼠完成實(shí)驗(yàn)時均存活，覓食、飲水、活動等一般狀態(tài)良好，未發(fā)現(xiàn)脫毛、腹瀉、明顯消瘦等現(xiàn)象，動脈化療組及假手術(shù)對照組手術(shù)切口均愈合良好，無一例感染。

2.2 各組荷瘤鼠腫瘤體積變化 治療前各組移植瘤體積無明顯差異（P＞0.05）。治療后，靜脈化療組與動脈化療組移植瘤體積均小于荷瘤對照組和假手術(shù)對照組，動脈化療組瘤體積小于靜脈化療組（均P＜0.05），見表1。

Tab.1 Comparison of tumor volume before and after chemotherapy表1 治療前后各組腫瘤體積比較 （n=10,mm3,±s）

Tab.1 Comparison of tumor volume before and after chemotherapy表1 治療前后各組腫瘤體積比較 （n=10,mm3,±s）

＊P＜0.05;a與荷瘤對照組比,b與假手術(shù)對照組比,c與靜脈化療組比，P＜0.05

組別荷瘤對照組假手術(shù)對照組靜脈化療組動脈化療組F治療前2 786.23±120.31 2 699.46±124.18 2 663.82±125.53 2 701.08±123.26 6.67治療4 d 3 569.84±152.81 3 452.45±153.82 2 120.32±142.26ab1 722.21±133.02abc8.24＊組別荷瘤對照組假手術(shù)對照組靜脈化療組動脈化療組F治療8 d 4 062.11±279.26 4 075.68±168.56 1 556.76±130.27ab1 127.62±156.03abc15.66＊治療12 d 4 998.34±319.02 5 010.45±324.85 1 146.98±203.38ab603.75±111.42abc22.75＊治療16 d 5 709.59±475.07 5 642.57±486.03 801.46±206.8ab325.41±81.26abc45.69＊

2.3 各組荷瘤鼠腫瘤抑制率比較 4組腫瘤的體質(zhì)量（g）為動脈化療組（1.91±0.19）、靜脈化療組（2.61± 0.21）低于荷瘤對照組（4.58±0.46）及假手術(shù)對照組（4.71±0.53），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，抑瘤率分別為57.6％、42.4％。

2.4 Bcl-2和Caspase-3蛋白在不同組腫瘤中的表達(dá)水平 Bcl-2蛋白水平在靜脈與動脈給藥后均有下降，其中動脈給藥效果更為明顯，Caspase-3蛋白水平在靜脈與動脈給藥后均有明顯上升，其中動脈給藥效果更為明顯，見圖7。

3 討論

吉西他濱是目前治療NSCLC最有效的抗嘧啶代謝的化療藥物，其作用機(jī)制是在機(jī)體細(xì)胞內(nèi)的核苷激酶作用下生成有活性的二磷酸核苷(dFdCDP)和三磷酸核苷(dFdCTP)，然后利用這2種代謝產(chǎn)物抑制DNA合成而發(fā)揮抗腫瘤作用[4]，主要作用于DNA合成期(S期)，并可阻止細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期[5]。順鉑屬于細(xì)胞周期非特異性抗腫瘤藥，是應(yīng)用最廣泛的抗癌藥物之一，作用機(jī)制為可將細(xì)胞阻滯于S 期[6]，因其與其他抗癌藥物無交叉耐藥性，故常與其他藥物聯(lián)用共同治療腫瘤。多項(xiàng)研究均證實(shí)吉西他濱與順鉑聯(lián)用治療NSCLC效果顯著，能提高生存期、緩解全身癥狀及改善生活質(zhì)量，療效明顯優(yōu)于以往的常規(guī)化療方案[7-10]。

在臨床應(yīng)用中，吉西他濱動脈灌注給藥已經(jīng)廣泛用于肝轉(zhuǎn)移瘤、胰腺癌和膽管腫瘤的介入治療，但尚少見于肺癌的介入治療中，且研究吉西他濱動脈用藥與靜脈用藥的對比研究更少。A549細(xì)胞株的裸大鼠腫瘤模型是難得較大的肺癌腫瘤模型，且可重復(fù)性好，成瘤率高，便于動脈插管。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)動脈化療組中凋亡蛋白Caspase-3的表達(dá)明顯高于靜脈化療組，而抗凋亡蛋白Bcl-2則低于靜脈化療組，提示動脈灌注組腫瘤細(xì)胞增殖被抑制較經(jīng)靜脈組更明顯。表明在裸大鼠肺癌化療藥物治療中，經(jīng)動脈灌注途徑具有明顯優(yōu)勢，更能有效控制腫瘤生長。動脈化療技術(shù)存在以下優(yōu)勢：（1）增加腫瘤局部藥物濃度，通過導(dǎo)管技術(shù)選擇性動脈導(dǎo)管化療，可增加腫瘤內(nèi)部及周邊化療藥物濃度，可直接殺滅腫瘤或抑制腫瘤生長。同時，介入化療可減少藥物與血漿蛋白的結(jié)合而增加游離藥物的濃度，進(jìn)一步提高化療藥物對腫瘤組織的細(xì)胞毒性作用[11]。（2）減少全身不良反應(yīng)，動脈化療灌注藥物可改善藥物聚集，藥物先經(jīng)過靶區(qū)再回流到靜脈系統(tǒng)，再到體循環(huán)，可明顯減少藥物對全身系統(tǒng)的不良反應(yīng)[12-13]。

Fig.1 The construction of rat model via human A549 cell line xenograft圖1 荷瘤實(shí)驗(yàn)裸大鼠

Fig.2 Exposure of rat carotid artery圖2 暴露荷瘤實(shí)驗(yàn)裸大鼠右頸動脈圖

Fig.3 Arterial intubation using improved Seldinger cannulation圖3 采用改良Seldinger技術(shù)插管

Fig.4 Confirmation of tumor supplying arteries using radiography圖4 造影證實(shí)腫瘤供血動脈

Fig.5 Intravenous chemotherapy from caudal vein圖5 尾靜脈注入

Fig.6 Tumor tissues圖6 腫瘤組織

Fig.7 Expression of Bcl-2 and Caspase-3 in control, intravenous and arterial chemotherapy groups圖7 3組腫瘤組織中Bcl-2和Caspase-3蛋白表達(dá)水平

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(2014-07-15收稿 2014-08-09修回)

（本文編輯 閆娟）

Inhibiting Effect of Different Administration Route of Gemcitabine Combined with Cisplatin on A549 Cell Lines

CAO Jun1,2,HE Yang2,LIU Hongqiang2,WANG Saibo2,ZHAO Baocheng2,ZHENG Xiaohui2,CHENG Yingsheng3△
1 Medical College of Soochow University,Suzhou 215123,China;2Dahua Hospital,Xuhui District,Shanghai; 3 Shanghai Jiao Tong University Affiliated Sixth People’s Hospital
△

E-mail:chengyingsheng@hotmail.com

ObjectiveTo compare the inhibiting effect on human lung adenocarcinoma who were treated with gemcitabine combined with cisplatin chemotherapy through either arterial or intravenous route to explore the optimum administration route.MethodsHuman lung adenocarcinoma derived A549 cells were transplanted into 40 BALB/c-nu mice to establish lung cancer model.The models were divided into 4 groups:animals in arterial or intravenous chemotherapy groups were treated with gemcitabine 150 mg/kg combined with cisplatin 10 mg/kg through either arterial route or intravenous route.Animals in negative control group were given normal saline through caudal vein while animals in sham operation group were treated with normal saline via arterial route.Then dynamical change of tumor volume and tumor inhibiting rate were assessed,and Bcl-2 and Caspase 3 expressions were investigated using western blot.Finally inhibiting effect were compared between these two different administration routes.ResultsTransplanted tumors in arterial and intravenous chemotherapy groups(especially in arterial group)were suppressed,in terms of mass of tumor（g:1.91±0.19,2.61±0.21 vs 4.58± 0.46）,compared to the control group(P＜0.05).Furthermore,tumor inhibiting rates in arterial chemotherapy group and venous chemotherapy group are 57.6％and 42.4％respectively(P＜0.05).Expression of Bcl-2 was down regulated while expression of Caspase-3 was up regulated upon both arterial and intravenous chemotherapy.And arterial route showed much more obvious tumor apoptosis effect than venous route.ConclusionArterial route of gemcitabine combined with cisplatin for lung adenocarcinoma treatment is more effective to restrain the tumor growth in clinical application.

gemcitabine；cisplatin；arterial chemotherapy；intravenous chemotherapy;lung neoplasm

R734.2

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.12.008

上海市自然科學(xué)基金（12ZR1428900）;上海市衛(wèi)生局青年科研項(xiàng)目（20124Y096）

1蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部（郵編215123）；2上海市徐匯區(qū)大華醫(yī)院；3上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院

△通訊作者 E-mail：chengyingsheng@hotmail.com