宋 恩 李光第 婁振凱 王 揚(yáng) 趙學(xué)凌

β2-GP1、VEGF、TF與大鼠DVT形成的關(guān)系

宋 恩 李光第 婁振凱 王 揚(yáng) 趙學(xué)凌△

目的 建立大鼠下腔靜脈狹窄法深靜脈血栓（DVT）模型，檢測(cè)大鼠血液中β-2糖蛋白1（β2-GP1）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、組織因子（TF）表達(dá)變化，研究其與DVT形成的關(guān)系。方法70只SD大鼠，隨機(jī)分為對(duì)照組（10只），假手術(shù)組（30只），模型組（30只），模型組于造模后2 h、8 h、24 h分為3個(gè)亞組，采集各組大鼠下腔靜脈血5 mL，ELISA法檢測(cè)β2-GP1、VEGF、TF水平。結(jié)果大鼠血液中β2-GP1、VEGF、TF表達(dá)在對(duì)照組與假手術(shù)組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），造模后2～24 h，β2-GP1、VEGF、TF在血液中的表達(dá)呈上升趨勢(shì)，24 h時(shí)達(dá)峰值，高于對(duì)照組、假手術(shù)組、造模后2 h組和造模后8 h組（P＜0.01），其余4組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論大鼠DVT形成過程中，β2-GP1、VEGF、TF可能起到促進(jìn)血栓形成的作用。

β2糖蛋白Ⅰ；血管內(nèi)皮生長因子類；凝血致活酶；靜脈血栓形成；大鼠，Sprague-Dawley

深靜脈血栓(deep vein thrombosis，DVT)是指血液在深靜脈血管腔內(nèi)異常凝結(jié)，導(dǎo)致血管管腔阻塞，靜脈血回流受阻，繼發(fā)一系列相應(yīng)的臨床癥狀[1]。下肢深靜脈血栓形后，栓子可脫落，并隨血流堵塞肺動(dòng)脈，造成致命性肺栓塞(pulmonary embolism，PE)[2]。目前DVT研究主要集中在分子機(jī)制的探索，本實(shí)驗(yàn)建立DVT大鼠模型，檢測(cè)并分析β-2糖蛋白1（β2-GP1）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、組織因子（TF）在大鼠血液中的表達(dá)變化，初步探討其與DVT形成的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料 大鼠β2-GP1、VEGF、TF的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒購自Ebioscience公司；微量取樣器購自Eppendorf公司，冷凍離心機(jī)購于Thermo公司，酶標(biāo)儀購于Bio-Tek公司；各種規(guī)格的離心管、槍尖、PCR管購于Axygen公司。二甲苯、無水乙醇、冰乙酸、95％乙醇、蘇木素、伊紅購于天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司。

1.2 大鼠DVT模型建立及分組 70只SPF級(jí)SD大鼠，購自昆明醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCKK（滇）2005-0008，雌性，體質(zhì)量（180±40）g。光線、通風(fēng)良好，自由飲水、進(jìn)食。所有動(dòng)物相關(guān)實(shí)驗(yàn)都經(jīng)昆明醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分為對(duì)照組10只，假手術(shù)組30只，模型組30只，模型組隨機(jī)分為造模后2 h、造模后8 h、造模后24 h組，每組10只。對(duì)照組：SD大鼠不做任何處理，正常喂養(yǎng)。假手術(shù)組：大鼠腹腔內(nèi)注射5％水合氯醛6 mL/kg麻醉，0.5％碘伏消毒、鋪巾，在劍突下1 cm處，沿腹中線取1.5 cm切口，逐層切開大鼠皮膚、皮下肌層、腹膜，將腹腔內(nèi)容物剝離出腹腔外，暴露及分離下腔靜脈，還納腹腔內(nèi)容物，逐層關(guān)腹，保溫，正常喂養(yǎng)。模型組：大鼠麻醉、消毒、鋪巾，切開腹腔、暴露同假手術(shù)組，此時(shí)可見暴露的下腔靜脈，于左腎靜脈與下腔靜脈交匯處下方，分離下腔靜脈后，用5-0愛惜康縫合線沿下腔靜脈走形放置，再用4-0愛惜康縫合線結(jié)扎此處下腔靜脈，再抽去5-0愛惜康縫合線，分離出交匯于下腔靜脈在髂靜脈上方的2條側(cè)支分支靜脈并用5-0愛惜康縫合線結(jié)扎，見圖1。還納腹腔內(nèi)容物逐層關(guān)腹縫合，保溫，正常喂養(yǎng)。

Fig.1 Rat inferior vena cava partial stasis(narrow)DVT model圖1 大鼠下腔靜脈狹窄法DVT模型

1.3 實(shí)驗(yàn)大鼠樣本取材、處理 假手術(shù)組及模型組的造模后2 h、造模后8 h、造模后24 h組按不同時(shí)點(diǎn)（造模后2 h、8 h、24 h）打開腹腔后觀察造模段下腔靜脈腫脹度、顏色、局部組織反應(yīng)程度。從大鼠下腔靜脈結(jié)扎處上方（腎靜脈以上）獲取靜脈血液樣本5 mL，離心機(jī)3 000 r/min離心15 min，分離有核細(xì)胞與血漿，分裝后，分別置于-80℃深低溫冷凍冰箱備用。同時(shí)，取距結(jié)扎線1.0 cm的下腔靜脈及血栓栓體，置于4％多聚甲醛固定后送石蠟切片，HE染色觀察血栓形成狀態(tài)。

1.4 ELISA檢測(cè)大鼠血中β2-GP1、VEGF、TF表達(dá) ELISA檢測(cè)步驟嚴(yán)格按Ebioscience試劑盒說明書標(biāo)準(zhǔn)操作進(jìn)行，按照ELISA說明書稀釋標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度，順序添加反應(yīng)物，在反應(yīng)終止后5 min內(nèi)用酶標(biāo)儀在450 nm波長測(cè)量各孔的光密度（OD）值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線來換算出待測(cè)樣品的濃度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件，對(duì)所有測(cè)量的數(shù)值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，各組間比較用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，多重比較采用Tukey HSD檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物一般情況、肉眼觀察及病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果 假手術(shù)組大鼠因麻醉原因死亡1只，造模后8 h、 24 h組大鼠各死亡1只，原因?yàn)樾g(shù)后傷口滲血過多，其余實(shí)驗(yàn)大鼠正常。對(duì)照組：肉眼觀察，下腔靜脈通暢，透過管壁可見管腔內(nèi)暗紅色流動(dòng)血液，腹腔內(nèi)未見有靜脈血管擴(kuò)張。取材血管管徑粗細(xì)均勻，管壁薄而柔軟，富有彈性，內(nèi)膜面呈乳白色，平整、光滑。鏡下觀察：整個(gè)血管內(nèi)膜表面平整，內(nèi)皮細(xì)胞大小均勻、排列整齊，管腔中無血栓形成。假手術(shù)組：下腔靜脈結(jié)扎后，在結(jié)扎處下方的下腔靜脈立即膨脹，解除結(jié)扎線后，膨脹消失，下腔靜脈直徑未見明顯變化，血管管徑粗細(xì)均勻，下腔靜脈通暢，可見血管內(nèi)有暗紅色血液流動(dòng)，血管富有彈性。鏡下觀察：整個(gè)血管內(nèi)膜表面平整，內(nèi)皮細(xì)胞大小均勻、排列整齊,管腔中無血栓形成，見圖2。模型組：下腔靜脈結(jié)扎后，在結(jié)扎處下方的下腔靜脈立即膨脹，血管顏色變暗，血管彈性可；造模后2 h見結(jié)扎處下方的下腔靜脈血管內(nèi)有黑色凝塊樣物質(zhì)形成，壓迫血管，凝塊樣物質(zhì)可移動(dòng)，鏡下觀察見不完全血栓形成，同時(shí)可見少量炎性細(xì)胞侵潤，血栓大部分為纖維素和中性粒細(xì)胞；造模后8 h，下腔靜脈顏色變黑，彈性下降，血管內(nèi)出現(xiàn)白色和黑色混合樣凝塊樣物質(zhì)，鏡下觀察見完全血栓形成，血栓充滿整個(gè)管腔，靜脈壁內(nèi)皮細(xì)胞剝脫，下層裸露，炎性細(xì)胞浸潤加重，血栓與內(nèi)皮細(xì)胞無粘連；造模后24 h，下腔靜脈直徑繼續(xù)增大達(dá)到峰值，鏡下觀察見血栓充滿整個(gè)管腔，同時(shí)與大部分靜脈壁粘連緊密，出現(xiàn)機(jī)化現(xiàn)象，炎性細(xì)胞浸潤進(jìn)一步加重，見圖3。

Fig.2 Venous tissue(HE,×40)in normal control group(left)and sham operation group(right)圖2 對(duì)照組（左）、假手術(shù)組（右）靜脈壁組織(HE，×40)

2.2 大鼠血漿中β2-GP1、VEGF、TF表達(dá) 造模后2～24 h,血液中的β2-GP1、VEGF、TF表達(dá)逐漸增加。造模后24 h達(dá)峰值，較對(duì)照組、假手術(shù)組及造模后2 h、8 h組均增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，β2-GP1、VEGF、TF在其余4組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。

Fig.3 Venous tissue of rat IVC narrow DVT model at the 2ndhour,the 8thhour and the 24thhour after operation(HE,×40)and venous thrombus圖3 大鼠下腔靜脈狹窄法術(shù)后2 h、8 h、24 h靜脈壁組織切片染色（HE，×40）及靜脈血栓形成

Tab.1 Comparison of protein expression levels of TF,VEGF and β2-GP1 between five groups表1 3組TF、VEGF和β2-GP1表達(dá)水平比較 （±s）

Tab.1 Comparison of protein expression levels of TF,VEGF and β2-GP1 between five groups表1 3組TF、VEGF和β2-GP1表達(dá)水平比較 （±s）

＊＊P＜0.01;a與造模后24 h組比較，P＜0.01

組別正常對(duì)照組假手術(shù)組造模后2 h組造模后8 h組造模后24 h組F n 10 29 10 99 TF（ng/L）150.965±25.511a168.237±30.170a181.162±32.844a203.051±44.481a326.781±84.550 27.015＊＊VEGF（ng/L）190.810±76.009a206.523±78.865a225.726±67.380a258.827±53.851a370.979±147.822 7.178＊＊β2-GP1（μg/L）2 934.840±395.284a3 150.027±509.658a3 180.955±552.821a3 356.866±460.596a4 456.005±417.372 15.093＊＊

3 討論

DVT是靜脈回流障礙性疾病，其臨床主要表現(xiàn)為肢體腫脹、疼痛、皮溫改變和功能障礙，主要好發(fā)于下肢，常見于骨科大手術(shù)后。DVT形成后的血栓脫落是引起肺血栓栓塞癥（pulmonary thromboembolism，PTE）栓子的主要來源，PTE是DVT的嚴(yán)重并發(fā)癥同時(shí)也是PE的主要類型。PE在西方已經(jīng)成為繼缺血性心臟性疾病和腦卒中后的又一大常見致死因素，其病死率高達(dá)15％～20％，因此對(duì)DVT的診斷和治療應(yīng)給予高度的重視。早期預(yù)防和積極治療可以將病死率降低到5.8％[3]。DVT的形成機(jī)制較為復(fù)雜，Virchow于1856年提出的內(nèi)皮細(xì)胞損傷、血流動(dòng)力學(xué)改變、血液高凝狀態(tài)是導(dǎo)致血栓形成的三大因素理論[4]，這一理論長期以來得到普遍公認(rèn)，但是隨著醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展和研究不斷的深入，尤其是分子生物學(xué)、基因工程技術(shù)飛速發(fā)展，在對(duì)Vrichow的理論完善的同時(shí)也對(duì)其提出了質(zhì)疑，如大部分的DVT患者血管壁無明確損傷[5]。目前DVT被公認(rèn)為是一個(gè)多系統(tǒng)、多因素，形成過程復(fù)雜的疾病，參與其中的包括血管內(nèi)皮細(xì)胞、血小板、凝血與抗凝血系統(tǒng)、纖溶與抗纖系統(tǒng)、炎癥反應(yīng)、血液流變學(xué)及血液動(dòng)力學(xué)等共同作用的結(jié)果，其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)極為復(fù)雜多變，是一個(gè)動(dòng)態(tài)變化的過程。因此，著手于分子、基因和蛋白水平來研究DVT的發(fā)生、發(fā)展及消退過程，對(duì)深入研究DVT的形成就顯得極為重要[6]。

β2-GP1在血漿中以環(huán)狀和鏈狀兩種構(gòu)象存在，在生理情況下循環(huán)血液中的β2-GP1是以環(huán)狀結(jié)構(gòu)存在的，當(dāng)環(huán)狀的β2-GP1被負(fù)性磷脂捕獲后，環(huán)狀結(jié)構(gòu)展開形成鏈狀結(jié)構(gòu)的β2-GP1，暴露I區(qū)抗原表位。1個(gè)抗β2-GP1抗體可以同時(shí)與2個(gè)β2-GP1結(jié)合，形成二聚化的β2-GP1，從而引發(fā)了β2-GP1抗體/β2-GP1與細(xì)胞的結(jié)合進(jìn)而影響細(xì)胞的生物功能[7]。關(guān)于β2-GP1，目前研究主要集中在自身免疫系統(tǒng)疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）、抗磷脂抗體綜合征。近年來研究發(fā)現(xiàn)β2-GP1抗體陽性患者即使無免疫系統(tǒng)疾病，也可發(fā)生動(dòng)靜脈血栓，特別地代謝綜合征患者，進(jìn)一步研究表明，在SLE患者中β2-GP1抗體加速血小板凝集，并作用于內(nèi)皮細(xì)胞，與磷脂質(zhì)等結(jié)合導(dǎo)致不同抗體的形成，發(fā)生抗磷脂抗體綜合征，從而導(dǎo)致血栓等發(fā)生[8]。VEGF是由2 個(gè)17～22 ku亞基構(gòu)成的糖蛋白，在缺血、缺氧等應(yīng)激狀態(tài)下，均可引起VEGF水平的增高。VEGF具有促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞Ca2+聚集的作用、增加血管的通透性、促進(jìn)血管生成及動(dòng)員內(nèi)皮祖細(xì)胞等生物學(xué)功能。VEGF是一種對(duì)血管生長有強(qiáng)力誘導(dǎo)并特異性作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長因子，是促進(jìn)血管生長的關(guān)鍵因子[9]。Olszewska-Pazdrak等[10]發(fā)現(xiàn)在人體中，慢性缺氧可導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損傷，引起VEGF表達(dá)下降，通過絲裂原活化蛋白激酶（MAKP）途徑，可引起內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）及一氧化氮（NO）的分泌減少，減少新生血管的生成。Durán等[11]發(fā)現(xiàn)，VEGF可以通過蛋白激酶B（PKB/AKT）等途徑，誘導(dǎo)eNOS的產(chǎn)生，調(diào)控NO生成，影響血管內(nèi)皮細(xì)胞的通透性及穩(wěn)定性，減少血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。Lu 等[12]發(fā)現(xiàn)接頭蛋白（Gab1）因子通過蛋白激酶A （PKA）與eNOS途徑，來調(diào)節(jié)血管再生，從而能調(diào)節(jié)產(chǎn)后缺血和VEGF的表達(dá)。在外源性凝血途徑中，TF作為該凝血途徑的啟動(dòng)子發(fā)揮不可或缺的作用。通常TF主要以兩種形式存在：一種是作為跨膜蛋白，當(dāng)血管壁受損，內(nèi)皮下組織暴露到循環(huán)血液中時(shí)TF被激活；另一種以可溶解的裂解形式存在。當(dāng)血管壁受損發(fā)生炎性反應(yīng)時(shí)，機(jī)體就會(huì)產(chǎn)生大量炎性細(xì)胞和炎性因子[13]。所以血栓性疾病的發(fā)生發(fā)展與TF的異常表達(dá)有著密切的關(guān)聯(lián)。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)抗血小板聚集藥物阿卡地新（Acadesine）可通過激活PI3K-AKT信號(hào)通路來抑制TF在內(nèi)皮細(xì)胞及單核巨噬細(xì)胞中的表達(dá)[14]。

本研究在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，建立大鼠下腔靜脈狹窄法DVT模型，檢測(cè)大鼠造模后不同時(shí)點(diǎn)（2 h、8 h、24 h）β2-GP1、VEGF、TF的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)對(duì)照組與假手術(shù)組血液中β2-GP1、VEGF、TF無明顯差異，造模后2～24 h,β2-GP1、VEGF、TF在血液中的表達(dá)逐漸上升，24 h時(shí)達(dá)峰值。提示在DVT形成過程中，β2-GP1、VEGF、TF可能起到促進(jìn)血栓形成的作用。

DVT是一個(gè)多因素多系統(tǒng)的復(fù)雜疾病，目前研究熱點(diǎn)集中在內(nèi)皮細(xì)胞損傷、內(nèi)皮細(xì)胞損傷介導(dǎo)的血小板活化、炎癥因子激活等一系列關(guān)鍵、緊密聯(lián)系的環(huán)節(jié)上，本研究發(fā)現(xiàn)的，β2-GP1、VEGF、TF在DVT形成過程中，可能起到關(guān)鍵作用。為進(jìn)一步在細(xì)胞層面研究、闡明其機(jī)制打下重要基礎(chǔ)。

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（2014-08-22收稿 2014-08-30修回）

（本文編輯 魏杰）

The Correlation between β2-GP1，VEGF and TF with Rat DVT Formation

SONG En,LI Guangdi,LOU Zhenkai,WANG Yang,ZHAO Xueling△
Orthopedics Department of the 1stAffiliated Hospital of Kunming Medical University,Kunming 650032,China
△

E-mail：zxidoctor@hotmail.com

ObjectiveTo build rat DVT inferior vena cava partial stasis(narrow)model,to detected the expression of β2-GP1,VEGF and TF in rat blood,and to investigat the correlation between β2-GP1,VEGF and TF with DVT.Methods SD rats(n=70)are divided into control group(n=10),sham operation group(n=30)and the model group(n=30)randomly and DVT model was built by the inferior vena cava partial stasis(narrow)after 2 h,8 h and 24 h respectively.In each time point,ten rats were taken in each group,inferior vena cava blood were collected while β2-GP1,VEGF and TF expression were detected by ELISA.ResultsIn rat experiment,compared with control group,there was no significant change inexpression of β2-GP1,VEGF and TF in sham operation group(P＞0.05).Levels of β2-GP1,VEGF and TF were increased at the 2ndhour and 8thhour then peak at the 24thhour which was higher than those in the 24thhour control group and in Sham group and it was also higher than those in the 2ndhour and the 8thhour in model group with statistical significant difference(P＜0.01).ConclusionBased on the above experimental data,in rat DVT formation process,β2-GP1, VEGF and TF may play an important role in promote DVT formation.

beta2-glycoproteinⅠ;vascular endothelial growth factors;thromboplastin;venous thrombosis;rats, Sprague-Dawley

R654.4

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.12.007

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81060151）；云南省衛(wèi)生科技計(jì)劃項(xiàng)目（2012ws0007）；云南省科技廳重點(diǎn)新產(chǎn)品開發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2010BC010）

昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科（郵編650032）

△通訊作者 E-mail:zxidoctor@hotmail.com