祁霽舟徐寶山 彭 江許文靜楊 強

PKH26標記和分子熒光活體成像技術在軟骨組織工程研究中的應用

祁霽舟1徐寶山2△彭 江3許文靜3楊 強2

目的 探討PKH26熒光標記和分子熒光活體成像技術在軟骨組織工程中的應用。方法用PKH26熒光標記犬軟骨細胞，種植到多孔支架上，體外培養(yǎng)1周后異位移植到裸鼠背部，4周后用分子熒光活體成像系統(tǒng)示蹤，并與X線檢查結(jié)果對比。然后處死裸鼠取材，與免疫組織化學染色和免疫熒光觀察結(jié)果對比。結(jié)果4周分子熒光活體成像系統(tǒng)觀察裸鼠背部標本處呈圓形強熒光，表明組織工程軟骨在裸鼠體內(nèi)生長良好。組織學切片結(jié)果顯示番紅O染色、Ⅱ型膠原免疫組化染色和甲苯胺藍染色陽性，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果顯示組織工程化軟骨中細胞均呈紅色熒光，Ⅱ型膠原免疫熒光染色呈綠色熒光，疊加后呈黃色熒光。結(jié)論PKH26熒光標記和分子熒光活體成像2種方法結(jié)合應用于軟骨組織工程中，能夠較理想地且大體無創(chuàng)傷性評估組織工程化軟骨組織在體內(nèi)的生長情況。

軟骨細胞；組織工程；熒光；PKH26

臨床上關節(jié)軟骨損傷類疾病很常見，關節(jié)軟骨是不可再生組織，損傷后幾乎不能自主修復[1]。目前軟骨缺損修復的方法尚不成熟，均有其局限性[2]，而組織工程方法的出現(xiàn)為關節(jié)軟骨的修復提供了新的可行的思路和途徑[3-4]。本實驗以PKH26熒光染料標記的犬軟骨細胞為種子細胞，種植到軟骨脫細胞基質(zhì)（CACM）多孔支架上，體外培養(yǎng)一段時間后，異位構(gòu)建于裸鼠背部，并利用分子熒光活體成像系統(tǒng)（Molecular light imaging system）無創(chuàng)傷性評估組織工程化軟骨組織在裸鼠體內(nèi)的生長情況。

1 材料與方法

1.1 主要材料、試劑及儀器 高糖型DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（GIBCO公司，美國），L-脯氨酸、維生素C、Ⅱ型膠原酶、胰蛋白酶、PKH26、HEPES緩沖液（Sigma公司，美國），非必需氨基酸（Hyclone公司，美國），鼠抗人Ⅱ型膠原抗體、FITC標記的兔抗鼠二抗（武漢博士德生物工程有限公司）。CACM多孔支架（天津醫(yī)院骨科研究所細胞工程室制備），Kodak In-Vivo Imaging System FX（美國Kodak公司），熒光顯微鏡（日本Olympus公司），流式細胞儀（COULTER公司），激光共聚焦顯微鏡（蔡司公司）。成年雄性家犬1只，體質(zhì)量20 kg。成年雌性裸鼠5只，體質(zhì)量30～40 g，由天津醫(yī)院實驗動物中心提供。

1.2 犬軟骨細胞的獲取分離及培養(yǎng) 實驗動物行肌內(nèi)注射麻醉速新眠Ⅱ號（0.1 mL/kg），動物手術室無菌條件下取膝關節(jié)負重區(qū)軟骨，剪碎成約1 mm3，用0.2％（W/V）Ⅱ型膠原酶，37℃恒溫消化1 h，過濾，用D-Hank’s液清洗3遍，加入含20％胎牛血清的軟骨細胞培養(yǎng)液（含維生素C 50 mg/L，左旋羥脯氨酸40 mg/L，1％非必需氨基酸），轉(zhuǎn)移至帶尼龍紗巾的10 mL普通培養(yǎng)瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞貼壁后每3～4 d換液。使用P3代以前的細胞。

1.3 PKH26染料標記細胞 消化培養(yǎng)的軟骨細胞，用無血清培養(yǎng)基清洗，離心10 min，去上清，重復1次。加入1 mL緩沖液diluent C，吹勻，加入到配好的1 mL PKH26染液（4× 106mol/L）中并混勻，室溫反應4 min，加入2 mL胎牛的血清終止反應，再加入4 mL高糖型DMEM培養(yǎng)基。400×g離心10 min，去上清，重復清洗3遍。配成需要的細胞濃度[（1～2）×107/mL]。熒光顯微鏡檢測標記細胞熒光強度，流式細胞儀檢測標記細胞百分率，臺盼藍染色及細胞計數(shù)法檢測細胞活力。MTT法測定標記細胞和非標記細胞的生長曲線，設置PKH26標記組和對照組，取密度1×104個/mL標記和非標記的細胞懸液接種至96孔板，培養(yǎng)1～6 d。每組取5孔，MTT溶液處理后于酶聯(lián)免疫檢測儀中570 nm波長處測定光密度（OD）值。根據(jù)OD值和時間點制作生長曲線。

1.4 軟骨細胞/多孔支架復合體制備 CACM多孔支架經(jīng)凍干而成（直徑6 mm，高2 mm），經(jīng)25 kGy60Co照射滅菌，提前浸泡培養(yǎng)基12 h，然后置入24孔板中，用1 mL注射器將軟骨細胞懸液注射到支架內(nèi)部，每個支架50 μL，2 h后細胞基本貼附，期間每隔30 min滴加10 μL條件培養(yǎng)液，并翻轉(zhuǎn)支架。加入軟骨培養(yǎng)液后體外培養(yǎng)1周。

1.5 裸鼠體內(nèi)植入實驗 無菌條件下將體外培養(yǎng)1周的軟骨細胞/多孔支架復合體移植到裸鼠背部皮袋，縫合。

1.6 分子熒光活體成像系統(tǒng)評估組織工程化軟骨體內(nèi)生長情況 4周后將裸鼠麻醉，置于仰臥位，用Kodak In-Vivo Imaging System FX觀察體內(nèi)熒光情況（激發(fā)光450～570 nm/發(fā)射光570～700 nm），設置參數(shù)如下：曝光時間2 min，光圈4，分辨率650 dpi。

1.7 組織工程化軟骨的獲取和評估

1.7.1 組織學觀察和免疫組化 于4周后處死裸鼠，取材，肉眼觀察組織工程化軟骨的大體顏色和形態(tài)。將組織用95％乙醇固定，然后用冰凍切片包埋劑（OCT）包埋，冰凍切片機切10 μm厚，行番紅O、Ⅱ型膠原免疫組化和甲苯胺藍染色，光鏡下觀察。

1.7.2 免疫熒光染色和熒光顯微鏡觀察 將10 μm冰凍切片血清封閉。4℃下鼠抗人Ⅱ型膠原一抗孵育過夜，羊抗鼠FITC標記的熒光抗體常溫下孵育40 min，90％甘油封片。熒光顯微鏡下觀察。

1.8 統(tǒng)計學方法 用SPSS 13.0軟件包進行統(tǒng)計學處理。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，2組間比較采用兩獨立樣本資料t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 電鏡支架結(jié)構(gòu)及倒置顯微鏡觀察 電鏡下CACM支架呈多孔性，孔徑100～250 μm，孔隙率91.3％，見圖1a。1周左右有部分軟骨細胞貼壁，呈短梭或多角形，接近融合時原代細胞呈不規(guī)則狀，見圖1b。而使用紗巾培養(yǎng)附著的細胞呈圓形，隨時間的延長，相互之間融合成片，細胞復層生長，甚至形成組織塊樣，見圖1c。

Fig.1 SEM micrographs of porous cartilage acellular matrix scaffold and canine chondrocytes圖1 電鏡支架結(jié)構(gòu)及倒置顯微鏡觀察

2.2 PKH26染料標記結(jié)果 熒光顯微鏡下細胞膜呈紅色熒光，細胞染色較均勻，見圖2a。流式細胞儀顯示標記百分率為95.12％，見圖2b，臺盼藍染色細胞活力達96％以上。生長曲線結(jié)果顯標記組與對照組示犬軟骨細胞PKH26第1～6天OD值差異均無統(tǒng)計學意義（t分別為0.078、0.105、0.286、1.584、0.877、1.488，均P＞0.05，n=5），見圖2c。

2.3 分子熒光活體成像系統(tǒng)評估 在激發(fā)光下可見裸鼠背部組織工程化軟骨組織呈現(xiàn)圓形強熒光，見圖3a，與同位置的X線圖像合并，可清楚顯示組織工程化軟骨組織在裸鼠體內(nèi)的解剖位置，見圖3b。

2.4 標本取材染色結(jié)果 4周后類軟骨樣組織標本切片番紅O染色陽性，見圖4a；Ⅱ型膠原染色陽性，見圖4b；甲苯胺藍染色陽性，見圖4c。

2.5 免疫熒光染色 取材的類軟骨樣組織標本在熒光顯微鏡下細胞呈紅色熒光，見圖5a；同一視野內(nèi)軟骨細胞周圍顯示綠色熒光（Ⅱ型膠原免疫熒光FITC），見圖5b；兩視野重疊呈黃色熒光，見圖5c。

3 討論

3.1 PKH26熒光標記特點 理想的標記技術應具有操作簡便、標記率高、熒光強度強等特點，PKH26作為一種熒光染料，呈現(xiàn)紅色熒光，標記過程簡單易行[5]。其作用于細胞膜半衰期長，且可隨著細胞分裂而傳遞。基于以上特點，使其成為用于體內(nèi)細胞的示蹤研究的常用方法[6]。彭艷等[7]通過PKH26標記大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞，體外培養(yǎng)并誘導分化，然后通過鼠尾靜脈移植到子宮內(nèi)膜，觀察其分布情況，從而證明了PKH26標記技術可用于示蹤骨髓間充質(zhì)干細胞的遷移、轉(zhuǎn)歸和移植方面的研究。在軟骨組織工程研究中，有研究者把羊骨髓基質(zhì)干細胞用PKH26標記后種植到多孔支架上，培養(yǎng)一段時間后移入到受損的羊膝關節(jié)內(nèi)觀察受損膝關節(jié)修復情況，于4、8周取材觀察顯示缺損修復良好，生成的軟骨樣組織主要為紅色熒光細胞[8]。

3.2 活體熒光成像技術 目前在組織工程研究中，體外評估細胞-支架復合物結(jié)果直觀且操作簡單。常用的方法有細胞活性染色[9]、細胞增殖的評估[10]和代謝活動評估等[11]。而體內(nèi)評估方法卻相對單一，最常用的方法是處死動物取樣本進行評估。這種方法缺點明顯，無法對同一樣本長期動態(tài)追蹤觀察，而且得到的標本無法區(qū)分細胞來源。本研究所用的分子熒光活體成像系統(tǒng)彌補了傳統(tǒng)方法的不足。該方法能夠檢測到動物體內(nèi)發(fā)出的低劑量熒光，靈敏度高，操作簡便，且能夠穿透一定厚度的組織。與傳統(tǒng)的活體取材相比，具有無創(chuàng)、精確、可長期動態(tài)監(jiān)測等特點?；谝陨蟽?yōu)點，分子熒光活體成像系統(tǒng)已經(jīng)被應用于標記腫瘤組織[12]、轉(zhuǎn)基因細胞的生長情況[13]以及基因載體傳送評估[14]。當然，活體熒光成像系統(tǒng)也有不足之處，比如對密度或厚度較大的組織可能難以穿透而顯色不足；顯像不夠具體，無法直接觀察細胞形態(tài)等。

3.3 CACM支架及細胞培養(yǎng) 本研究使用的CACM多孔支架為本研究小組自行研制，具備適宜的大小、均勻的孔徑和高度的孔隙率以及良好的細胞相容性。另外，本實驗采用Ⅱ型膠原酶消化聯(lián)合紗巾培養(yǎng)法分離培養(yǎng)犬軟骨細胞，與傳統(tǒng)的貼壁培養(yǎng)法相比能更好地保持軟骨細胞的表型及特點。

3.4 PKH26標記和分子熒光活體成像技術聯(lián)合應用 體內(nèi)植入4周后，分子熒光體內(nèi)成像系統(tǒng)顯示在裸鼠背部區(qū)域可見植入的細胞/支架組織工程復合體呈現(xiàn)圓形強熒光，無擴散，表明軟骨細胞在CACM多孔支架上生長良好。取出樣本切片固定進行組織學染色，可見大量軟骨細胞，番紅O染色、Ⅱ型膠原免疫組化染色和甲苯胺藍染色陽性則證明組織中含有糖胺聚糖、Ⅱ型膠原成分和硫酸軟骨素，表明得到的標本是類軟骨組織。此外，將熒光圖像與同位置的X線圖像融合，可以得到樣本在裸鼠體內(nèi)更準確的位置。最后，Ⅱ型膠原免疫熒光染色顯示說明種植的軟骨細胞在支架中與周圍組織均相互融合生長，成功在裸鼠背部構(gòu)建出軟骨樣組織。

綜上所述，PKH26熒光標記著色均勻，標記率高，效果肯定。分子熒光體內(nèi)成像系統(tǒng)靈敏度高，操作簡便。兩種方法相結(jié)合用于軟骨組織工程，能夠較理想地評估組織工程化組織在體內(nèi)的生長情況。

Fig.2 PKH26 labeled chondrocytes圖2 軟骨細胞PKH26標記結(jié)果

Fig.3 Evaluation of Molecular light imaging system圖3 分子熒光活體成像系統(tǒng)評估

Fig.4 The staining for tissue-engineered cartilage（×40）圖4 異位構(gòu)建軟骨樣組織免疫組化染色結(jié)果（×40）

Fig.5 Immunofluorescent staining of tissue-engineered cartilage（×40）圖5 異位構(gòu)建軟骨樣組織免疫熒光染色（×40）

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（2014-07-11收稿 2014-08-08修回）

（本文編輯 李鵬）

Evaluation of Cartilage Engineering Using PKH26 and Molecular Light Imaging System

QI Jizhou1，XU Baoshan2△，PENG Jiang3，XU Wenjing3，YANG Qiang2
1 Graduate School,Tianjin Medical University,Tianjin 300070,China；2 Tianjin Hospital；3 Institute of Orthopaedics,Chinese People’s Liberation Army General Hospital
△

E-mail：xubaoshan99@126.com

ObjectiveTo investigate the application of PKH26 and molecular light imaging system in cartilage engineering.MethodsCanine chondrocyte was labeled by fluorescent dye PKH26 and seeded into the porous cartilage acellular matrix scaffold.The cells/scaffold constructs were cultured in vitro for 1 week.Then the constructs were implanted into the dorsal pocket of nude mice.We utilized a molecular light imaging system to macroscopically observe cells/scaffold constructs in vivo with fluorescence at the 4thweeks,and compared with X-rays taken at the same position.The fluorescence images were compared with the immunohistochemical and immunofluorescent results of cartilage-like tissue in vivo.ResultsLuminescent images were acquired at the 4thweeks,a red color enhanced overlay of the luminescent image over X-ray photographic image demonstrated the location of the implants and the cell viability and cell growth on porous CACM scaffold in vivo were very well.Histological results show that the safranin O,anti-collagenⅡimmunohistochemistry and toluidine blue stain of cartilage-like tissue is positive.Immunofluorescence examination demonstrated chondrocytes in the constructs whitch is showen red fluorescence,and anti-collagenⅡimmunofluorescent staining was showen in green while the overlapping image is showen in yellow.ConclusionThis study outlines an applicable non-destructive method to evaluate cell growth in tissue engineering constructs in vivo using PKH26 and molecular light imaging system.

chondrocytes；tissue engineering；fluorescence；PKH26

R329-33，R349.89

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.12.002

國家自然科學基金資助項目（81272046,31300798, 31000432）；中國博士后科學基金項目（2011M500530，2012T50235）；天津市衛(wèi)生局科技基金（2013KR16）

1天津醫(yī)科大學研究生院（郵編300070）；2天津市天津醫(yī)院脊柱外科；3中國人民解放軍總醫(yī)院

△通訊作者 E-mail：xubaoshan99@126.com