趙振軍　劉勤晉

摘要：以市售普洱茶為研究對象，采用國家標準方法，分別檢測普洱茶茶葉和沖泡后各批次茶湯中細菌總數(shù)，并采用形態(tài)觀察與生化試驗對從普洱茶湯中分離的細菌進行了鑒定。結(jié)果表明，普洱熟茶細菌菌落數(shù)多于普洱生茶茶樣，同時散茶中細菌菌落數(shù)高于緊壓茶；普洱茶第一泡茶湯中細菌菌落數(shù)超過GB/T 19296-2003小于或等于100 CFU/mL的規(guī)定值，且從第一泡茶湯中能檢測出致病菌，而其他沖泡批次茶湯中細菌的菌落數(shù)與種類都符合安全標準，適合飲用。

關(guān)鍵詞：普洱茶；細菌；分離；安全性

中圖分類號：TS272.7 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）05-1032-04

普洱茶因具有減肥、降血壓、抗氧化[1]、抑制脂肪酸合成酶基因表達[2]，清除自由基 [3]，降低總的膽固醇[4]等多重功效，深受大眾喜愛，已經(jīng)成為人們?nèi)粘ｏ嬈分弧Ｆ斩枋且环N后發(fā)酵茶，后發(fā)酵的本質(zhì)是微生物參與普洱茶品質(zhì)的形成，普洱成品茶會不可避免含有一定量微生物。為安全飲用普洱茶起見，與其他茶類的沖泡相比，通常會采用沸水殺菌，并增加一道洗茶工序，進一步去除微生物[5，6]。但關(guān)于沸水沖泡是否會減少普洱茶茶湯中微生物種群數(shù)量、經(jīng)沸水沖泡后普洱茶茶湯中是否含有有害菌等的研究鮮見報道。因此，通過對普洱茶沸水沖泡過程中細菌數(shù)量變化進行分析，并采用形態(tài)觀察與生化反應(yīng)的方式對茶湯中殘留的細菌進行鑒定，為普洱茶的安全飲用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選擇當年產(chǎn)普洱生、熟茶茶樣6個，購自云南昆明。檸檬酸三鈉、硫代硫酸鈉、甘露醇、瓊脂粉等為北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司分析純產(chǎn)品。

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：稱取本品45 g加入1 000 mL去離子水中，高壓滅菌備用。各種染色液、溶液、培養(yǎng)基按照GB/T 4789.28-2003 《食品衛(wèi)生微生物學檢驗 染色法、培養(yǎng)基和試劑》說明配制[7]。相關(guān)試驗操作參見《微生物學實驗教程》[8]。兔血漿的制備參見《食品微生物學實驗原理與技術(shù)》[9]。

1.2 試驗方法

1.2.1 茶湯的制備 稱取茶葉2.50 g加入250 mL沸水，10 s后傾出茶湯，定容250 mL，即為第1泡茶湯；再加入250 mL沸水于原錐形瓶中，30 s后倒盡茶湯，定容至250 mL，為第2 泡茶湯；依此類推共泡6次，2～6次沖泡時間均為30 s，分取6泡茶湯進行細菌群落分析。

1.2.2 細菌的分離與計數(shù) 茶樣及茶湯中細菌的分離與計數(shù)采用平板稀釋法，參照GB/T4789.2-2003《食品衛(wèi)生微生物學檢驗 菌落總數(shù)測定》[10]進行。6個茶樣沖泡茶湯菌落數(shù)取平均值。

1.2.3 細菌形態(tài)鑒定 菌落形態(tài)觀察：觀察記錄菌落在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上的大小、顏色、質(zhì)地等。菌體形態(tài)觀察：革蘭氏染色，將細菌均勻涂布在載玻片上，鏡下觀察并記錄細菌形態(tài)。

1.2.4 細菌生理生化鑒定 根據(jù)形態(tài)觀察結(jié)果，對菌種進行大致分類（無芽孢桿菌、芽孢桿菌、球菌、弧菌），查閱《伯杰細菌鑒定手冊》[11]，確定所要鑒定的各菌種的各項生理生化試驗：吲哚試驗、甲基紅試驗、VP試驗、枸櫞酸鹽試驗、硫化氫試驗、尿酶試驗、糖（葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖）發(fā)酵試驗、血漿凝固酶試驗等。具體試驗操作參照《微生物學實驗教程》[8]進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 普洱茶茶樣中細菌菌落數(shù)

將普洱茶樣品采用無菌生理鹽水稀釋后，采用平板計數(shù)法，對從市場上選取的當年產(chǎn)普洱茶中細菌菌落數(shù)量進行了統(tǒng)計，普洱茶茶樣中細菌菌落計數(shù)結(jié)果如表1所示。表 1 可知，普洱熟茶細菌菌落數(shù)為0.64×102～2.01×104 CFU/g，普洱生茶細菌菌落數(shù)為0.50×102～6.73×103 CFU/g，相較而言普洱熟茶細菌菌落數(shù)多于普洱生茶，同時散茶中細菌菌落數(shù)高于緊壓茶，如普洱熟散茶中細菌菌落數(shù)最大為2.01×104 CFU/g，而熟磚和熟沱兩種緊壓茶中細菌菌落數(shù)分別為1.59×102和0.64×102 CFU/g，可能與緊壓茶壓制過程中有一個高溫蒸軟的過程有關(guān)，另從普洱茶樣品含水量可以看出，含水量高低與細菌菌落數(shù)存在一定的正相關(guān)，可能是因為含水量越低的茶樣需要烘焙更長的時間，可以殺死更多的細菌。

2.2 不同沖泡次數(shù)茶湯中細菌菌落數(shù)

對選定的普洱熟茶茶樣采用沸水進行沖泡，分次沖泡所得茶湯中細菌菌落數(shù)統(tǒng)計，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，隨沖泡次數(shù)增加，普洱茶茶湯中細菌菌落數(shù)逐漸減少，第一次沖泡10 s，茶湯中細菌菌落數(shù)為3.12×102 CFU/mL，超過GB/T 19296-2003規(guī)定茶飲料中微生物種群數(shù)量應(yīng)小于或等于100 CFU/mL的標準[12]，而二泡之后，茶湯中細菌菌落數(shù)為0.97×102 CFU/mL，菌落數(shù)已經(jīng)降低至茶飲料中微生物種群數(shù)量最低標準，但是否可以安全飲用，仍取決于菌落中是否含有致病菌。

2.2 不同沖泡次數(shù)茶湯中細菌的形態(tài)觀察

采用平板劃線法，對分次沖泡所得茶湯中含有的細菌進行分離純化，首先通過肉眼或放大鏡進行形態(tài)觀察，根據(jù)菌落的大小、顏色、質(zhì)地等，初步篩選出13株不同的細菌，然后進一步對菌種進行革蘭氏染色和顯微形態(tài)觀察。細菌形態(tài)描述及顯微形態(tài)結(jié)果見表2。從顯微形態(tài)可以看出，茶湯中細菌總體來說屬于兩類：桿菌與球菌。根據(jù)不同沖泡次數(shù)細菌的分離與形態(tài)鑒定結(jié)果可知，隨沖泡次數(shù)增加，不僅菌落數(shù)減少，而且細菌種類也明顯減少。如第一泡茶湯中含有細菌9種，其中桿菌6種、球菌3種（表2中菌株1～3，5～7，11～13），第二泡茶湯含細菌4種，其中桿菌3種、球菌1種（表2中菌株2，3，12）；第三泡茶湯含細菌2種（1種桿菌，1種球菌，表2中菌株4，9）；第四至第六泡茶湯中含細菌種類均為1種（分別為表2中菌株6，10）。

2.3 茶湯中細菌的生化鑒定

根據(jù)其形態(tài)特征，初步將篩選出的13株細菌判定為桿菌與球菌，而桿菌中的大腸桿菌，球菌類的金黃色葡萄球菌等都屬于致病性細菌，要評價茶湯中細菌的安全性，需要通過相關(guān)的生化試驗，以確定其致病性。參照《伯杰細菌鑒定手冊》[11]，對菌株1～7開展葡萄糖、蔗糖、乳糖、三糖鐵斜面等生化試驗，發(fā)現(xiàn)枸櫞酸鹽試驗呈陰性，顯示桿菌1～7不屬于克雷伯菌屬、沙門菌屬，菌株1～4，6發(fā)酵乳糖呈陰性，說明菌株1～4，6不屬于大腸桿菌，進一步VP試驗與甲基紅試驗呈陰性，說明菌株1～4，6可能屬于沙門、志賀、變形、枸櫞酸桿菌等，而菌株5在乳糖發(fā)酵、VP試驗、甲基紅試驗均呈陽性說明菌株5是大腸桿菌，而其他桿菌1～4，6均不具有致病性。對菌株8～13開展觸酶試驗，菌株8～12均呈陽性，說明菌株8～12可能是葡萄球菌；通過血漿凝固酶試驗，菌株12呈陽性，由此判斷菌株12具有致病性，可能是金黃色葡萄球菌；血漿凝固酶試驗、膽汁溶菌酶試驗菌株13呈陰性，可以排除菌株13屬于肺炎鏈球菌的可能。通過生化試驗，可鑒定從普洱茶茶湯中分離的菌株5屬于大腸桿菌，菌株12可能屬于金黃色葡萄球菌，具有致病性，而其他菌株屬于非致病性的桿菌和球菌（表3）。而致病菌均來自普洱茶第一次沖泡的茶湯，可能初次沖泡10 s時間太短，高溫沸水尚未將致病菌殺死。

3 結(jié)論

普洱茶中含有一定量的細菌，采用沸水沖泡有助于殺滅細菌。普洱茶第一次沖泡的茶湯細菌菌落數(shù)超過GB/T 19296-2003規(guī)定茶飲料中微生物種群數(shù)量應(yīng)小于或等于100 CFU/mL的標準，而且第一泡中由于沸水作用時間短，普洱茶中的致病菌可能仍然具有活性，所以從安全方面考慮，普洱茶第二泡及后面沖泡的茶水更適合飲用。

參考文獻：

[1] CHIANG C T， WENG M S， LIN-SHIAU S Y， et al. Pu-erh tea supplementation suppresses fatty acid synthase expression in the rat liver through down regulating Akt and JNK signalings as demonstrated in human hepatoma HepG2 cells[J].Oncology Research，2006，16（3）：119-128.

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[4] KUO K L， WENG M S， CHIANG C T， et al. Comparative studies on the hypolipidemic and growth suppressive effects of oolong， black， pu-erh， and green tea leaves in rats[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2005，53（2）：480-489.

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[8] 陳崢宏.微生物學實驗教程[M].上海：第二軍醫(yī)大學出版社，2008.

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[12] GB/T 19296-2003，茶飲料衛(wèi)生標準[S].

2.3 茶湯中細菌的生化鑒定

根據(jù)其形態(tài)特征，初步將篩選出的13株細菌判定為桿菌與球菌，而桿菌中的大腸桿菌，球菌類的金黃色葡萄球菌等都屬于致病性細菌，要評價茶湯中細菌的安全性，需要通過相關(guān)的生化試驗，以確定其致病性。參照《伯杰細菌鑒定手冊》[11]，對菌株1～7開展葡萄糖、蔗糖、乳糖、三糖鐵斜面等生化試驗，發(fā)現(xiàn)枸櫞酸鹽試驗呈陰性，顯示桿菌1～7不屬于克雷伯菌屬、沙門菌屬，菌株1～4，6發(fā)酵乳糖呈陰性，說明菌株1～4，6不屬于大腸桿菌，進一步VP試驗與甲基紅試驗呈陰性，說明菌株1～4，6可能屬于沙門、志賀、變形、枸櫞酸桿菌等，而菌株5在乳糖發(fā)酵、VP試驗、甲基紅試驗均呈陽性說明菌株5是大腸桿菌，而其他桿菌1～4，6均不具有致病性。對菌株8～13開展觸酶試驗，菌株8～12均呈陽性，說明菌株8～12可能是葡萄球菌；通過血漿凝固酶試驗，菌株12呈陽性，由此判斷菌株12具有致病性，可能是金黃色葡萄球菌；血漿凝固酶試驗、膽汁溶菌酶試驗菌株13呈陰性，可以排除菌株13屬于肺炎鏈球菌的可能。通過生化試驗，可鑒定從普洱茶茶湯中分離的菌株5屬于大腸桿菌，菌株12可能屬于金黃色葡萄球菌，具有致病性，而其他菌株屬于非致病性的桿菌和球菌（表3）。而致病菌均來自普洱茶第一次沖泡的茶湯，可能初次沖泡10 s時間太短，高溫沸水尚未將致病菌殺死。

3 結(jié)論

普洱茶中含有一定量的細菌，采用沸水沖泡有助于殺滅細菌。普洱茶第一次沖泡的茶湯細菌菌落數(shù)超過GB/T 19296-2003規(guī)定茶飲料中微生物種群數(shù)量應(yīng)小于或等于100 CFU/mL的標準，而且第一泡中由于沸水作用時間短，普洱茶中的致病菌可能仍然具有活性，所以從安全方面考慮，普洱茶第二泡及后面沖泡的茶水更適合飲用。

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2.3 茶湯中細菌的生化鑒定

根據(jù)其形態(tài)特征，初步將篩選出的13株細菌判定為桿菌與球菌，而桿菌中的大腸桿菌，球菌類的金黃色葡萄球菌等都屬于致病性細菌，要評價茶湯中細菌的安全性，需要通過相關(guān)的生化試驗，以確定其致病性。參照《伯杰細菌鑒定手冊》[11]，對菌株1～7開展葡萄糖、蔗糖、乳糖、三糖鐵斜面等生化試驗，發(fā)現(xiàn)枸櫞酸鹽試驗呈陰性，顯示桿菌1～7不屬于克雷伯菌屬、沙門菌屬，菌株1～4，6發(fā)酵乳糖呈陰性，說明菌株1～4，6不屬于大腸桿菌，進一步VP試驗與甲基紅試驗呈陰性，說明菌株1～4，6可能屬于沙門、志賀、變形、枸櫞酸桿菌等，而菌株5在乳糖發(fā)酵、VP試驗、甲基紅試驗均呈陽性說明菌株5是大腸桿菌，而其他桿菌1～4，6均不具有致病性。對菌株8～13開展觸酶試驗，菌株8～12均呈陽性，說明菌株8～12可能是葡萄球菌；通過血漿凝固酶試驗，菌株12呈陽性，由此判斷菌株12具有致病性，可能是金黃色葡萄球菌；血漿凝固酶試驗、膽汁溶菌酶試驗菌株13呈陰性，可以排除菌株13屬于肺炎鏈球菌的可能。通過生化試驗，可鑒定從普洱茶茶湯中分離的菌株5屬于大腸桿菌，菌株12可能屬于金黃色葡萄球菌，具有致病性，而其他菌株屬于非致病性的桿菌和球菌（表3）。而致病菌均來自普洱茶第一次沖泡的茶湯，可能初次沖泡10 s時間太短，高溫沸水尚未將致病菌殺死。

3 結(jié)論

普洱茶中含有一定量的細菌，采用沸水沖泡有助于殺滅細菌。普洱茶第一次沖泡的茶湯細菌菌落數(shù)超過GB/T 19296-2003規(guī)定茶飲料中微生物種群數(shù)量應(yīng)小于或等于100 CFU/mL的標準，而且第一泡中由于沸水作用時間短，普洱茶中的致病菌可能仍然具有活性，所以從安全方面考慮，普洱茶第二泡及后面沖泡的茶水更適合飲用。

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