趙振軍　劉勤晉

摘要：以市售普洱茶為研究對象，采用國家標(biāo)準(zhǔn)方法，分別檢測普洱茶茶葉和沖泡后各批次茶湯中細(xì)菌總數(shù)，并采用形態(tài)觀察與生化試驗(yàn)對從普洱茶湯中分離的細(xì)菌進(jìn)行了鑒定。結(jié)果表明，普洱熟茶細(xì)菌菌落數(shù)多于普洱生茶茶樣，同時(shí)散茶中細(xì)菌菌落數(shù)高于緊壓茶；普洱茶第一泡茶湯中細(xì)菌菌落數(shù)超過GB/T 19296-2003小于或等于100 CFU/mL的規(guī)定值，且從第一泡茶湯中能檢測出致病菌，而其他沖泡批次茶湯中細(xì)菌的菌落數(shù)與種類都符合安全標(biāo)準(zhǔn)，適合飲用。

關(guān)鍵詞：普洱茶；細(xì)菌；分離；安全性

中圖分類號：TS272.7 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）05-1032-04

普洱茶因具有減肥、降血壓、抗氧化[1]、抑制脂肪酸合成酶基因表達(dá)[2]，清除自由基 [3]，降低總的膽固醇[4]等多重功效，深受大眾喜愛，已經(jīng)成為人們?nèi)粘ｏ嬈分?。普洱茶是一種后發(fā)酵茶，后發(fā)酵的本質(zhì)是微生物參與普洱茶品質(zhì)的形成，普洱成品茶會(huì)不可避免含有一定量微生物。為安全飲用普洱茶起見，與其他茶類的沖泡相比，通常會(huì)采用沸水殺菌，并增加一道洗茶工序，進(jìn)一步去除微生物[5，6]。但關(guān)于沸水沖泡是否會(huì)減少普洱茶茶湯中微生物種群數(shù)量、經(jīng)沸水沖泡后普洱茶茶湯中是否含有有害菌等的研究鮮見報(bào)道。因此，通過對普洱茶沸水沖泡過程中細(xì)菌數(shù)量變化進(jìn)行分析，并采用形態(tài)觀察與生化反應(yīng)的方式對茶湯中殘留的細(xì)菌進(jìn)行鑒定，為普洱茶的安全飲用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選擇當(dāng)年產(chǎn)普洱生、熟茶茶樣6個(gè)，購自云南昆明。檸檬酸三鈉、硫代硫酸鈉、甘露醇、瓊脂粉等為北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司分析純產(chǎn)品。

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：稱取本品45 g加入1 000 mL去離子水中，高壓滅菌備用。各種染色液、溶液、培養(yǎng)基按照GB/T 4789.28-2003 《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 染色法、培養(yǎng)基和試劑》說明配制[7]。相關(guān)試驗(yàn)操作參見《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程》[8]。兔血漿的制備參見《食品微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)原理與技術(shù)》[9]。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 茶湯的制備 稱取茶葉2.50 g加入250 mL沸水，10 s后傾出茶湯，定容250 mL，即為第1泡茶湯；再加入250 mL沸水于原錐形瓶中，30 s后倒盡茶湯，定容至250 mL，為第2 泡茶湯；依此類推共泡6次，2～6次沖泡時(shí)間均為30 s，分取6泡茶湯進(jìn)行細(xì)菌群落分析。

1.2.2 細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù) 茶樣及茶湯中細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)采用平板稀釋法，參照GB/T4789.2-2003《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測定》[10]進(jìn)行。6個(gè)茶樣沖泡茶湯菌落數(shù)取平均值。

1.2.3 細(xì)菌形態(tài)鑒定 菌落形態(tài)觀察：觀察記錄菌落在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上的大小、顏色、質(zhì)地等。菌體形態(tài)觀察：革蘭氏染色，將細(xì)菌均勻涂布在載玻片上，鏡下觀察并記錄細(xì)菌形態(tài)。

1.2.4 細(xì)菌生理生化鑒定 根據(jù)形態(tài)觀察結(jié)果，對菌種進(jìn)行大致分類（無芽孢桿菌、芽孢桿菌、球菌、弧菌），查閱《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》[11]，確定所要鑒定的各菌種的各項(xiàng)生理生化試驗(yàn)：吲哚試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、VP試驗(yàn)、枸櫞酸鹽試驗(yàn)、硫化氫試驗(yàn)、尿酶試驗(yàn)、糖（葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖）發(fā)酵試驗(yàn)、血漿凝固酶試驗(yàn)等。具體試驗(yàn)操作參照《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程》[8]進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 普洱茶茶樣中細(xì)菌菌落數(shù)

將普洱茶樣品采用無菌生理鹽水稀釋后，采用平板計(jì)數(shù)法，對從市場上選取的當(dāng)年產(chǎn)普洱茶中細(xì)菌菌落數(shù)量進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)，普洱茶茶樣中細(xì)菌菌落計(jì)數(shù)結(jié)果如表1所示。表 1 可知，普洱熟茶細(xì)菌菌落數(shù)為0.64×102～2.01×104 CFU/g，普洱生茶細(xì)菌菌落數(shù)為0.50×102～6.73×103 CFU/g，相較而言普洱熟茶細(xì)菌菌落數(shù)多于普洱生茶，同時(shí)散茶中細(xì)菌菌落數(shù)高于緊壓茶，如普洱熟散茶中細(xì)菌菌落數(shù)最大為2.01×104 CFU/g，而熟磚和熟沱兩種緊壓茶中細(xì)菌菌落數(shù)分別為1.59×102和0.64×102 CFU/g，可能與緊壓茶壓制過程中有一個(gè)高溫蒸軟的過程有關(guān)，另從普洱茶樣品含水量可以看出，含水量高低與細(xì)菌菌落數(shù)存在一定的正相關(guān)，可能是因?yàn)楹吭降偷牟铇有枰姹焊L的時(shí)間，可以殺死更多的細(xì)菌。

2.2 不同沖泡次數(shù)茶湯中細(xì)菌菌落數(shù)

對選定的普洱熟茶茶樣采用沸水進(jìn)行沖泡，分次沖泡所得茶湯中細(xì)菌菌落數(shù)統(tǒng)計(jì)，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，隨沖泡次數(shù)增加，普洱茶茶湯中細(xì)菌菌落數(shù)逐漸減少，第一次沖泡10 s，茶湯中細(xì)菌菌落數(shù)為3.12×102 CFU/mL，超過GB/T 19296-2003規(guī)定茶飲料中微生物種群數(shù)量應(yīng)小于或等于100 CFU/mL的標(biāo)準(zhǔn)[12]，而二泡之后，茶湯中細(xì)菌菌落數(shù)為0.97×102 CFU/mL，菌落數(shù)已經(jīng)降低至茶飲料中微生物種群數(shù)量最低標(biāo)準(zhǔn)，但是否可以安全飲用，仍取決于菌落中是否含有致病菌。

2.2 不同沖泡次數(shù)茶湯中細(xì)菌的形態(tài)觀察

采用平板劃線法，對分次沖泡所得茶湯中含有的細(xì)菌進(jìn)行分離純化，首先通過肉眼或放大鏡進(jìn)行形態(tài)觀察，根據(jù)菌落的大小、顏色、質(zhì)地等，初步篩選出13株不同的細(xì)菌，然后進(jìn)一步對菌種進(jìn)行革蘭氏染色和顯微形態(tài)觀察。細(xì)菌形態(tài)描述及顯微形態(tài)結(jié)果見表2。從顯微形態(tài)可以看出，茶湯中細(xì)菌總體來說屬于兩類：桿菌與球菌。根據(jù)不同沖泡次數(shù)細(xì)菌的分離與形態(tài)鑒定結(jié)果可知，隨沖泡次數(shù)增加，不僅菌落數(shù)減少，而且細(xì)菌種類也明顯減少。如第一泡茶湯中含有細(xì)菌9種，其中桿菌6種、球菌3種（表2中菌株1～3，5～7，11～13），第二泡茶湯含細(xì)菌4種，其中桿菌3種、球菌1種（表2中菌株2，3，12）；第三泡茶湯含細(xì)菌2種（1種桿菌，1種球菌，表2中菌株4，9）；第四至第六泡茶湯中含細(xì)菌種類均為1種（分別為表2中菌株6，10）。

2.3 茶湯中細(xì)菌的生化鑒定

根據(jù)其形態(tài)特征，初步將篩選出的13株細(xì)菌判定為桿菌與球菌，而桿菌中的大腸桿菌，球菌類的金黃色葡萄球菌等都屬于致病性細(xì)菌，要評價(jià)茶湯中細(xì)菌的安全性，需要通過相關(guān)的生化試驗(yàn)，以確定其致病性。參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》[11]，對菌株1～7開展葡萄糖、蔗糖、乳糖、三糖鐵斜面等生化試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)枸櫞酸鹽試驗(yàn)呈陰性，顯示桿菌1～7不屬于克雷伯菌屬、沙門菌屬，菌株1～4，6發(fā)酵乳糖呈陰性，說明菌株1～4，6不屬于大腸桿菌，進(jìn)一步VP試驗(yàn)與甲基紅試驗(yàn)呈陰性，說明菌株1～4，6可能屬于沙門、志賀、變形、枸櫞酸桿菌等，而菌株5在乳糖發(fā)酵、VP試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)均呈陽性說明菌株5是大腸桿菌，而其他桿菌1～4，6均不具有致病性。對菌株8～13開展觸酶試驗(yàn)，菌株8～12均呈陽性，說明菌株8～12可能是葡萄球菌；通過血漿凝固酶試驗(yàn)，菌株12呈陽性，由此判斷菌株12具有致病性，可能是金黃色葡萄球菌；血漿凝固酶試驗(yàn)、膽汁溶菌酶試驗(yàn)菌株13呈陰性，可以排除菌株13屬于肺炎鏈球菌的可能。通過生化試驗(yàn)，可鑒定從普洱茶茶湯中分離的菌株5屬于大腸桿菌，菌株12可能屬于金黃色葡萄球菌，具有致病性，而其他菌株屬于非致病性的桿菌和球菌（表3）。而致病菌均來自普洱茶第一次沖泡的茶湯，可能初次沖泡10 s時(shí)間太短，高溫沸水尚未將致病菌殺死。

3 結(jié)論

普洱茶中含有一定量的細(xì)菌，采用沸水沖泡有助于殺滅細(xì)菌。普洱茶第一次沖泡的茶湯細(xì)菌菌落數(shù)超過GB/T 19296-2003規(guī)定茶飲料中微生物種群數(shù)量應(yīng)小于或等于100 CFU/mL的標(biāo)準(zhǔn)，而且第一泡中由于沸水作用時(shí)間短，普洱茶中的致病菌可能仍然具有活性，所以從安全方面考慮，普洱茶第二泡及后面沖泡的茶水更適合飲用。

參考文獻(xiàn)：

[1] CHIANG C T， WENG M S， LIN-SHIAU S Y， et al. Pu-erh tea supplementation suppresses fatty acid synthase expression in the rat liver through down regulating Akt and JNK signalings as demonstrated in human hepatoma HepG2 cells[J].Oncology Research，2006，16（3）：119-128.

[2] DUH P D，YEN G C，YEN W J，et al. Effects of pu-erh tea on oxidative damage and nitric oxide scavenging[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2004，52（26）：8169-8176.

[3] JIE G L， LIN Z， ZHANG L Z， et al. Free radical scavenging effect of Pu-erh tea extracts and their protective effect on oxidative damage in human fibroblast cells[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2006，54（21）：8058-8064.

[4] KUO K L， WENG M S， CHIANG C T， et al. Comparative studies on the hypolipidemic and growth suppressive effects of oolong， black， pu-erh， and green tea leaves in rats[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2005，53（2）：480-489.

[5] 劉勤晉，周才瓊，許鴻亮，等.普洱茶的渥堆作用[J].茶葉科學(xué)，1986，6（2）：55-56.

[6] 陸松侯，施兆鵬.茶葉審評與檢驗(yàn)[M].第三版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2001.

[7] GB/T 4789.28-2003，食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 染色法、培養(yǎng)基和試劑[S].

[8] 陳崢宏.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程[M].上海：第二軍醫(yī)大學(xué)出版社，2008.

[9] 李平蘭，賀稚非.食品微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)原理與技術(shù)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2005.

[10] GB/T 4789.2-2010，食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測定[S].

[11] 布坎南 R E，吉本斯 N E.伯杰細(xì)菌鑒定手冊[M].第八版. 中國科學(xué)院微生物研究所《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》翻譯組，譯.北京：科學(xué)出版社，1984.

[12] GB/T 19296-2003，茶飲料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)[S].

2.3 茶湯中細(xì)菌的生化鑒定

根據(jù)其形態(tài)特征，初步將篩選出的13株細(xì)菌判定為桿菌與球菌，而桿菌中的大腸桿菌，球菌類的金黃色葡萄球菌等都屬于致病性細(xì)菌，要評價(jià)茶湯中細(xì)菌的安全性，需要通過相關(guān)的生化試驗(yàn)，以確定其致病性。參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》[11]，對菌株1～7開展葡萄糖、蔗糖、乳糖、三糖鐵斜面等生化試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)枸櫞酸鹽試驗(yàn)呈陰性，顯示桿菌1～7不屬于克雷伯菌屬、沙門菌屬，菌株1～4，6發(fā)酵乳糖呈陰性，說明菌株1～4，6不屬于大腸桿菌，進(jìn)一步VP試驗(yàn)與甲基紅試驗(yàn)呈陰性，說明菌株1～4，6可能屬于沙門、志賀、變形、枸櫞酸桿菌等，而菌株5在乳糖發(fā)酵、VP試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)均呈陽性說明菌株5是大腸桿菌，而其他桿菌1～4，6均不具有致病性。對菌株8～13開展觸酶試驗(yàn)，菌株8～12均呈陽性，說明菌株8～12可能是葡萄球菌；通過血漿凝固酶試驗(yàn)，菌株12呈陽性，由此判斷菌株12具有致病性，可能是金黃色葡萄球菌；血漿凝固酶試驗(yàn)、膽汁溶菌酶試驗(yàn)菌株13呈陰性，可以排除菌株13屬于肺炎鏈球菌的可能。通過生化試驗(yàn)，可鑒定從普洱茶茶湯中分離的菌株5屬于大腸桿菌，菌株12可能屬于金黃色葡萄球菌，具有致病性，而其他菌株屬于非致病性的桿菌和球菌（表3）。而致病菌均來自普洱茶第一次沖泡的茶湯，可能初次沖泡10 s時(shí)間太短，高溫沸水尚未將致病菌殺死。

3 結(jié)論

普洱茶中含有一定量的細(xì)菌，采用沸水沖泡有助于殺滅細(xì)菌。普洱茶第一次沖泡的茶湯細(xì)菌菌落數(shù)超過GB/T 19296-2003規(guī)定茶飲料中微生物種群數(shù)量應(yīng)小于或等于100 CFU/mL的標(biāo)準(zhǔn)，而且第一泡中由于沸水作用時(shí)間短，普洱茶中的致病菌可能仍然具有活性，所以從安全方面考慮，普洱茶第二泡及后面沖泡的茶水更適合飲用。

參考文獻(xiàn)：

[1] CHIANG C T， WENG M S， LIN-SHIAU S Y， et al. Pu-erh tea supplementation suppresses fatty acid synthase expression in the rat liver through down regulating Akt and JNK signalings as demonstrated in human hepatoma HepG2 cells[J].Oncology Research，2006，16（3）：119-128.

[2] DUH P D，YEN G C，YEN W J，et al. Effects of pu-erh tea on oxidative damage and nitric oxide scavenging[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2004，52（26）：8169-8176.

[3] JIE G L， LIN Z， ZHANG L Z， et al. Free radical scavenging effect of Pu-erh tea extracts and their protective effect on oxidative damage in human fibroblast cells[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2006，54（21）：8058-8064.

[4] KUO K L， WENG M S， CHIANG C T， et al. Comparative studies on the hypolipidemic and growth suppressive effects of oolong， black， pu-erh， and green tea leaves in rats[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2005，53（2）：480-489.

[5] 劉勤晉，周才瓊，許鴻亮，等.普洱茶的渥堆作用[J].茶葉科學(xué)，1986，6（2）：55-56.

[6] 陸松侯，施兆鵬.茶葉審評與檢驗(yàn)[M].第三版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2001.

[7] GB/T 4789.28-2003，食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 染色法、培養(yǎng)基和試劑[S].

[8] 陳崢宏.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程[M].上海：第二軍醫(yī)大學(xué)出版社，2008.

[9] 李平蘭，賀稚非.食品微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)原理與技術(shù)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2005.

[10] GB/T 4789.2-2010，食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測定[S].

[11] 布坎南 R E，吉本斯 N E.伯杰細(xì)菌鑒定手冊[M].第八版. 中國科學(xué)院微生物研究所《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》翻譯組，譯.北京：科學(xué)出版社，1984.

[12] GB/T 19296-2003，茶飲料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)[S].

2.3 茶湯中細(xì)菌的生化鑒定

根據(jù)其形態(tài)特征，初步將篩選出的13株細(xì)菌判定為桿菌與球菌，而桿菌中的大腸桿菌，球菌類的金黃色葡萄球菌等都屬于致病性細(xì)菌，要評價(jià)茶湯中細(xì)菌的安全性，需要通過相關(guān)的生化試驗(yàn)，以確定其致病性。參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》[11]，對菌株1～7開展葡萄糖、蔗糖、乳糖、三糖鐵斜面等生化試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)枸櫞酸鹽試驗(yàn)呈陰性，顯示桿菌1～7不屬于克雷伯菌屬、沙門菌屬，菌株1～4，6發(fā)酵乳糖呈陰性，說明菌株1～4，6不屬于大腸桿菌，進(jìn)一步VP試驗(yàn)與甲基紅試驗(yàn)呈陰性，說明菌株1～4，6可能屬于沙門、志賀、變形、枸櫞酸桿菌等，而菌株5在乳糖發(fā)酵、VP試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)均呈陽性說明菌株5是大腸桿菌，而其他桿菌1～4，6均不具有致病性。對菌株8～13開展觸酶試驗(yàn)，菌株8～12均呈陽性，說明菌株8～12可能是葡萄球菌；通過血漿凝固酶試驗(yàn)，菌株12呈陽性，由此判斷菌株12具有致病性，可能是金黃色葡萄球菌；血漿凝固酶試驗(yàn)、膽汁溶菌酶試驗(yàn)菌株13呈陰性，可以排除菌株13屬于肺炎鏈球菌的可能。通過生化試驗(yàn)，可鑒定從普洱茶茶湯中分離的菌株5屬于大腸桿菌，菌株12可能屬于金黃色葡萄球菌，具有致病性，而其他菌株屬于非致病性的桿菌和球菌（表3）。而致病菌均來自普洱茶第一次沖泡的茶湯，可能初次沖泡10 s時(shí)間太短，高溫沸水尚未將致病菌殺死。

3 結(jié)論

普洱茶中含有一定量的細(xì)菌，采用沸水沖泡有助于殺滅細(xì)菌。普洱茶第一次沖泡的茶湯細(xì)菌菌落數(shù)超過GB/T 19296-2003規(guī)定茶飲料中微生物種群數(shù)量應(yīng)小于或等于100 CFU/mL的標(biāo)準(zhǔn)，而且第一泡中由于沸水作用時(shí)間短，普洱茶中的致病菌可能仍然具有活性，所以從安全方面考慮，普洱茶第二泡及后面沖泡的茶水更適合飲用。

參考文獻(xiàn)：

[1] CHIANG C T， WENG M S， LIN-SHIAU S Y， et al. Pu-erh tea supplementation suppresses fatty acid synthase expression in the rat liver through down regulating Akt and JNK signalings as demonstrated in human hepatoma HepG2 cells[J].Oncology Research，2006，16（3）：119-128.

[2] DUH P D，YEN G C，YEN W J，et al. Effects of pu-erh tea on oxidative damage and nitric oxide scavenging[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2004，52（26）：8169-8176.

[3] JIE G L， LIN Z， ZHANG L Z， et al. Free radical scavenging effect of Pu-erh tea extracts and their protective effect on oxidative damage in human fibroblast cells[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2006，54（21）：8058-8064.

[4] KUO K L， WENG M S， CHIANG C T， et al. Comparative studies on the hypolipidemic and growth suppressive effects of oolong， black， pu-erh， and green tea leaves in rats[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2005，53（2）：480-489.

[5] 劉勤晉，周才瓊，許鴻亮，等.普洱茶的渥堆作用[J].茶葉科學(xué)，1986，6（2）：55-56.

[6] 陸松侯，施兆鵬.茶葉審評與檢驗(yàn)[M].第三版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2001.

[7] GB/T 4789.28-2003，食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 染色法、培養(yǎng)基和試劑[S].

[8] 陳崢宏.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程[M].上海：第二軍醫(yī)大學(xué)出版社，2008.

[9] 李平蘭，賀稚非.食品微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)原理與技術(shù)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2005.

[10] GB/T 4789.2-2010，食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測定[S].

[11] 布坎南 R E，吉本斯 N E.伯杰細(xì)菌鑒定手冊[M].第八版. 中國科學(xué)院微生物研究所《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》翻譯組，譯.北京：科學(xué)出版社，1984.

[12] GB/T 19296-2003，茶飲料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)[S].