魏 嵬，周 磊，李 峰

（淮北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，安徽 淮北 235000）

中國是農(nóng)業(yè)大國，糧食生產(chǎn)量位居世界前列，然而，隨之帶來的秸稈產(chǎn)量卻高達(dá)7.0×108噸［1］.其中，只有很少一部分作為農(nóng)業(yè)肥料使用，絕大多數(shù)秸稈都是通過燃燒的方式處理掉，不僅利用率很低、造成能量的流失，而且污染環(huán)境、浪費(fèi)生物質(zhì)資源［2］.近些年，隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展、全球資源貧乏，生物質(zhì)能源的充分利用被提上日程，如何將這些木質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)變?yōu)榭捎媚茉闯蔀檠芯康臒狳c.

小麥秸稈作為日常生活中常見的秸稈，其主要結(jié)構(gòu)由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成，且從它們各自分子組成來看，都可以降解為較易利用的單糖.這三種成分復(fù)雜且聯(lián)系緊密，靠單一的菌種分解往往比較慢，不能得到有效利用.Michele等［3］提出了利用曲霉屬真菌使小麥秸稈自動水解方面的應(yīng)用；劉鵬等［4］從腐殖土壤中分離出能夠降解濾紙條的纖維素降解菌；陶樹興等［5］從土壤懸液中分離出能夠利用纖維素的固氮芽孢桿菌作為生產(chǎn)生物固氮菌肥料的菌株；向殿軍等［6］從土壤中篩選出能夠提高玉米秸稈利用率的優(yōu)質(zhì)菌種.而在自然界中，秸稈的降解通常是在多種微生物共同作用下完成的［7］，因此本研究先從自然界中篩選出可以獨自降解纖維素、半纖維素（主要成分為木聚糖）和木質(zhì)素的菌種，并做菌種鑒定和不同因素對還原糖產(chǎn)量的影響，并期望得到最佳的培養(yǎng)條件.

1 材料與方法

1.1 采樣

本校附近的村莊采集的牛糞、本校舊操場北面草地、逸夫樓周圍樹林和菜園表層2-12 cm土壤.

1.2 培養(yǎng)基

（1）纖維素培養(yǎng)基

CMC-Na 2.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，K2HPO41.0 g，NaCl 0.5 g，剛果紅 0.4 g，瓊脂 20 g，蒸餾水1 000 mL pH7.0.

（2）木聚糖培養(yǎng)基

K2HPO41.0 g，MgSO4·7 H2O 0.2 g，（NH4）2SO42 g，木聚糖10 g，剛果紅0.4 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，pH 6.0.

（3）PDA 培養(yǎng)基

馬鈴薯100 g，瓊脂5-10 g，蒸餾水500 mL，葡萄糖10 g，自然pH蒸煮30 min后用3層紗布過濾取其汁液.

（4）DNS試劑的配制

將18.2 g 酒石酸鉀鈉，溶于50 mL 蒸餾水中，加熱后再依次加入3，5-二硝基水楊酸0.63 g，NaOH 2.1 g，苯酚0.5 g，攪拌至溶解，冷卻后用蒸餾水定容至100 mL，貯于棕色瓶中，室溫保存.

1.3 實驗方法

1.3.1 菌株的篩選

實驗采用濃度梯度稀釋平板法來篩選上述菌株.分別取上述10 g樣品土壤置于燒杯中，加入90 mL蒸餾水制成樣品溶液.充分混勻后，取出1 mL樣品上層溶液加入另一支事先加入9 mL蒸餾水的試管中，以此類推稀釋樣品溶液105倍.然后取稀釋105倍的樣品溶液100 μL分別涂布于各種篩選培養(yǎng)基上，用涂布棒涂布均勻，每個樣品涂布3-5個平板.30 ℃恒溫箱中培養(yǎng)2 h后，待平板上菌液被培養(yǎng)基吸收后，將平板倒置并繼續(xù)培養(yǎng)3-4 d.

1.3.2 混合菌的還原糖產(chǎn)量測定

通過顯微鏡計數(shù)板，將上述3種菌體分別制成5×107個/ mL的孢子懸浮液，裝液量為20%，每瓶基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)液加入孢子懸浮液各1 mL，在30 ℃、180 r/min的轉(zhuǎn)速下?lián)u床培養(yǎng).本實驗設(shè)對照并做3次重復(fù)試驗取平均值測其所含還原糖量，并通過正交實驗，測出3種降解糖類的菌株及蛋白胨和MgSO4·7H2O對產(chǎn)還原糖量的影響，從而對降解小麥秸稈的能力做出相關(guān)分析.

利用DNS方法測定酶活力，首先取1 mL發(fā)酵液加入到1.5 mL的離心管中，在4℃、6 500 r/min條件下離心15 min，然后取其上清液作為粗酶液.另取一支20 mL 的試管，依次加入0.5 mL 的粗酶液、0.5 mL1%的木聚糖標(biāo)準(zhǔn)溶液、DNS溶液2 mL，放在50 ℃恒溫水浴鍋內(nèi)反應(yīng)30 min，冷卻，用pH7.6的緩沖溶液定容至20 mL，并測其在540 nm 波長的吸光值.另外取一支20 mL 的試管加入1 mL 發(fā)酵液、0.5 mL1%的木聚糖標(biāo)準(zhǔn)溶液、DNS溶液2 mL，放在50 ℃恒溫水浴鍋內(nèi)反應(yīng)30 min，冷卻，用pH7.6的緩沖溶液定容至20 mL作為對照.

2 結(jié)果

2.1 纖維素降解菌的篩選

通過上述實驗方法，最終分離出一株能夠降解纖維素的菌株，命名為“wl-x”.其單菌落形態(tài)呈圓形，菌落直徑約20 mm，邊緣平整有白色菌絲，表面粗糙，布滿一層孢子，菌落背面為青色.在400倍光學(xué)顯微鏡下觀察，可以看到：其菌絲有隔膜，分生孢子梗光滑，多呈橢圓形或球形，不對稱分枝，排列緊密，呈掃帚狀，其頂端著生5-10個短小瓶狀小梗，呈不分枝的鏈狀，初步鑒定為青霉屬（Penicilliumsp.）.

圖1 wl-x在剛果紅培養(yǎng)基上48 h和72 h菌落形態(tài)Figure 1 The colony morphology of wl-y in Congo red medium for 48 h and 72 h

2.2 木聚糖降解菌的篩選

從樣品中篩選出一株能夠分解木聚糖的菌株，并命名為“wl-y”，菌株在木聚糖培養(yǎng)基上生長48 h后，其透明圈半徑達(dá)到8 mm.將其在PDA培養(yǎng)基上生長72 h后觀察，菌落直徑可達(dá)到2 cm，邊緣呈白色，中間呈淡黃色，光學(xué)顯微鏡下發(fā)現(xiàn)其菌絲的末端形成球狀膨脹，且具有分生孢子，初步鑒定菌株“wl-y”為曲霉屬的一株（Aspergillussp.）.

圖2 wl-y在剛果紅培養(yǎng)基上48 h菌落形態(tài)Figure 2 The colony morphology of wl-y in Congo red medium for 48 h

表1 L16（45）正交Table 1 Orthogonal table for L16（45）

表2 正交試驗結(jié)果Table 2 The result of orthogonal test

表3 均值響應(yīng)Table3：The mean response meter

2.3 木質(zhì)素降解菌

本次試驗所用的黃孢原平毛革菌，是一種降解能力很強(qiáng)的白腐真菌，其編號為：CICC40719，來自本微生物實驗室.它屬于非褶菌目、伏革科、顯革菌屬.菌絲體為多核，一孢內(nèi)隨機(jī)分布多達(dá)15個細(xì)胞核，菌絲一般無隔膜，也無鎖狀聯(lián)合；分生孢子為異核體，擔(dān)孢子是同核體且交配系統(tǒng)有同宗配合和異宗配合兩種形式.在自然界中，它們侵入木質(zhì)細(xì)胞腔內(nèi)，釋放降解木質(zhì)素和其它木質(zhì)組分（纖維素、半纖維素、果膠質(zhì)）的酶，導(dǎo)致木質(zhì)腐爛成白色海綿狀團(tuán)塊，黃孢原平毛革菌亦具有降解木聚糖的能力.

將黃孢原平革菌接種于PDA培養(yǎng)基上，30 ℃恒溫培養(yǎng)48 h后觀察菌落生長情況：黃孢原毛平革菌的孢子會長滿整個平板，呈乳白色.菌落之間連成一片平鋪整個平板，沒有一點一點空隙.實驗證明黃孢原毛平革菌在30 ℃恒溫培養(yǎng)時菌落生長情況最好，溫度過高或過低都會阻礙此菌的生長.

2.4 混合發(fā)酵小麥秸稈產(chǎn)還原糖研究

為了更深一步研究蛋白胨量和Mg2+濃度量對還原糖產(chǎn)量的影響，同時研究這三種菌接種量不一樣時對還原糖產(chǎn)量的影響，以wl-x 接種量、wl-y 接種量、CICC40719接種量、蛋白胨量和Mg2+濃度5個因素做L16（45）正交試驗.3次試驗，并用Minitab 15.1軟件對結(jié)果進(jìn)行分析（見表1，表2和表3）.

以上表格及正交試驗數(shù)據(jù)經(jīng)軟件分析得出：（A）wl-x、（B）wl-y、（C）CICC40719的接種量、（D）蛋白胨添加量、（E）MgSO4·7H2O的加入量對混合菌產(chǎn)還原糖量的影響大小順序為：B＞A＞C＞E＞D.即實驗中所篩選出的木聚糖降解菌“wl-y”在還原小麥秸稈時發(fā)揮主要作用，其次是分離出的纖維素降解菌和黃孢原平毛革菌.由于小麥秸稈的組成部分主要由纖維素、木聚糖（半纖維素）和木質(zhì)素構(gòu)成，而以上3種菌恰好為降解這3種糖類的菌株，所以在產(chǎn)還原糖量的實驗中得到充分的證明，從而也驗證實驗的準(zhǔn)確性.

因素、水平最佳組合為：A2、B1、C2、D4、E3.綜合以上結(jié)果：產(chǎn)還原糖量最高時，50 mL基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)加入wl-x和CICC40719菌株孢子懸浮液各1 mL，加入wl-y菌株孢子懸浮液0.5 mL，加入蛋白胨0.15 g、MgSO4·7H2O 0.06 g時效果最佳.

3 小結(jié)與討論

本文以小麥秸稈的結(jié)構(gòu)出發(fā)，從周圍自然界中篩選可以降解纖維素、木聚糖（半纖維素）和木質(zhì)素的菌種，并將其混合培養(yǎng)研究對秸稈降解的能力.實驗從對產(chǎn)還原糖量多少的角度進(jìn)行比較，得出實驗中的三種菌株及蛋白胨添加量與MgSO4·7H2O對小麥降解能力的影響.通過實驗，本文從土壤等樣品中成功篩選出一株青霉“wl-x”和一株曲霉“wl-y”.“wl-x”具有降解纖維素的能力，在PDA培養(yǎng)基上生長48 h后觀察，菌落形態(tài)呈圓形，菌落直徑約20 mm，邊緣平整有白色菌絲，表面粗糙，布滿一層孢子，菌落背面為青色.而另一株“wl-y”具有降解木聚糖的能力，“wl-y”在PDA 培養(yǎng)基上生長72 h時，菌落直徑可達(dá)到2 cm，邊緣呈白色，中間呈淡黃色，光學(xué)顯微鏡下觀察其菌絲的末端形成球狀膨脹，具分生孢子.通過實驗進(jìn)一步驗證這兩種菌株分別為青霉屬（Penicilliumsp.）和曲霉屬（Aspergillussp.）.為了獲得高效降解小麥秸稈的混合菌群、解決秸稈類固廢污染和秸稈資源有效利用的問題，通過用“wl-x”、“wl-y”和“CICC40719”3種菌做混合發(fā)酵產(chǎn)還原糖實驗，并根據(jù)有關(guān)表格及正交試驗數(shù)據(jù)和相關(guān)軟件分析得出結(jié)果，表明其影響大小順序為：“wl-y”接種量＞“wl-x”接種量＞“CICC40719”接種量＞Mg2+濃度＞蛋白胨加入量.從其各自對小麥秸稈降解的影響來看，小麥的主要成分為纖維素、木聚糖（半纖維素）和木質(zhì)素構(gòu)成，而能夠降解這三類糖類的菌株恰好為實驗分離出的兩類菌株和實驗室保存的能夠降解木質(zhì)素的菌株，充分驗證實驗的結(jié)果與主要降解小麥秸稈因素的一致性.

目前國內(nèi)對秸稈降解菌的研究工作多集中在從自然界中篩選合適的菌種.對菌種進(jìn)行鑒定及酶活力研究，然后研究秸稈發(fā)酵產(chǎn)乙醇，借以達(dá)到緩解能源危機(jī)的現(xiàn)狀.而本文著手于工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)現(xiàn)狀，致力于將秸稈發(fā)酵產(chǎn)還原糖的研究，彌補(bǔ)國內(nèi)這方面的研究不足，發(fā)酵秸稈采用的是混合菌種，這也為混合菌種降解秸稈技術(shù)提供參考.

［1］中央農(nóng)業(yè)廣播電視學(xué)校.農(nóng)作物秸稈綜合利用技術(shù)［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2007.

［2］武崢，張迎君，周心智.降解秸稈的纖維素酶產(chǎn)生菌的篩選及產(chǎn)酶條件研究［J］.纖維素科學(xué)與技術(shù)，2009，17（2）：20-26.

［3］MICHELE M，MARIA LT，POLIZELI M，et al.Xylanase and ?-xylosidase production by aspergillus ochraceus：new per?spective for the application of wheat straw autohydrosisliquor［J］.Appl Biochem Biotechnol，2012，166：336-347.

［4］劉鵬，姜紅霞，鮑正宗，等.一株纖維素降解菌的鑒定及產(chǎn)酶活力測定［J］.蠶業(yè)科學(xué)，2014，40（1）：97-102.

［5］陶樹興，郭賢，梁健，等.纖維素降解固氮芽孢桿菌的篩選和鑒定［J］.陜西師范大學(xué)學(xué)報，2014，42（1）：65-69.

［6］向殿軍，滿麗莉，張春鳳，等.玉米秸稈纖維素降解菌的分離及發(fā)酵條件優(yōu)化［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué) 2014，42（4）：1159-1161.

［7］SANDERSON K.U S biofuels：A field in ferment［J］.Nature，2006（444）：673-676.