陳 蕾， 熊紅珍， 鄒 川

(1.廣東省口腔醫(yī)院牙體牙髓科，廣東 廣州 510280;2.廣東省中醫(yī)院腎內(nèi)科，廣東 廣州 510120)

糞腸球菌(Enterococcus faecalis)為革蘭陽性兼性厭氧菌，屬于人體的正常菌群，是頑固性或繼發(fā)性根管內(nèi)感染的主要致病菌.在營養(yǎng)物質(zhì)缺乏、高堿性的惡劣環(huán)境中能長期生存，并形成再感染，該菌在根管治療失敗的過程中扮演著十分重要的角色［1］.此外，糞腸球菌對磺胺類、頭孢菌素低水平的氨基糖苷類等藥物具有天然的耐藥性，而且對于人們使用的抗生素，可通過接受外來耐藥基因質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座子，或通過基因突變來獲得耐藥性［2］.目前，根管治療中常規(guī)的機(jī)械預(yù)備和沖洗消毒方法并不能完全清除已定植于根管中的糞腸球菌.本課題小組前期研究發(fā)現(xiàn)，中藥復(fù)方提取液:黃芩、大黃、五倍子、蛇床子對難治性慢性根尖周炎的優(yōu)勢菌群有良好的抗菌效果［3］.本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討上述中藥復(fù)方以及4種單味藥對糞腸球菌超微結(jié)構(gòu)的影響.

1 材料和方法

1.1 材料

菌種準(zhǔn)備和細(xì)菌培養(yǎng)將由中山大學(xué)光華口腔醫(yī)學(xué)院微生物室提供糞腸球菌ATCC 29212，接種于腦心浸液 (brian heart infusion，BHI)培養(yǎng)基，37℃復(fù)蘇培養(yǎng)48 h.培養(yǎng)至血平板上可劃出單個菌落時，用接種環(huán)挑取1個典型菌落，在載玻片上涂片、烘干，采用革蘭氏染色法對細(xì)菌涂片進(jìn)行染色，顯微鏡下觀察細(xì)菌的形態(tài)和結(jié)構(gòu)特征.經(jīng)純化鑒定后［4］，采用麥?zhǔn)媳葷岱ㄓ昧姿猁}緩沖液pH=7.2配成細(xì)菌混懸液(1.0×109CFU/mL).

1.2 方法

(1)中藥復(fù)方提取液的配制 各取200 g原藥材:黃芩、大黃、五倍子、蛇床子，除去蟲垢及雜質(zhì)，沖洗清潔、干燥，粉碎后過28目篩，稱取50 g，加無離子水100 mL，室溫下浸泡24 h，過濾離心，取上清液，共兩次.上清液進(jìn)行濃縮并冷凍干燥，所得干粉視為藥材水提取物純品.黃芩、大黃、五倍子、蛇床子4種中藥干粉分別制成質(zhì)量濃度為0.2 g/mL水提液，并按1∶1∶1∶1 配制成質(zhì)量濃度為 0.2 g/mL 中藥復(fù)方提取液.

(2)菌株準(zhǔn)備和操作步驟 菌株復(fù)蘇培養(yǎng)并活化鑒定后使用4℃生理鹽水對細(xì)胞進(jìn)行離心漂洗1～2次，800～1 500 r/min離心5 min;將洗滌干凈的菌株，用生理鹽水制備1.0×109CFU/mL細(xì)菌懸液，分裝6個試管，每管細(xì)菌10 mL，1 500 r/min離心5 min，棄去上清液;實(shí)驗(yàn)管細(xì)菌沉淀中分別加入質(zhì)量濃度為0.2 g/mL中藥復(fù)方、黃芩、大黃、五倍子和蛇床子提取液各10 mL，陰性對照管細(xì)菌沉淀中加生理鹽水10 mL;搖開沉物混勻，37℃下處理15 min;在藥物處理和對照組菌液中分別加入少量血清，1 500 r/min離心5 min，使細(xì)菌黏結(jié)，棄去上清液.

用4℃生理鹽水對細(xì)胞進(jìn)行離心漂洗1～2次，800 ～1 500 r/min離心 5 min;使用1 500 μL Eppendorf(EP)管將漂洗好的細(xì)胞在1 500～2 000 r/min離心10 min，成肉眼可見的約0.5～1 mm高細(xì)胞團(tuán)塊，切勿超出1.5 mm，貼壁加入500 μL 4℃ 體積分?jǐn)?shù)為2.5%戊二醛，避免震蕩;于4℃冰箱靜置3 d.

(3)超薄切片制備過程 清洗:PBS緩沖液漂洗5次，每次15 min.固定:體積分?jǐn)?shù)為1%鋨酸4°C 1 h.清洗:PBS緩沖液沖洗3次，每次15 min.脫水:棄溶液，分別加入體積分?jǐn)?shù)為30%、50%、70%、90%丙酮15 min，搖動EP管，使容器周壁及上蓋均接觸到丙酮;棄溶液，加入體積分?jǐn)?shù)為100%丙酮脫水3次，每次15 min，搖動玻璃瓶或EP管，使容器四周及上蓋均接觸到丙酮.浸漬:棄溶液，加入V樹脂∶V丙酮=1∶1，靜置2 h;棄溶液，加入 V樹脂∶V丙酮=2∶1，靜置4 h;棄溶液，加入樹脂過夜;包埋:將的樹脂和標(biāo)本轉(zhuǎn)移到相應(yīng)包埋板中，加入標(biāo)簽，待標(biāo)本下沉至包埋板底部，放入烤箱;聚合60℃聚合，72 h;超薄切片(60～70)nm;空氣干燥過夜;染色:醋酸雙氧鈾20 min，水洗3次，每次5 min;檸檬酸鉛10 min，水洗3次，每次5 min;空氣干燥4 h以上.

(4)透射電鏡觀察 采用Hitach 7500型透射電鏡觀察糞腸球菌在中藥處理后超微結(jié)構(gòu)基本病理變化.

2 結(jié)果

2.1 糞腸球菌純化培養(yǎng)

糞腸球菌進(jìn)行復(fù)蘇、純培養(yǎng)后，在瓊脂平皿上呈現(xiàn)乳脂狀的白色或灰白色菌落，邊緣整齊，凸起、不透明、有光澤、表面光滑，直徑(1.0 ～2.0)mm，表現(xiàn)為α或β性溶血.經(jīng)菌落形態(tài)、菌體革蘭氏染色及生化反應(yīng)鑒定，結(jié)果均符合糞腸球菌手冊鑒定特性，即呈圓形或橢圓形革蘭陽性球菌，直徑(0.5～1.0)μm，大多數(shù)成對或短鏈狀排列，菌體周圍無鞭毛和芽孢，無運(yùn)動特性，觸酶陰性，發(fā)酵乳糖，不發(fā)酵阿拉伯糖.

2.2 中藥復(fù)方提取液和單味藥對糞腸球菌超微結(jié)構(gòu)的影響

黃芩組:胞壁較完整，胞漿稍微變性，胞漿內(nèi)容物聚集成深黑色團(tuán)塊沉淀，胞內(nèi)出現(xiàn)空泡較小，沒有或少量細(xì)胞內(nèi)容物外排(圖1).

大黃組:大部分胞壁不完整，破裂呈不連續(xù)狀態(tài)，質(zhì)壁分離嚴(yán)重，胞漿內(nèi)可見大量顆粒樣黑色沉淀(圖2).

五倍子組:胞壁完整，胞漿完整，胞膜表面有短小突起，核漿比大，細(xì)胞器少，出現(xiàn)較小空泡(圖3).

蛇床子組:胞壁變薄，胞漿變性嚴(yán)重，胞漿內(nèi)容物聚集成深黑色團(tuán)塊沉淀，胞內(nèi)出現(xiàn)空泡，有少量細(xì)胞內(nèi)容物外排(圖4).

中藥復(fù)方組:胞壁變薄或消失，細(xì)胞變形，出現(xiàn)裂解或自溶狀態(tài)，核漿消失，大量細(xì)胞內(nèi)容物外排(圖5).

正常對照組:胞壁完整，包漿完整，胞膜表面有短小突起，核漿比大，細(xì)胞器少(圖6).

圖1 黃芩組糞腸球菌的超微結(jié)構(gòu)改變(×80 000)Fig.1 The ultramicrostructure changes of Enterococcus faecalis in Radix Scutellariae group(×80 000)

圖2 大黃組糞腸球菌的超微結(jié)構(gòu)改變(×80 000)Fig.2 The ultramicrostructure changes of Enterococcus faecalis in Radix et Rhizoma Rhei group(×80 000)

圖3 五倍子組糞腸球菌的超微結(jié)構(gòu)改變(×80 000)Fig.3 The ultramicrostructure changes of Enterococcus faecalis in Galla chinensis group(×80 000)

圖4 蛇床子組糞腸球菌的超微結(jié)構(gòu)改變(×80 0000)Fig.4 The ultramicrostructure changes of Enterococcus faecalis in Cnidium monnieri group(×80 000)

圖5 中藥復(fù)方組糞腸球菌的超微結(jié)構(gòu)改變(×80 000)Fig.5 The ultramicrostructure changes of Enterococcus faecalis in Herbal compound group(×80 000)

圖6 正常對照組糞腸球菌的超微結(jié)構(gòu)改變(×80 000)Fig.6 The ultramicrostructure changes of Enterococcus faecalis in Negative control group(×80 000)

3 討論

有研究提示，黃芩、大黃、五倍子、蛇床子對初次牙髓感染的根管中檢出率較高的牙齦卟啉單胞菌抗菌效果明顯［5］.而作為頑固性或繼發(fā)性根管內(nèi)感染的主要致病菌，糞腸球菌可以饑餓狀態(tài)在惡劣的環(huán)境中長期生存，在牙齒根管充填后的頑固性根尖周感染中常被檢出［1］.

黃芩(Radix Scutellariae)對革蘭氏陰性的細(xì)菌如牙齦卟啉單胞菌，有較強(qiáng)的抑殺作用［5］，能使菌體蛋白和酶變性、沉淀，溶解胞漿［6］.但充分發(fā)揮需要藥物穿透菌體細(xì)胞壁.對于細(xì)胞壁較厚的糞腸球菌，黃芩的抑菌效果相對較弱［7］.本研究結(jié)果顯示，透射電鏡下可見經(jīng)黃芩處理后的糞腸球菌大多數(shù)菌體細(xì)胞壁較完整，沒有或少量細(xì)胞內(nèi)容物外排，胞漿輕度變性，個別胞漿內(nèi)出現(xiàn)空泡.可能與黃芩苷等活性物質(zhì)對細(xì)菌壁的結(jié)合作用較低，穿透糞腸球菌細(xì)胞壁的作用有限有關(guān).

中藥大黃(Radix et Rhizoma Rhei)主要成分大黃蒽醌衍生物，對各種細(xì)菌都具有明顯的抑菌作用.掃描電鏡下可見經(jīng)大黃處理后的糞腸球菌大部分胞壁不完整，破裂呈不連續(xù)狀態(tài)，質(zhì)壁分離嚴(yán)重，胞漿內(nèi)可見大量顆粒樣黑色沉淀.根據(jù)本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果，大黃的抗菌特點(diǎn)為:破壞菌體的細(xì)胞壁，增強(qiáng)細(xì)胞通透性，使胞漿蛋白沉淀.與多位學(xué)者的研究結(jié)果基本一致［7-9］，大黃對糞腸球菌具有較強(qiáng)的抑殺作用，其作用機(jī)制可能是大黃素可以破壞細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性，抑制菌體內(nèi)的蛋白質(zhì)合成［10］.

五倍子(Galla chinensis)水提取物通常被認(rèn)為抗菌效果較好且廣泛［11］，通過抑制細(xì)菌產(chǎn)生水不溶性胞外多糖的關(guān)鍵酶—葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的活性［12］，抑制菌斑胞外基質(zhì)生成［13］.本課題小組前期研究也發(fā)現(xiàn)五倍子能沉淀牙齦卟啉單胞菌的胞漿蛋白，使厭氧菌的胞漿出現(xiàn)大量顆粒樣黑色沉淀和較多空泡.但本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，五倍子對糞腸球菌的抗菌效果有限，鏡下見絕大多數(shù)細(xì)胞壁、細(xì)胞漿完整，僅個別胞漿出現(xiàn)較小空泡.這可能與革蘭陽性的糞腸球菌細(xì)胞壁較厚，五倍子滲透能力相對較弱［14］，鞣質(zhì)難以進(jìn)入胞漿發(fā)揮其收斂作用.

經(jīng)蛇床子(Cnidium monnieri)處理后的糞腸球菌胞壁變薄，胞漿變性嚴(yán)重，胞漿內(nèi)容物聚集成深黑色團(tuán)塊沉淀，胞內(nèi)出現(xiàn)空泡，有少量細(xì)胞內(nèi)容物外排.此外，蛇床子對水不溶性葡聚糖合成抑制超過40%，能減少細(xì)菌生物膜胞外基質(zhì)的產(chǎn)生［15］.

本研究結(jié)果顯示:中藥復(fù)方組糞腸球菌的細(xì)胞壁失去原有結(jié)構(gòu)而明顯變薄或消失，細(xì)胞變形，出現(xiàn)裂解或自溶狀態(tài)，核漿消失，大量細(xì)胞內(nèi)容物外排.提示中藥復(fù)方抗糞腸球菌的生物學(xué)作用較單味藥更顯著，作用于菌體細(xì)胞的機(jī)制可能為:大黃、蛇床子可以破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，干擾細(xì)菌胞膜物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、阻礙能量轉(zhuǎn)換和信息傳遞;從而有利于黃芩、五倍子進(jìn)入菌體內(nèi)，發(fā)揮進(jìn)一步的抗菌活性，如使蛋白和酶變性或沉淀，溶解胞漿;抑制胞外基質(zhì)的生物合成等.

本研究提示，中藥復(fù)方對口腔致病糞腸球菌具有一定的抗菌效果，但其具體作用機(jī)制和量效關(guān)系還不明確，尚有待進(jìn)一步研究.

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