陳云　陳磊　樂(lè)超銀

摘要：采用SSR分子標(biāo)記分析了五峰7個(gè)主栽煙草（Nicotiana tabacum L.）品種。結(jié)果表明，6對(duì)引物共檢測(cè)到22個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，7個(gè)品種的遺傳相似系數(shù)為0.347 8～0.913 0。

關(guān)鍵詞：SSR分子標(biāo)記；煙草（Nicotiana tabacum L.）；馬里蘭煙

中圖分類號(hào)：S572 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2014）06-1440-02

Analysis of SSR Molecular Marker in Maryland Tobacco

CHEN Yun，CHEN Lei，YUE Chao-yin

（Three Gorges University Biotechnology Research Center，Yichang 443002，Hubei，China）

Abstract： 7 tobacco cultivars were analyzed by SSR molecular marker. The results showed that the 6 primer pairs amplified a total of 22 polymorphic alleles. The genetic similarity （GS） of 7 tobacco cultivars was ranged from 0.347 8～0.913 0.

Key words： SSR molecular marker； Nicotiana tabacum L.； Maryland tobacco

煙草（Nicotiana tabacum L.）是世界性的經(jīng)濟(jì)作物，也是湖北省宜昌市五峰縣的重要經(jīng)濟(jì)作物之一。煙草育種面臨著遺傳背景狹窄等問(wèn)題，種質(zhì)資源多樣性是選育優(yōu)良煙草品種的基礎(chǔ)，傳統(tǒng)的種質(zhì)資源鑒定方法有形態(tài)鑒定、蛋白質(zhì)及同工酶鑒定等[1]，但這些方法操作復(fù)雜，常用的分子標(biāo)記技術(shù)有RFLP、RAPD、AFLP、ISSR、SSR等[2-4]，其中SSR分子標(biāo)記具有多態(tài)性高、共顯性遺傳、多等位基因、信息量高等優(yōu)點(diǎn)[5]。本研究利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)，鑒定了湖北省宜昌市五峰縣的6份馬里蘭煙及1份烤煙的種質(zhì)資源，為充分利用馬里蘭煙種質(zhì)資源提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

以湖北省宜昌市五峰縣的7個(gè)煙草品種為材料，包括五峰1號(hào)、五峰2號(hào)、Md01、Md02、Md30、Md40和NC89，其中NC89為烤煙。煙草種子由湖北省宜昌市煙草局提供。

1.2 DNA的提取

供試材料溫室育苗，當(dāng)幼苗長(zhǎng)至5～6片葉時(shí)，取0.1 g葉片，用無(wú)菌水洗去葉表面的蟲(chóng)子，然后用液氮充分研磨。采用改良的CTAB法提取煙草的基因組DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 SSR分析

試驗(yàn)所用SSR引物序列參考文獻(xiàn)[3-5]中的引物。PCR擴(kuò)增總體積20 μL，包括10×PCR緩沖液2 μL， dNTPs 0.4 μL，Taq 酶 0.2 μL，上、下游引物各0.6 μL，基因組DNA 2.0 μL，ddH2O補(bǔ)至20 μL。PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，52 ℃退火 45 s，72 ℃延伸50 s，33個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，最后4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物先以1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物有無(wú)，再以6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，以1×TBE作緩沖液180 V恒壓進(jìn)行電泳，電泳時(shí)間75 min后進(jìn)行銀染，并拍照記錄。

1.4 數(shù)據(jù)分析

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物按同一位置上條帶在各個(gè)材料中的有清晰圖譜且可重復(fù)出現(xiàn)的記為“1”，同一位置上無(wú)條帶的記為“0”。應(yīng)用軟件NTsys Version 2.10，以共有DNA片段比例（軟件中參數(shù)為DICE）作為指標(biāo)，計(jì)算供試材料間的相似系數(shù)。采用非加權(quán)類平均法UPGMA（Unweighted Pair-Group Average）進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

通過(guò)對(duì)30對(duì)SSR引物進(jìn)行篩選，選出6對(duì)反應(yīng)穩(wěn)定、多態(tài)性較好的引物，6對(duì)SSR引物共檢測(cè)到22個(gè)多態(tài)位點(diǎn)（圖1），每對(duì)引物3～5個(gè)，其中引物M1檢測(cè)到6個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，PT20372檢測(cè)到4個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，使用這種鑒別能力高的引物能將所有供試品種分開(kāi)。五峰1號(hào)和Md02遺傳相似系數(shù)最大為0.913 0，五峰2號(hào)和NC89的遺傳相似系數(shù)最小為0.347 8，不同品種的馬里蘭煙遺傳相似系數(shù)為0.478 3～0.913 0（表1）。

聚類分析（圖2）顯示五峰1號(hào)和Md02為一組，五峰2號(hào)和Md01為一組，Md30和Md40為一組，NC89為區(qū)別于馬里蘭煙品種的另一類群。

3 小結(jié)與討論

SSR分子標(biāo)記應(yīng)用于煙草種質(zhì)鑒定的起步較晚，Binder等[6]首次公開(kāi)報(bào)道了煙草SSR分子標(biāo)記的研究工作，并建立了第一張微衛(wèi)星連鎖圖。本研究采用SSR分子標(biāo)記技術(shù)分析了7個(gè)煙草品種。結(jié)果發(fā)現(xiàn)6對(duì)引物具有較好多態(tài)性，能將這7個(gè)品種完全區(qū)分開(kāi)，表明將其他品種多態(tài)性好的SSR引物應(yīng)用在構(gòu)建馬里蘭煙遺傳圖譜上是可行的。聚類分析結(jié)果將馬里蘭煙和烤煙劃分為兩大類群，這一點(diǎn)與實(shí)際的種質(zhì)資源相符，也證明了SSR分子標(biāo)記用于煙草類型劃分的可行性。

參考文獻(xiàn)：

[1] LIANG M， LIU Y， ZHOU X， et al. Studies on protein fingerprints for identification of nicotiana varieties[J]. Southwest China Journal of Agricultural Sciences，2000（2）：16.

[2] 羅 冉，吳委林，張 旸，等.SSR 分子標(biāo)記在作物遺傳育種中的應(yīng)用[J]. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2010，29（1）：137-143.

[3] 徐 軍，劉艷華，任 民，等.普通煙草種質(zhì)資源的SSR標(biāo)記與指紋圖譜分析[J].中國(guó)煙草科學(xué)，2011，4（32）：2.

[4] 葉蘭欽，辛明明，杜金昆，等.SSR標(biāo)記應(yīng)用于煙草品種遺傳多樣性研究[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2009，25（1）：56-62.

[5] 王鳳龍，時(shí) 焦，錢玉梅，等.煙草種質(zhì)資源對(duì)黃瓜花葉病毒抗性鑒定研究[J].中國(guó)煙草科學(xué)，2000（3）：1-4.

[6] BINDLER G，HOEVEN V R，GUNDUZ I， et al. A microsatellite marker based linkage map of tobacco[J]. Theo Appl Genet，2007，114（2）：341-349.

摘要：采用SSR分子標(biāo)記分析了五峰7個(gè)主栽煙草（Nicotiana tabacum L.）品種。結(jié)果表明，6對(duì)引物共檢測(cè)到22個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，7個(gè)品種的遺傳相似系數(shù)為0.347 8～0.913 0。

關(guān)鍵詞：SSR分子標(biāo)記；煙草（Nicotiana tabacum L.）；馬里蘭煙

中圖分類號(hào)：S572 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2014）06-1440-02

Analysis of SSR Molecular Marker in Maryland Tobacco

CHEN Yun，CHEN Lei，YUE Chao-yin

（Three Gorges University Biotechnology Research Center，Yichang 443002，Hubei，China）

Abstract： 7 tobacco cultivars were analyzed by SSR molecular marker. The results showed that the 6 primer pairs amplified a total of 22 polymorphic alleles. The genetic similarity （GS） of 7 tobacco cultivars was ranged from 0.347 8～0.913 0.

Key words： SSR molecular marker； Nicotiana tabacum L.； Maryland tobacco

煙草（Nicotiana tabacum L.）是世界性的經(jīng)濟(jì)作物，也是湖北省宜昌市五峰縣的重要經(jīng)濟(jì)作物之一。煙草育種面臨著遺傳背景狹窄等問(wèn)題，種質(zhì)資源多樣性是選育優(yōu)良煙草品種的基礎(chǔ)，傳統(tǒng)的種質(zhì)資源鑒定方法有形態(tài)鑒定、蛋白質(zhì)及同工酶鑒定等[1]，但這些方法操作復(fù)雜，常用的分子標(biāo)記技術(shù)有RFLP、RAPD、AFLP、ISSR、SSR等[2-4]，其中SSR分子標(biāo)記具有多態(tài)性高、共顯性遺傳、多等位基因、信息量高等優(yōu)點(diǎn)[5]。本研究利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)，鑒定了湖北省宜昌市五峰縣的6份馬里蘭煙及1份烤煙的種質(zhì)資源，為充分利用馬里蘭煙種質(zhì)資源提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

以湖北省宜昌市五峰縣的7個(gè)煙草品種為材料，包括五峰1號(hào)、五峰2號(hào)、Md01、Md02、Md30、Md40和NC89，其中NC89為烤煙。煙草種子由湖北省宜昌市煙草局提供。

1.2 DNA的提取

供試材料溫室育苗，當(dāng)幼苗長(zhǎng)至5～6片葉時(shí)，取0.1 g葉片，用無(wú)菌水洗去葉表面的蟲(chóng)子，然后用液氮充分研磨。采用改良的CTAB法提取煙草的基因組DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 SSR分析

試驗(yàn)所用SSR引物序列參考文獻(xiàn)[3-5]中的引物。PCR擴(kuò)增總體積20 μL，包括10×PCR緩沖液2 μL， dNTPs 0.4 μL，Taq 酶 0.2 μL，上、下游引物各0.6 μL，基因組DNA 2.0 μL，ddH2O補(bǔ)至20 μL。PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，52 ℃退火 45 s，72 ℃延伸50 s，33個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，最后4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物先以1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物有無(wú)，再以6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，以1×TBE作緩沖液180 V恒壓進(jìn)行電泳，電泳時(shí)間75 min后進(jìn)行銀染，并拍照記錄。

1.4 數(shù)據(jù)分析

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物按同一位置上條帶在各個(gè)材料中的有清晰圖譜且可重復(fù)出現(xiàn)的記為“1”，同一位置上無(wú)條帶的記為“0”。應(yīng)用軟件NTsys Version 2.10，以共有DNA片段比例（軟件中參數(shù)為DICE）作為指標(biāo)，計(jì)算供試材料間的相似系數(shù)。采用非加權(quán)類平均法UPGMA（Unweighted Pair-Group Average）進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

通過(guò)對(duì)30對(duì)SSR引物進(jìn)行篩選，選出6對(duì)反應(yīng)穩(wěn)定、多態(tài)性較好的引物，6對(duì)SSR引物共檢測(cè)到22個(gè)多態(tài)位點(diǎn)（圖1），每對(duì)引物3～5個(gè)，其中引物M1檢測(cè)到6個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，PT20372檢測(cè)到4個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，使用這種鑒別能力高的引物能將所有供試品種分開(kāi)。五峰1號(hào)和Md02遺傳相似系數(shù)最大為0.913 0，五峰2號(hào)和NC89的遺傳相似系數(shù)最小為0.347 8，不同品種的馬里蘭煙遺傳相似系數(shù)為0.478 3～0.913 0（表1）。

聚類分析（圖2）顯示五峰1號(hào)和Md02為一組，五峰2號(hào)和Md01為一組，Md30和Md40為一組，NC89為區(qū)別于馬里蘭煙品種的另一類群。

3 小結(jié)與討論

SSR分子標(biāo)記應(yīng)用于煙草種質(zhì)鑒定的起步較晚，Binder等[6]首次公開(kāi)報(bào)道了煙草SSR分子標(biāo)記的研究工作，并建立了第一張微衛(wèi)星連鎖圖。本研究采用SSR分子標(biāo)記技術(shù)分析了7個(gè)煙草品種。結(jié)果發(fā)現(xiàn)6對(duì)引物具有較好多態(tài)性，能將這7個(gè)品種完全區(qū)分開(kāi)，表明將其他品種多態(tài)性好的SSR引物應(yīng)用在構(gòu)建馬里蘭煙遺傳圖譜上是可行的。聚類分析結(jié)果將馬里蘭煙和烤煙劃分為兩大類群，這一點(diǎn)與實(shí)際的種質(zhì)資源相符，也證明了SSR分子標(biāo)記用于煙草類型劃分的可行性。

參考文獻(xiàn)：

[1] LIANG M， LIU Y， ZHOU X， et al. Studies on protein fingerprints for identification of nicotiana varieties[J]. Southwest China Journal of Agricultural Sciences，2000（2）：16.

[2] 羅 冉，吳委林，張 旸，等.SSR 分子標(biāo)記在作物遺傳育種中的應(yīng)用[J]. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2010，29（1）：137-143.

[3] 徐 軍，劉艷華，任 民，等.普通煙草種質(zhì)資源的SSR標(biāo)記與指紋圖譜分析[J].中國(guó)煙草科學(xué)，2011，4（32）：2.

[4] 葉蘭欽，辛明明，杜金昆，等.SSR標(biāo)記應(yīng)用于煙草品種遺傳多樣性研究[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2009，25（1）：56-62.

[5] 王鳳龍，時(shí) 焦，錢玉梅，等.煙草種質(zhì)資源對(duì)黃瓜花葉病毒抗性鑒定研究[J].中國(guó)煙草科學(xué)，2000（3）：1-4.

[6] BINDLER G，HOEVEN V R，GUNDUZ I， et al. A microsatellite marker based linkage map of tobacco[J]. Theo Appl Genet，2007，114（2）：341-349.

摘要：采用SSR分子標(biāo)記分析了五峰7個(gè)主栽煙草（Nicotiana tabacum L.）品種。結(jié)果表明，6對(duì)引物共檢測(cè)到22個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，7個(gè)品種的遺傳相似系數(shù)為0.347 8～0.913 0。

關(guān)鍵詞：SSR分子標(biāo)記；煙草（Nicotiana tabacum L.）；馬里蘭煙

中圖分類號(hào)：S572 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2014）06-1440-02

Analysis of SSR Molecular Marker in Maryland Tobacco

CHEN Yun，CHEN Lei，YUE Chao-yin

（Three Gorges University Biotechnology Research Center，Yichang 443002，Hubei，China）

Abstract： 7 tobacco cultivars were analyzed by SSR molecular marker. The results showed that the 6 primer pairs amplified a total of 22 polymorphic alleles. The genetic similarity （GS） of 7 tobacco cultivars was ranged from 0.347 8～0.913 0.

Key words： SSR molecular marker； Nicotiana tabacum L.； Maryland tobacco

煙草（Nicotiana tabacum L.）是世界性的經(jīng)濟(jì)作物，也是湖北省宜昌市五峰縣的重要經(jīng)濟(jì)作物之一。煙草育種面臨著遺傳背景狹窄等問(wèn)題，種質(zhì)資源多樣性是選育優(yōu)良煙草品種的基礎(chǔ)，傳統(tǒng)的種質(zhì)資源鑒定方法有形態(tài)鑒定、蛋白質(zhì)及同工酶鑒定等[1]，但這些方法操作復(fù)雜，常用的分子標(biāo)記技術(shù)有RFLP、RAPD、AFLP、ISSR、SSR等[2-4]，其中SSR分子標(biāo)記具有多態(tài)性高、共顯性遺傳、多等位基因、信息量高等優(yōu)點(diǎn)[5]。本研究利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)，鑒定了湖北省宜昌市五峰縣的6份馬里蘭煙及1份烤煙的種質(zhì)資源，為充分利用馬里蘭煙種質(zhì)資源提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

以湖北省宜昌市五峰縣的7個(gè)煙草品種為材料，包括五峰1號(hào)、五峰2號(hào)、Md01、Md02、Md30、Md40和NC89，其中NC89為烤煙。煙草種子由湖北省宜昌市煙草局提供。

1.2 DNA的提取

供試材料溫室育苗，當(dāng)幼苗長(zhǎng)至5～6片葉時(shí)，取0.1 g葉片，用無(wú)菌水洗去葉表面的蟲(chóng)子，然后用液氮充分研磨。采用改良的CTAB法提取煙草的基因組DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 SSR分析

試驗(yàn)所用SSR引物序列參考文獻(xiàn)[3-5]中的引物。PCR擴(kuò)增總體積20 μL，包括10×PCR緩沖液2 μL， dNTPs 0.4 μL，Taq 酶 0.2 μL，上、下游引物各0.6 μL，基因組DNA 2.0 μL，ddH2O補(bǔ)至20 μL。PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，52 ℃退火 45 s，72 ℃延伸50 s，33個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，最后4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物先以1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物有無(wú)，再以6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，以1×TBE作緩沖液180 V恒壓進(jìn)行電泳，電泳時(shí)間75 min后進(jìn)行銀染，并拍照記錄。

1.4 數(shù)據(jù)分析

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物按同一位置上條帶在各個(gè)材料中的有清晰圖譜且可重復(fù)出現(xiàn)的記為“1”，同一位置上無(wú)條帶的記為“0”。應(yīng)用軟件NTsys Version 2.10，以共有DNA片段比例（軟件中參數(shù)為DICE）作為指標(biāo)，計(jì)算供試材料間的相似系數(shù)。采用非加權(quán)類平均法UPGMA（Unweighted Pair-Group Average）進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

通過(guò)對(duì)30對(duì)SSR引物進(jìn)行篩選，選出6對(duì)反應(yīng)穩(wěn)定、多態(tài)性較好的引物，6對(duì)SSR引物共檢測(cè)到22個(gè)多態(tài)位點(diǎn)（圖1），每對(duì)引物3～5個(gè)，其中引物M1檢測(cè)到6個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，PT20372檢測(cè)到4個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，使用這種鑒別能力高的引物能將所有供試品種分開(kāi)。五峰1號(hào)和Md02遺傳相似系數(shù)最大為0.913 0，五峰2號(hào)和NC89的遺傳相似系數(shù)最小為0.347 8，不同品種的馬里蘭煙遺傳相似系數(shù)為0.478 3～0.913 0（表1）。

聚類分析（圖2）顯示五峰1號(hào)和Md02為一組，五峰2號(hào)和Md01為一組，Md30和Md40為一組，NC89為區(qū)別于馬里蘭煙品種的另一類群。

3 小結(jié)與討論

SSR分子標(biāo)記應(yīng)用于煙草種質(zhì)鑒定的起步較晚，Binder等[6]首次公開(kāi)報(bào)道了煙草SSR分子標(biāo)記的研究工作，并建立了第一張微衛(wèi)星連鎖圖。本研究采用SSR分子標(biāo)記技術(shù)分析了7個(gè)煙草品種。結(jié)果發(fā)現(xiàn)6對(duì)引物具有較好多態(tài)性，能將這7個(gè)品種完全區(qū)分開(kāi)，表明將其他品種多態(tài)性好的SSR引物應(yīng)用在構(gòu)建馬里蘭煙遺傳圖譜上是可行的。聚類分析結(jié)果將馬里蘭煙和烤煙劃分為兩大類群，這一點(diǎn)與實(shí)際的種質(zhì)資源相符，也證明了SSR分子標(biāo)記用于煙草類型劃分的可行性。

參考文獻(xiàn)：

[1] LIANG M， LIU Y， ZHOU X， et al. Studies on protein fingerprints for identification of nicotiana varieties[J]. Southwest China Journal of Agricultural Sciences，2000（2）：16.

[2] 羅 冉，吳委林，張 旸，等.SSR 分子標(biāo)記在作物遺傳育種中的應(yīng)用[J]. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2010，29（1）：137-143.

[3] 徐 軍，劉艷華，任 民，等.普通煙草種質(zhì)資源的SSR標(biāo)記與指紋圖譜分析[J].中國(guó)煙草科學(xué)，2011，4（32）：2.

[4] 葉蘭欽，辛明明，杜金昆，等.SSR標(biāo)記應(yīng)用于煙草品種遺傳多樣性研究[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2009，25（1）：56-62.

[5] 王鳳龍，時(shí) 焦，錢玉梅，等.煙草種質(zhì)資源對(duì)黃瓜花葉病毒抗性鑒定研究[J].中國(guó)煙草科學(xué)，2000（3）：1-4.

[6] BINDLER G，HOEVEN V R，GUNDUZ I， et al. A microsatellite marker based linkage map of tobacco[J]. Theo Appl Genet，2007，114（2）：341-349.