葉嘉　張浩　張寧

摘要：采集河北省蔚縣小五臺山和平山縣駝梁兩地不同海拔高度黃梅衣屬淡腹黃梅（Xanthoparmellia mexicana），并采用HPLC分析樣品中的松蘿酸含量，同時分析了不同檢測波長對檢測結(jié)果的差異。結(jié)果表明，各海拔高度樣品中的松蘿酸含量差異較大，但海拔高度與樣品中松蘿酸含量變化無相關(guān)性。該結(jié)果可為研究海拔高度對黃梅衣屬地衣松蘿酸含量的影響提供參考。

關(guān)鍵詞：淡腹黃梅（Xanthoparmellia mexicana）；海拔；松蘿酸；高效液相色譜

中圖分類號：Q815 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）06-1415-03

Determination of Usnic Acid in Xanthoparmellia mexicana at Different Altitudes

YE Jia，ZHANG Hao，ZHANG Ning

（Department of Biology Science， Handan College， Handan 056005， Hebei， China）

Abstract： The usnic acid in Xanthoparmellia mexicana at different altitudes from Mountain Xiaowutai and Mountain Tuoliang were compared with HPLC at different altitude. The results showed that the difference of contents of usnic acid in Xanthoparmellia mexicana at different altitudes were significant， with no obvious relationship. It will provide a reference for studying distribution of usnic acid in Xanthoparmellia mexicana at different altitudes.

Key words： Xanthoparmellia mexicana； altitude； usnic acid； HPLC

地衣是真菌和藻類共生體，是地球上最古老的生物之一，其命名是以共生真菌為主。全世界已發(fā)現(xiàn)并記載的地衣超過500屬，26 000多種[1]。地衣的生態(tài)環(huán)境與生長基物多樣，樹木、土壤和巖石等表層均有地衣分布[2]。地衣中的松蘿酸首先被歐洲科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，隨后研究發(fā)現(xiàn)黃梅衣屬地衣也含有松蘿酸[3]。目前，相關(guān)研究多集中于提取測定不同種地衣松蘿酸，制備松蘿酸純品以及分析松蘿酸抗菌性等方面。本試驗通過分析駝梁和小五臺不同海拔分布的淡腹黃梅（Xanthoparmellia mexicana）地衣中松蘿酸含量，為研究海拔高度與黃梅衣屬地衣中的松蘿酸含量的關(guān)系提供參考。

1 材料與方法

1.1 采樣點

駝梁位于石家莊平山縣境內(nèi)，屬太行山中段東麓。地理坐標(biāo)為東經(jīng)113°31′-114°15′、北緯38°09′-38°46′，海拔高度在640～2 281 m，主峰駝梁山海拔2 281 m。駝梁屬暖溫帶半濕潤大陸性季風(fēng)氣候，晝夜溫差較大，降雨量較好，雨熱同期。蔚縣小五臺山位于河北省西北部山地，位于東經(jīng)114°47′-115°30′，北緯39°50′-40°07′，其中主峰東臺海拔2 882 m[4]。小五臺氣候?qū)儆谂瘻貛Т箨懠撅L(fēng)性山地氣候，年平均氣溫7.1 ℃，年降水量400～700 mm[5]。

1.2 材料與試劑

由河北師范大學(xué)生物科學(xué)實驗室和邯鄲學(xué)院生物科學(xué)系提供樣品，樣品信息見表1。

松蘿酸標(biāo)準(zhǔn)品，購于上海源葉生物科技公司。

1.3 儀器

體視顯微鏡Leica EZ4（北京鼎永泰克科技有限公司）；高效液相色譜儀e2695-2489（美國Waters公司）。

1.4 方法

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定 稱取松蘿酸標(biāo)準(zhǔn)品5 mg于10 mL容量瓶中，先用少量三氯甲烷溶解，再用甲醇定容，分別移取0.02～0.05 mL系列體積的母液于10 mL容量瓶中，氯仿定容，得到濃度依次為0.01～0.25 mg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別在254 nm和285 nm下測定上述標(biāo)準(zhǔn)品溶液，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.2 地衣松蘿酸提取液制備 選取地衣標(biāo)本，洗凈，于60 ℃烘4 h，取烘干樣品，研磨得粉末。稱量0.2 g左右樣品，加8 mL氯仿浸泡后，超聲1 h，并以氯仿定容至10 mL，搖勻，10 000 r/min離心60 min，過濾，收集濾液待測。

1.4.3 松蘿酸的測定 液相色譜條件：色譜柱為Symmetry-C18（4.6×250 mm，0.5 μm）；流動相為甲醇∶水∶乙酸=81∶14∶5（體積比），柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL；檢測波長254 nm和285 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定

按上述測定方法分析標(biāo)準(zhǔn)品溶液，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，分別在254 nm和285 nm下分析，得回歸方程y=2.5×107x-77 429，R2=0.999 2；y=4.4×107x-60 932，R2=0.999 5，松蘿酸在0.01～0.25 mg/mL范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系（見圖1，圖2）。

2.2 淡腹黃梅的形態(tài)學(xué)特征

對淡腹黃梅的葉片、粉芽、下表層等幾部分結(jié)構(gòu)，在體視顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。地衣體呈葉狀，圓形或近圓形擴(kuò)展，疏松或較緊密地貼附在基物上；裂片條狀，二叉分裂，寬1～2 mm，裂片緊密相連或瓦覆狀排列；上表面黃綠色，稍具光澤，密布顆粒狀至桿狀裂芽，裂芽高可達(dá)0.8 mm，無粉芽；下表面淡褐色，具同色假根，假根單一，不分枝。不同海拔淡腹黃梅形態(tài)差異不大，僅在1 300 m標(biāo)本中觀察到子囊盤。在地衣顯色反應(yīng)中髓層K+顯色變化時間較短。

2.3 不同海拔高度樣品中松蘿酸的含量分析

在254 nm波長條件下測定平山縣駝梁5個不同海拔樣品中的松蘿酸含量，結(jié)果見表2，由結(jié)果可知，海拔1 500 m樣品中的松蘿酸含量最高，海拔1 750 m樣品中的松蘿酸含量最低，各海拔高度樣品中的松蘿酸含量差異性顯著，但海拔高度與樣品中松蘿酸含量變化未有相關(guān)性。

蔚縣小五臺山淡腹黃梅的松蘿酸含量差異較顯著（表3），海拔1 350 m樣品中的松蘿酸含量最高，海拔1 300 m樣品含量最低。與表2相比，蔚縣小五臺淡腹黃梅松蘿酸含量高于平山縣駝梁含量。

上述結(jié)果表明，在同種地衣之間，海拔與松蘿酸含量無顯著相關(guān)性。但松蘿酸含量在地域中差別較大，蔚縣小五臺山的淡腹黃梅樣品中的松蘿酸含量要高于平山縣駝梁，該結(jié)果與梁瑞霞等[6]研究報道相一致。

由于松蘿酸在254 nm和285 nm下均有吸收，因此，本試驗在其他條件不變的情況下，以285 nm為檢測波長，分析了淡腹黃梅中松蘿酸的含量。結(jié)果見表4、表5。

比較表2和表4，表3和表5可知，相同樣品在不同波長條件下，盡管峰面積存在較大差異，但松蘿酸含量差異不大，表明2種檢測波長對檢測結(jié)果影響不大。

需要指出的是，285 nm波長條件下地衣樣品的色譜圖主峰明顯，基線穩(wěn)定（圖3）。由于松蘿酸含量升高，降低了對雜質(zhì)峰的干擾；且在該波長條件下，松蘿酸的紫外吸收水平高于254 nm，基線也較為平穩(wěn)。

3 討論

在制備樣品溶液時，松蘿酸提取液中的氯仿具有揮發(fā)性，因此可將氯仿?lián)Q成丙酮等低揮發(fā)性溶劑，或增強試驗的連續(xù)性，避免由于提取液中氯仿?lián)]發(fā)導(dǎo)致測定結(jié)果偏高。另外，樣品離心后溶液由于乳化仍呈渾濁狀，將提取液抽濾過0.45 μm有機(jī)濾膜后，可滿足液相色譜分析要求；在液相色譜分析過程中，采用285 nm和254 nm波長測定同一種地衣樣品，發(fā)現(xiàn)285 nm測定波長較好，適用于松蘿酸的檢測。

參考文獻(xiàn)：

[1] 王啟林，房敏峰，胡正海.太白山藥用地衣的種質(zhì)資源及其化學(xué)成分的研究概況[J].中國野生植物資源.2011，30（4）：1-6.

[2] 陳建斌.地衣特殊性、多樣性及其重要性[J].生物多樣性，1995， 3（2）：113-117.

[3] 楊東升，蘇印泉，彭 鋒，等.幾種松蘿中松蘿酸含量及提取物清除DPPH自由基能力測定[J].西北林學(xué)院學(xué)報，2007，22（4）：135-138.

[4] 劉紅霞，谷建才，魯紹偉，等.小五臺森林群落特征及林下物種多樣性研究[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2009，25（4）：97-100.

[5] 黃曉霞，韓京薩，劉全儒，等.小五臺亞高山草甸植物化學(xué)成分研究[J].草業(yè)科學(xué)，2009，26（3）：1-8.

[6] 梁瑞霞，江曉倩，李 穩(wěn)，等.HPLC法測定不同海拔地衣中松蘿酸的含量[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（19）：11458，11479.

2.3 不同海拔高度樣品中松蘿酸的含量分析

在254 nm波長條件下測定平山縣駝梁5個不同海拔樣品中的松蘿酸含量，結(jié)果見表2，由結(jié)果可知，海拔1 500 m樣品中的松蘿酸含量最高，海拔1 750 m樣品中的松蘿酸含量最低，各海拔高度樣品中的松蘿酸含量差異性顯著，但海拔高度與樣品中松蘿酸含量變化未有相關(guān)性。

蔚縣小五臺山淡腹黃梅的松蘿酸含量差異較顯著（表3），海拔1 350 m樣品中的松蘿酸含量最高，海拔1 300 m樣品含量最低。與表2相比，蔚縣小五臺淡腹黃梅松蘿酸含量高于平山縣駝梁含量。

上述結(jié)果表明，在同種地衣之間，海拔與松蘿酸含量無顯著相關(guān)性。但松蘿酸含量在地域中差別較大，蔚縣小五臺山的淡腹黃梅樣品中的松蘿酸含量要高于平山縣駝梁，該結(jié)果與梁瑞霞等[6]研究報道相一致。

由于松蘿酸在254 nm和285 nm下均有吸收，因此，本試驗在其他條件不變的情況下，以285 nm為檢測波長，分析了淡腹黃梅中松蘿酸的含量。結(jié)果見表4、表5。

比較表2和表4，表3和表5可知，相同樣品在不同波長條件下，盡管峰面積存在較大差異，但松蘿酸含量差異不大，表明2種檢測波長對檢測結(jié)果影響不大。

需要指出的是，285 nm波長條件下地衣樣品的色譜圖主峰明顯，基線穩(wěn)定（圖3）。由于松蘿酸含量升高，降低了對雜質(zhì)峰的干擾；且在該波長條件下，松蘿酸的紫外吸收水平高于254 nm，基線也較為平穩(wěn)。

3 討論

在制備樣品溶液時，松蘿酸提取液中的氯仿具有揮發(fā)性，因此可將氯仿?lián)Q成丙酮等低揮發(fā)性溶劑，或增強試驗的連續(xù)性，避免由于提取液中氯仿?lián)]發(fā)導(dǎo)致測定結(jié)果偏高。另外，樣品離心后溶液由于乳化仍呈渾濁狀，將提取液抽濾過0.45 μm有機(jī)濾膜后，可滿足液相色譜分析要求；在液相色譜分析過程中，采用285 nm和254 nm波長測定同一種地衣樣品，發(fā)現(xiàn)285 nm測定波長較好，適用于松蘿酸的檢測。

參考文獻(xiàn)：

[1] 王啟林，房敏峰，胡正海.太白山藥用地衣的種質(zhì)資源及其化學(xué)成分的研究概況[J].中國野生植物資源.2011，30（4）：1-6.

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[6] 梁瑞霞，江曉倩，李 穩(wěn)，等.HPLC法測定不同海拔地衣中松蘿酸的含量[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（19）：11458，11479.

2.3 不同海拔高度樣品中松蘿酸的含量分析

在254 nm波長條件下測定平山縣駝梁5個不同海拔樣品中的松蘿酸含量，結(jié)果見表2，由結(jié)果可知，海拔1 500 m樣品中的松蘿酸含量最高，海拔1 750 m樣品中的松蘿酸含量最低，各海拔高度樣品中的松蘿酸含量差異性顯著，但海拔高度與樣品中松蘿酸含量變化未有相關(guān)性。

蔚縣小五臺山淡腹黃梅的松蘿酸含量差異較顯著（表3），海拔1 350 m樣品中的松蘿酸含量最高，海拔1 300 m樣品含量最低。與表2相比，蔚縣小五臺淡腹黃梅松蘿酸含量高于平山縣駝梁含量。

上述結(jié)果表明，在同種地衣之間，海拔與松蘿酸含量無顯著相關(guān)性。但松蘿酸含量在地域中差別較大，蔚縣小五臺山的淡腹黃梅樣品中的松蘿酸含量要高于平山縣駝梁，該結(jié)果與梁瑞霞等[6]研究報道相一致。

由于松蘿酸在254 nm和285 nm下均有吸收，因此，本試驗在其他條件不變的情況下，以285 nm為檢測波長，分析了淡腹黃梅中松蘿酸的含量。結(jié)果見表4、表5。

比較表2和表4，表3和表5可知，相同樣品在不同波長條件下，盡管峰面積存在較大差異，但松蘿酸含量差異不大，表明2種檢測波長對檢測結(jié)果影響不大。

需要指出的是，285 nm波長條件下地衣樣品的色譜圖主峰明顯，基線穩(wěn)定（圖3）。由于松蘿酸含量升高，降低了對雜質(zhì)峰的干擾；且在該波長條件下，松蘿酸的紫外吸收水平高于254 nm，基線也較為平穩(wěn)。

3 討論

在制備樣品溶液時，松蘿酸提取液中的氯仿具有揮發(fā)性，因此可將氯仿?lián)Q成丙酮等低揮發(fā)性溶劑，或增強試驗的連續(xù)性，避免由于提取液中氯仿?lián)]發(fā)導(dǎo)致測定結(jié)果偏高。另外，樣品離心后溶液由于乳化仍呈渾濁狀，將提取液抽濾過0.45 μm有機(jī)濾膜后，可滿足液相色譜分析要求；在液相色譜分析過程中，采用285 nm和254 nm波長測定同一種地衣樣品，發(fā)現(xiàn)285 nm測定波長較好，適用于松蘿酸的檢測。

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[4] 劉紅霞，谷建才，魯紹偉，等.小五臺森林群落特征及林下物種多樣性研究[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2009，25（4）：97-100.

[5] 黃曉霞，韓京薩，劉全儒，等.小五臺亞高山草甸植物化學(xué)成分研究[J].草業(yè)科學(xué)，2009，26（3）：1-8.

[6] 梁瑞霞，江曉倩，李 穩(wěn)，等.HPLC法測定不同海拔地衣中松蘿酸的含量[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（19）：11458，11479.