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1浙江省奉化市中醫(yī)醫(yī)院 奉化 315500 2浙江省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院

頸椎后縱韌帶骨化癥與BMP-2、BMP-4基因多態(tài)性的關聯(lián)性研究

周 耀1魏 威2陳春悅2葉 楊2

1浙江省奉化市中醫(yī)醫(yī)院 奉化 315500 2浙江省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院

目的探討頸椎后縱韌帶骨化癥（OPLL）與BMP-2基因第3外顯子的rs79417223和BMP-4基因第4外顯子的rs147822607兩個SNP位點的相關性。方法選取47例浙江地區(qū)漢族頸椎后縱韌帶骨化癥患者，以100名正常個體作為對照組，采用PCR+Sanger DNA測序，統(tǒng)計分析2個位點基因型的分布信息。結(jié)果BMP-2基因第3外顯子的rs79417223G→A患者、BMP-4第4外顯子的rs147822607A→C患者與正常組呈現(xiàn)明顯差異（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)論BMP-2基因第3外顯子的rs79417223G→A、BMP-4基因、第4外顯子的rs147822607A→C，這2個多態(tài)性位點與OPLL的發(fā)病具有強烈相關性。

頸椎后縱韌帶骨化癥；單核苷酸多態(tài)性；易感基因；BMP-2基因；BMP-4基因

頸椎后縱韌帶骨化癥（ossification of the posterior longitudinal ligament，OPLL）屬于一種骨成形病，表現(xiàn)為頸椎后縱韌帶內(nèi)異位骨的形成，主要壓迫脊髓產(chǎn)生臨床癥狀以及病理損害。OPLL為一種遺傳因素和環(huán)境因素共同作用所致的復雜疾?。ǘ嗷蚣膊。1-6]，高發(fā)于日本人以及亞洲人。通過檢索國內(nèi)外相關文獻，我們選取2個可疑的OPLL易感基因多態(tài)性SNP位點，BMP-2基因第 3外顯子的 rs79417223和BMP-4基因第4外顯子的rs147822607，進行多態(tài)性分析，以期獲得這2個多態(tài)性位點與浙江地區(qū)漢族OPLL患者發(fā)病之間的關聯(lián)性。

1 資料與方法

1.1臨床資料 2010年7月—2013年9月就診于浙江省奉化市中醫(yī)院、浙江省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院、解放軍一一七醫(yī)院等骨科的漢族OPLL患者47例，男30例，女17例，平均年齡（45.4±11.2）歲，病程0.3～8年，平均（4.1±1.2）年。根據(jù)頸部CT或者MRI明確診斷[7]?；颊呒灳谡憬貐^(qū)。同時，以100名無血緣關系的浙江地區(qū)漢族正常個體作為對照組，男50名，女50名，平均年齡（43.1±7.3）歲。每位參與者均簽署書面知情同意書。

1.2方 法 ①DNA制備：入組者均在無菌環(huán)境下抽取外周血10mL（EDTA抗凝）。用外周血DNA純化試劑盒（德國Qiagen公司）提取和純化基因組DNA。②PCR引物的合成：參考NCBI等人類基因組SNP數(shù)據(jù)庫，用Primer Premier 5.0軟件設計2個基因SNP位點的PCR引物序列。引物由上海生工生物工程公司合成，引物序列見表1。③DNA測序分型對各多態(tài)性SNP位點分別進行PCR擴增，通過Sanger DNA測序進行基因分型。PCR產(chǎn)物的DNA測序委托上海生工生物工程公司進行。根據(jù)基因分型結(jié)果，計算基因型頻率和等位基因頻率。

1.3統(tǒng)計學方法 應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析，采用χ2檢驗，P＜0.05，表示具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2個多態(tài)性SNP位點的基因型分布經(jīng)χ2檢驗，符合Hardy-Weinberg遺傳平衡[8]。BMP-2基因第3外顯子的rs79417223G→A患者與正常組呈現(xiàn)明顯差異（P＜0.05）。BMP-4第4外顯子的rs147822607A→C患者與正常組呈現(xiàn)明顯差異（P＜0.01）。各等位基因在患者組與正常對照組中的分布和分析結(jié)果，見表2。

表2 兩組rs79417223和rs147822607分布及比較 例

3 討論

OPLL是一種高發(fā)于日本人以及亞洲人的常見病。日本人的發(fā)病率約為1.9%～4.3%，韓國人約為3.6%，我國臺灣省約為2.8%，我國北方人群的OPLL發(fā)病率約為0.44%～8.92%，而北美白人僅為0.12%[1-3]。OPLL是引起脊髓病的重要原因，大部分可保持長期穩(wěn)定狀態(tài)，起病隱匿，進展緩慢，呈現(xiàn)惡性發(fā)展趨勢，可引起脊髓不可逆性損害，其中部分患者的脊髓功能出現(xiàn)急劇惡化[1]。OPLL的致癱風險顯著高于其他頸椎退行性疾病，其原因包括缺乏有效的早期篩選方法和診斷方法，自然史不明，無法確定手術時機，術后骨化物持續(xù)生長等。目前，臨床上尚無有效的方法延緩和改善OPLL的骨化過程，手術療法仍然是最主要的治療手段，但風險系數(shù)較高[1]。1989年，Terayama等發(fā)現(xiàn)，日本OPLL家系中先證者親屬的發(fā)病率顯著高于普通人群[4]。在北美OPLL患者中，盡管大部分病例為散發(fā)性，但仍可見部分病例具有家族聚集性[5]。目前已經(jīng)達成共識，OPLL是一種嚴重危害人體健康的復雜性多基因遺傳病，其發(fā)病機制不詳，迄今沒有可靠的生物學識別指標[1-2]。許多學者已做了大量的醫(yī)學研究來揭示OPLL發(fā)病的分子醫(yī)學基礎[9]。

骨形成蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）為多功能蛋白，具有獨特的骨形成作用和其他形態(tài)發(fā)生過程。BMP-2基因定位于20p12，而BMP-4基因位于14q22-q23。Kawaguchi等[10]曾發(fā)現(xiàn)某例OPLL患者術后標本中的BMP-2僅表達于骨質(zhì)化的基質(zhì)、軟骨細胞以及鄰近OPLL軟骨的成纖維細胞中，而不在未骨質(zhì)化的頸椎后縱韌帶中表達。Kon等[11]對從OPLL和非OPLL患者的脊柱韌帶中分離到的成纖維細胞進行體外培養(yǎng)后，也發(fā)現(xiàn)BMP-2優(yōu)先誘導OPLL患者的成纖維細胞的成骨分化。Wang等[12]對192例漢族OPLL患者和304名健康對照的研究表明，具有BMP-2基因第3外顯子SNP TC和CC基因型的男性更易罹患OPLL。Karasugi等[2]最新的一項對214例日本OPLL患病同胞對的大規(guī)模全基因組連鎖分析研究顯示，OPLL最有可能的易感基因區(qū)域位于20p12的微衛(wèi)星標記D20S894附近（NPL= 3.43，P=0.000，27）。而Furushima等[13]對126例日本OPLL患病同胞對進行了的大規(guī)模候選基因篩查發(fā)現(xiàn)，僅BMP-4基因與OPLL顯著關聯(lián)（NPL=2.230，P=0.035）。本研究分別選取了BMP-2第3外顯子的rs79417223和BMP-4第4外顯子的rs147822607兩個SNP位點進行分析，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)BMP-2基因第3外顯子的rs79417223G→A患者與正常組呈現(xiàn)明顯差異（P＜0.05）。BMP-4第4外顯子的rs147822607A→C患者與正常組呈現(xiàn)明顯差異（P＜0.01）。本研究提示BMP-2基因第3外顯子的rs79417223G→A、BMP-4基因第4外顯子的rs147822607A→C，這2個多態(tài)性位點與OPLL的發(fā)病具有強烈相關性。

由于取材等方面的原因，目前直接在人頸椎后縱韌帶組織細胞水平上探討OPLL的易感基因表達水平還比較困難，加之該病呈復雜性多基因遺傳方式，并表現(xiàn)出強烈的遺傳異質(zhì)性和表型異質(zhì)性，因而尚無法準確地確定致病基因，并闡釋易感基因的基因-基因、基因-環(huán)境之間的相互作用及其在OPLL發(fā)病中的地位[1-3，9]。因此，對大樣本患者群體進行可疑易感基因的SNP分型，尋找和鑒定相關的致病基因，是切實可行的研究方法之一。由于受時間、地點限制，本研究只收集到了47例浙江地區(qū)漢族OPLL患者，選擇了2個基因多態(tài)性SNP位點進行了初步研究。研究結(jié)果提示此位點與OPLL的發(fā)病具有強烈相關性。但本研究的患者均來自于中國浙江地區(qū)，而且研究的樣本數(shù)又相對偏小，所以研究結(jié)果與以前文獻報道可能會存在有一些差異。在今后的研究中，可以將樣本再擴大化，并且運用目前先進的外顯子捕獲二代測序技術運用于OPLL基因外顯子組水平的分析研究，以獲得OPLL發(fā)生的分子遺傳學基礎[9]。

［1］Saetia K，Cho D，Lee S，et al.Ossification of the posterior longitudinal ligament:a review［J］.Neurosurg Focus，2011，30（3）：E1.

［2］Karasugi T，Nakajima M，Ikari K，et al.A genome-wide sibpair linkage analysis of ossification of the posterior longitudinal ligament of the spine［J］.J Bone Miner Metab，2013，31（2）：136-143.

［3］魏威，張永華，石仕元.頸椎后縱韌帶骨化癥的易感基因研究現(xiàn)狀［J］.中國優(yōu)生與遺傳雜志，2010，18（4）：11-13.

［4］Terayama K.Genetic studies on ossification of the posterior longitudinal ligament of the spine［J］.Spine，1989，14（11）：1184-1191.

［5］Tanabe J，Sarin H，Kindt G.Familial ossification of the posterior longitudinal ligament（OPLL）in the thoracic spine：Case report［J］.Surg Neurol，2002，58（6）：403-405.

［6］Washio M，Kobashi G，Okamoto K，et al.Sleeping habit and other life styles in the prime of life and risk for ossification of the posterior longitudinal ligament of the spine（OPLL）：Acase-control study in Japan［J］.J Epidemiol，2004，14（5）：168-173.

［7］Tsuyama N.Ossification of the posterior longitudinal ligament of the spine［J］.Clin Orthop Relat Res，1984，18（4）：71-84.

［8］Guo SW，Thompson E.Performing the exact test of Hardy-Weinberg proportion for multiple alleles［J］.Biometrics，1992，48：361-372.

［9］Wei W，He HL，Chen CY，et al.Whole exome sequencing implicates PTCH1 and COL17A1 genes in ossification of the posterior longitudinal ligament of the cervical spine in Chinese patients［J］.Genet Mol Res，2014，（in press）.

［10］Kawaguchi H，Kurokawa T，Hoshino Y，et al.Immunohistochemical demonstration of bone morphogenetic protein-2 and transforming growth factor-β in the ossification of the posterior longitudinal ligament of the cervical spine［J］. Spine，1992，17（Suppl 3）：S33-S36.

［11］Kon T，Yamazaki M，Tagawa M，et al.Bone morphogenetic protein-2 stimulates differentiation of cultured spinal ligament cells from patients with ossification of the posterior longitudinal ligament［J］.Calcif Tissue Int，1997，60（3）：291-296.

［12］Wang H，Yang ZH，Liu DM，et al.Association between two polymorphisms of the bone morpho-genetic protein-2 gene with genetic susceptibility to ossification of the posterior longitudinal ligament of the cervical spine and its severity［J］.Chin Med J，2008，121（18）：1806-1810.

［13］Furushima K，Shimo-Onoda K，Maeda S，et al.Large-scale screening for candidate genes of ossification of the posterior longitudinal ligament of the spine［J］.J Bone Miner Res，2002，17（1）：128-137.

Relationship Between the Gene Polymorphisms of BMP-2 and BMP-4 with Ossification of Posterior Longitudinal Ligament of the Spine in a Chinese population

ZHOU Yao1,WEI Wei2,CHEN Chunyue2,YE Yang2. 1 Fenghua Chinese Medical Hospital of Zhejiang Province,Fenghua(315500),China;2 Integrated Chinese and Western Medicine Hospital of Zhejiang Province

ObjectiveTo explore the relationship between 2 single nucleotide polymorphisms（SNPs）of BMP-2 and BMP-4 and ossification of posterior longitudinal ligament of the spine（OPLL）in a Chinese population.MethodsForty-seven sporadic OPLL patients and 100 healthy controls in Zhejiang area were recruited for association analysis.The SNP regions of BMP-2 and BMP-4 genes were amplified by PCR and Sanger sequencing.Genotype frequencies of the SNPs were compared between the cases and control subjects with SPSS 13.0 software.ResultsBoth Of the rs79417223 G→A site in the exon 3 of BMP-2 and the rs147822607 A→C site in the exon 4 of BMP-4，the patient and normal control groups showed significant differences（P＜0.05，P＜0.01）.ConclusionsThe rs79417223 and rs147822607 have a strong correlation to OPLL.

ossification of posterior longitudinal ligament；single nucleotide polymorphism；susceptibility gene；BMP-2 gene；BMP-4 gene

2013-12-01

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計劃項目（No.2010KY168），浙江省寧波市科技計劃項目（No.2013C50023）

葉楊，E-mail：dagou1234@163.com