孫婧瑜，孫 易，丁樹(shù)哲

（1.華東師范大學(xué)“青少年健康評(píng)價(jià)與運(yùn)動(dòng)干預(yù)”教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200241；2.華東師范大學(xué)體育與健康學(xué)院，上海200241）

?運(yùn)動(dòng)人體科學(xué)

不同干預(yù)方式對(duì)小鼠骨骼肌AMPK／ACC信號(hào)通路及CD36蛋白含量的影響

孫婧瑜1，2，孫 易1，2，丁樹(shù)哲1

（1.華東師范大學(xué)“青少年健康評(píng)價(jià)與運(yùn)動(dòng)干預(yù)”教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200241；2.華東師范大學(xué)體育與健康學(xué)院，上海200241）

目的:通過(guò)分別觀察高脂膳食、自主運(yùn)動(dòng)及能量限制3種干預(yù)方式對(duì)小鼠骨骼肌腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）、乙酰輔酶A羧化酶（ACC）活性水平及脂肪酸移位酶（CD36）總蛋白含量的影響，探討CD36總蛋白含量在不同骨骼肌脂肪酸氧化水平中的差異。方法:清潔級(jí)雄性C57小鼠40只，隨機(jī)分為4組:對(duì)照組（N，n＝10）、高脂膳食組（HD，n＝10）、自主跑輪運(yùn)動(dòng)組（E，n＝10）及能量限制組（CR，n＝10）。經(jīng)過(guò)8周干預(yù)后，小鼠斷頸處死，摘取右側(cè)股四頭肌。用western blot方法分別檢測(cè)高脂膳食、自主運(yùn)動(dòng)及能量限制干預(yù)下小鼠骨骼肌脂肪酸氧化信號(hào)通路AMPK、ACC的磷酸化水平及CD36總蛋白含量。結(jié)果:1）與對(duì)照組小鼠相比，經(jīng)過(guò)8周跑輪運(yùn)動(dòng)（P＜0.05）、能量限制（P＜0.05和P＜0.01）干預(yù)的小鼠骨骼肌AMPK、ACC蛋白磷酸化水平均有顯著的增加，然而，經(jīng)過(guò)8周高脂膳食干預(yù)的小鼠骨骼肌AMPK、ACC蛋白磷酸化水平?jīng)]有顯著變化（P＞0.05）；2）與對(duì)照組小鼠相比，經(jīng)過(guò)8周高脂膳食干預(yù)的小鼠骨骼肌CD36總蛋白表達(dá)水平顯著減少（P＜0.01），經(jīng)過(guò)8周能量限制的小鼠骨骼肌CD36總蛋白表達(dá)水平顯著增加（P＜0.01），然而，經(jīng)過(guò)8周自主運(yùn)動(dòng)的小鼠骨骼肌CD36總蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯變化（P＞0.05）；3）與高脂膳食組小鼠相比，經(jīng)過(guò)8周自主跑輪運(yùn)動(dòng)及能量限制的小鼠骨骼肌CD36總蛋白表達(dá)水平及AMPK、ACC磷酸化水平均有顯著增加（P＜0.01）。結(jié)論:1）當(dāng)骨骼肌脂肪酸的攝取不足以滿(mǎn)足脂肪酸氧化需要時(shí)（如運(yùn)動(dòng)和熱量限制），AMPK／ACC信號(hào)通路的激活可能參與脂肪酸氧化代謝的調(diào)控。2）CD36總蛋白含量可能和骨骼肌脂肪酸氧化水平密切相關(guān)，這說(shuō)明CD36總蛋白含量的調(diào)節(jié)也可能參與對(duì)小鼠骨骼肌脂肪酸氧化代謝的調(diào)控。

脂肪酸移位酶；腺苷酸活化蛋白激酶；乙酰輔酶A羧化酶；高脂膳食；自主運(yùn)動(dòng)；能量限制

肥胖已成為現(xiàn)今社會(huì)最常見(jiàn)的一種營(yíng)養(yǎng)代謝性疾病，并呈現(xiàn)了逐年上升的趨勢(shì)。適量的運(yùn)動(dòng)與合理的能量限制是目前公認(rèn)的控制飲食性肥胖最安全、有效的途徑［1］。作為細(xì)胞能量監(jiān)測(cè)器，AMPK的激活能夠誘導(dǎo)ACC失活，從而增加骨骼肌脂肪酸的氧化代謝。因此，不同干預(yù)方式對(duì)小鼠骨骼肌脂肪酸氧化水平的影響，可能主要表現(xiàn)在AMPK／ACC磷酸化水平上的差異。另外，CD36作為長(zhǎng)鏈脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，CD36總蛋白表達(dá)水平的改變可能是生理［2］（肌肉收縮、飲食等）或病理［3］（糖尿病，胰島素抵抗等）刺激下的一種潛在的適應(yīng)性調(diào)節(jié)機(jī)制。研究表明，骨骼肌CD36總蛋白表達(dá)水平能夠受外界因素的刺激而改變［4］。因此，筆者首先分別觀察了高脂膳食、自主運(yùn)動(dòng)及能量限制3種干預(yù)方式對(duì)小鼠骨骼肌CD36總蛋白含量的影響，然后進(jìn)一步探討了CD36總蛋白含量在不同骨骼肌脂肪酸氧化水平中的差異。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)雄性C57小鼠40只，約4周齡，體重24～27g，由上海斯萊克動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK（滬）2007-0005。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào):SYXK（滬）2004-0001。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類(lèi)動(dòng)物常規(guī)飼料及墊料由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，自由攝食、飲水，動(dòng)物房溫度（22±1）℃，相對(duì)濕度50%±10%，明暗周期12∶12。

1.2 主要試劑

增強(qiáng)型BCA總蛋白檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；p-Acetyl-CoA Carboxylase（S79）一抗、pAMPK（T172）（40H9）（＃2535S）一抗、anti-rabbit IgG HRP二抗及anti-mouse IgG HRP二抗均購(gòu)于Cell Signaling公司；AMPKα1／2（H-300）（sc-25792）一抗購(gòu)于Santa Cruz公司；ECL試劑購(gòu)于Immunobiology公司；彩色預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)于Thermo Scientific公司；PVDF膜購(gòu)于碧云天生物試劑公司。水平搖床、垂直電泳槽、轉(zhuǎn)膜槽均購(gòu)于Bio-Rad公司。酶標(biāo)儀:Tecan Infinite M200型；冰凍高速離心機(jī):Eppend DIO-Rf 5804／R型；掃膜儀:Fluor Chem FC2型。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物分組 購(gòu)入小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為4組:對(duì)照組（N，n＝10），高脂膳食組（HD，n＝10），自由跑輪運(yùn)動(dòng)組（E，n＝10），能量限制組（CR，n＝10）。干預(yù)期間，每日觀察小鼠飲食、糞便，記錄給食量和撒食量及跑輪轉(zhuǎn)數(shù)，每周末記錄小鼠的體重。

對(duì)照組方案:N組自由飲食，以基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)8周。高脂膳食方案:高脂高能量飼料喂養(yǎng)8周?；A(chǔ)飼料及高脂高能量飼料均由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。運(yùn)動(dòng)方案:小鼠給予基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，并采用8周自由跑輪運(yùn)動(dòng)，每日進(jìn)行跑輪圈數(shù)的記錄與清零。能量限制方案:小鼠以基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，并在8周內(nèi)逐漸進(jìn)行能量限制。第1周正常飲食，第2周降至對(duì)照組上周平均攝食量的90%，第3周降至對(duì)照組上周平均攝食量的80%，第4周降至對(duì)照組上周平均攝食量的70%，第5周降至對(duì)照組上周平均攝食量的60%，第6～8周均維持上周對(duì)照組攝食量的60%。

1.3.2 取材 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，過(guò)夜禁食16 h，摘眼球取血后斷頸處死，并于20 min內(nèi)取完整的左右下肢股四頭肌。將股四頭肌置于液氮中速凍，-80℃超低溫冰箱保存，待檢測(cè)。

1.3.3 骨骼肌蛋白表達(dá)水平的檢測(cè) 小鼠骨骼肌組織p AMPK（T172），AMPK，p ACC（S79）及CD36蛋白表達(dá)水平的測(cè)定采用Western blot法。方法如下:取保存的股四頭肌組織50～100 mg，并以1 mg骨骼肌組織加入10μl組織細(xì)胞裂解液的比例進(jìn)行裂解。用勻漿機(jī)勻漿30 s，冰上靜置10 min，重復(fù)3次后，于4℃12 000 g離心15 min。取上清液，用BCA法檢測(cè)樣品蛋白濃度，并用裂解液將各組樣品的蛋白濃度調(diào)平后，加入相應(yīng)量的5x蛋白上樣緩沖液，沸煮5min后，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。然后用5%的脫脂牛奶室溫封閉1 h，洗膜后加入相應(yīng)一抗進(jìn)行反應(yīng)，于4℃孵育過(guò)夜。TBST洗膜3次，每次10 min后，室溫孵育二抗1h，再次進(jìn)行TBST洗膜3次，每次5 min。洗膜后ECL顯色和曝光，以灰度值表示電泳帶強(qiáng)弱，確定蛋白條帶的相對(duì)吸光度值。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 不同干預(yù)方式對(duì)小鼠生長(zhǎng)曲線(xiàn)的影響

圖1結(jié)果表明，高脂膳食組小鼠的體重自第3周起就顯著高于其他各組小鼠（P＜0.01）；然而，與對(duì)照組小鼠相比，自主運(yùn)動(dòng)組小鼠的體重始終沒(méi)有明顯的變化（P＞0.05）；能量限制組小鼠的體重自第2周起就顯著低于對(duì)照組和高脂膳食組小鼠（P＜0.05），自第3周起，能量限制組小鼠體重就始終顯著低于其他各組小鼠（P＜0.01）（表1和圖1）。

表1 不同干預(yù)方式對(duì)小鼠體重的影響（g）

圖1 各組小鼠體重變化曲線(xiàn)

2.2 不同干預(yù)方式對(duì)小鼠骨骼肌AMPK／ACC信號(hào)通路活性水平的影響

與對(duì)照組小鼠相比，經(jīng)過(guò)8周高脂膳食干預(yù)的小鼠骨骼肌AMPK、ACC蛋白磷酸化水平?jīng)]有顯著變化（P＞0.05）；與對(duì)照組小鼠相比，經(jīng)過(guò)8周跑輪運(yùn)動(dòng)的小鼠骨骼肌AMPK、ACC蛋白磷酸化水平顯著增加（P＜0.05）；與對(duì)照組小鼠相比，經(jīng)過(guò)8周能量限制的小鼠骨骼肌AMPK、ACC蛋白磷酸化水平顯著增加（P＜0.05，P＜0.01）；與高脂膳食組小鼠相比，經(jīng)過(guò)8周自主運(yùn)動(dòng)及能量限制的小鼠骨骼肌AMPK、ACC蛋白磷酸化水平均有顯著增加（P＜0.05）（圖2、圖3和圖4）。

圖2 不同干預(yù)方式對(duì)小鼠骨骼肌p AM PK（T172）、AMPK、p ACC（S79）及GAPDH蛋白表達(dá)水平的影響

2.3 不同干預(yù)方式對(duì)小鼠骨骼肌CD36總蛋白表達(dá)水平的影響

圖5顯示，與對(duì)照組小鼠相比，經(jīng)過(guò)8周高脂膳食干預(yù)的小鼠骨骼肌CD36總蛋白表達(dá)水平顯著減少（P＜0.01）；然而，與對(duì)照組小鼠相比，經(jīng)過(guò)8周自主運(yùn)動(dòng)的小鼠骨骼肌CD36總蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯變化（P＞0.05）；與對(duì)照組小鼠相比，經(jīng)過(guò)8周能量限制的小鼠骨骼肌CD36總蛋白表達(dá)水平顯著增加（P＜0.01）。

圖3 不同干預(yù)方式對(duì)小鼠骨骼肌AMPK磷酸化（T172）水平的影響

圖4 不同干預(yù)方式對(duì)小鼠骨骼肌ACC（S79）磷酸化水平的影響

與高脂膳食組小鼠相比，經(jīng)過(guò)8周自主跑輪運(yùn)動(dòng)及能量限制的小鼠骨骼肌CD36總蛋白表達(dá)水平均有顯著增加（P＜0.01）。

圖5 不同干預(yù)方式對(duì)小鼠骨骼肌CD36總蛋白表達(dá)水平的影響

3 討論

3.1 不同干預(yù)方式對(duì)小鼠生長(zhǎng)情況的影響

研究結(jié)果表明，8周高脂膳食導(dǎo)致小鼠體重明顯高于其他組，這可能是因?yàn)樵摻M小鼠能量攝入大于能量消耗，體內(nèi)能量代謝處于正平衡所致。相反，8周能量限制導(dǎo)致小鼠體重明顯低于其他組，這可能是因?yàn)樵摻M小鼠能量攝入小于其能量消耗，體內(nèi)能量代謝處于負(fù)平衡所致。然而，8周自主跑輪運(yùn)動(dòng)并沒(méi)有對(duì)小鼠體重產(chǎn)生較明顯的影響，這可能是因?yàn)樾∈篌w內(nèi)的能量代謝仍處于平衡狀態(tài)所致。

3.2 不同干預(yù)方式對(duì)小鼠骨骼肌AMPK／ACC信號(hào)通路磷酸化水平的影響

高脂膳食是導(dǎo)致飲食性肥胖發(fā)生的重要原因之一，而適量的運(yùn)動(dòng)與合理的飲食限制是目前國(guó)際上公認(rèn)的控制飲食性肥胖最安全、有效的途徑。鑒于AMPK的激活能夠誘導(dǎo)ACC的失活，從而增加骨骼肌脂肪酸的氧化代謝，我們推測(cè)在小鼠能量攝入大于能量需求時(shí)（如高脂膳食）和在能量攝入小于能量需求時(shí)（如自主運(yùn)動(dòng)、能量限制），骨骼肌脂肪酸氧化水平的不同可能主要表現(xiàn)在AMPK／ACC磷酸化水平的不同。有研究顯示，長(zhǎng)期高脂膳食誘導(dǎo)的肥胖或胰島素抵抗大鼠骨骼肌中AMPK總蛋白含量及磷酸化水平均有顯著的減少［5］。Liu等人也發(fā)現(xiàn)，5個(gè)月的高脂膳食能夠?qū)е鹿趋兰MPK總蛋白含量下降58.7%，并且AMPK、ACC蛋白的磷酸化水平亦有顯著的下降，導(dǎo)致了胰島素抵抗的發(fā)生［6］。主要原因可能是，長(zhǎng)期的高脂膳食一方面可能通過(guò)降低AMPK／ACC的磷酸化水平，損傷骨骼肌脂肪酸的氧化能力；另一方面，降低的AMPK磷酸化水平可能影響了細(xì)胞內(nèi)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4（GLUT4）向細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)運(yùn)，從而妨礙了葡萄糖的攝取，導(dǎo)致了骨骼肌胰島素敏感性的下降。然而，本研究結(jié)果顯示，8周高脂膳食對(duì)小鼠骨骼肌AMPK、ACC的蛋白磷酸化水平?jīng)]有顯著的影響（P＞0.05）。這可能是因?yàn)?，高脂膳食?duì)小鼠骨骼肌AMPK活性水平的影響是一個(gè)動(dòng)態(tài)的變化過(guò)程［7］。8周的高脂膳食干預(yù)雖已導(dǎo)致了小鼠葡萄糖的代謝異常，但還不足以導(dǎo)致胰島素抵抗的發(fā)生，小鼠目前可能仍處于胰島素抵抗傾向階段。另有研究顯示，AMPK／ACC對(duì)運(yùn)動(dòng)過(guò)程中骨骼肌脂肪酸氧化代謝的調(diào)節(jié)與運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度密切相關(guān)［8］。運(yùn)動(dòng)中AMPK／ACC信號(hào)通路與骨骼肌脂肪酸氧化代謝之間的耦聯(lián)可能主要發(fā)生在中等強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng)中。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組小鼠相比，經(jīng)過(guò)8周自主跑輪運(yùn)動(dòng)的小鼠，其骨骼肌AMPK、ACC的蛋白磷酸化水平均有顯著增加（P＜0.05）（圖3和圖4），這可能與自主跑輪運(yùn)動(dòng)是中低強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng)有關(guān)。近來(lái)，Cao等人的研究結(jié)果與本研究結(jié)果相一致［9］。另外，本研究結(jié)果亦顯示，經(jīng)過(guò)8周的能量限制，與對(duì)照組小鼠相比，CR小鼠骨骼肌AMPK（P＜0.05）、ACC（P＜0.01）蛋白磷酸化水平均有顯著的增加（圖3和圖4）。該結(jié)果表明，能量限制誘導(dǎo)的骨骼肌AMPK、ACC磷酸化水平的增加可能是對(duì)長(zhǎng)時(shí)間脂肪酸攝入不足的一種代償性適應(yīng)過(guò)程。Palacio等人的研究結(jié)果亦顯示，能量限制能夠激活A(yù)MPK［10］。最近，Canto和Auwerx的研究亦發(fā)現(xiàn)，能量限制可能通過(guò)激活A(yù)MPK對(duì)骨骼肌胰島素敏感性的改善起到了重要的調(diào)控作用［11］。由此推測(cè)，骨骼肌AMPK活性水平的提高是能量限制促進(jìn)胰島素敏感性提高的重要因素之一。綜上所述，經(jīng)過(guò)8周的自主運(yùn)動(dòng)或能量限制干預(yù)，小鼠骨骼肌AMPK、ACC蛋白磷酸化水平的提高可能是為了滿(mǎn)足以分解代謝為主的脂肪酸氧化需求的增加而出現(xiàn)的顯著上調(diào)。

另外，與高脂膳食組小鼠相比，自主運(yùn)動(dòng)組小鼠及能量限制組小鼠骨骼肌AMPK、ACC磷酸化水平均有顯著增加（P＜0.05），說(shuō)明高脂膳食誘導(dǎo)的小鼠骨骼肌脂肪酸氧化代謝水平顯著低于自主運(yùn)動(dòng)及能量限制誘導(dǎo)的小鼠骨骼肌脂肪酸氧化代謝水平。說(shuō)明高脂膳食、自主運(yùn)動(dòng)、能量限制3種干預(yù)方式誘導(dǎo)的小鼠骨骼肌脂肪酸氧化代謝水平不同的動(dòng)物模型建立成功，從而可以繼續(xù)探討小鼠骨骼肌脂肪酸氧化代謝水平的不同對(duì)CD36總蛋白含量的影響。

3.3 不同干預(yù)方式對(duì)小鼠骨骼肌CD36總蛋白表達(dá)水平的影響

3.3.1 高脂膳食干預(yù)對(duì)小鼠骨骼肌CD36總蛋白表達(dá)水平的影響 本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組小鼠相比，CD36總蛋白表達(dá)水平并沒(méi)有隨著高脂膳食的干預(yù)而增加。相反，經(jīng)過(guò)8周高脂膳食的干預(yù)，小鼠骨骼肌CD36總蛋白含量有顯著的下降（P＜0.01）（圖5）。這可能是因?yàn)殚L(zhǎng)期的高脂膳食導(dǎo)致了血液中游離脂肪酸濃度始終保持在一個(gè)較高的水平，從而導(dǎo)致了骨骼肌CD36蛋白泛素化水平的增加，減少了CD36的總蛋白含量。這一結(jié)果可能補(bǔ)充了Jill等人在C2C12細(xì)胞上所獲得的離體實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)［12］。Jill等人研究發(fā)現(xiàn)，高濃度的脂肪酸干預(yù)能夠通過(guò)增加CD36蛋白的泛素化，減少骨骼肌細(xì)胞CD36總蛋白的含量，從而對(duì)脂肪酸代謝進(jìn)行調(diào)控［12］。例如，脂肪酸能夠通過(guò)調(diào)節(jié)與脂肪酸代謝有關(guān)的PPAR、FoxO1轉(zhuǎn)錄因子的蛋白活性，來(lái)對(duì)脂肪酸自身的代謝能力進(jìn)行調(diào)控［13］。尤其是在細(xì)胞受到外界刺激時(shí)（如，饑餓或機(jī)械牽拉），脂肪酸對(duì)目標(biāo)蛋白的這種泛素化作用是一種保護(hù)性的適應(yīng)性調(diào)控。然而Roepstorff等人有著不同的結(jié)論，Roepstorff等人認(rèn)為高脂膳食能夠增加CD36蛋白的表達(dá)水平［14］。值得一提的是，無(wú)論高脂膳食對(duì)骨骼肌細(xì)胞CD36總蛋白含量的影響如何，可以肯定的是，高脂膳食均能誘導(dǎo)骨骼肌細(xì)胞膜上CD36蛋白含量的增加［15-16］。進(jìn)一步對(duì)胰島素抵抗骨骼肌細(xì)胞進(jìn)行研究，同樣發(fā)現(xiàn)骨骼肌對(duì)長(zhǎng)鏈脂肪酸攝取的增加并沒(méi)有伴隨著CD36總含量的增加，而是伴隨著細(xì)胞膜CD36表達(dá)水平的增加［17］。由此表明，CD36對(duì)高脂膳食的適應(yīng)性調(diào)控可能主要表現(xiàn)在CD36向細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)運(yùn)上，而CD36總蛋白含量在這一過(guò)程中可能并不起關(guān)鍵的作用。

3.3.2 自主運(yùn)動(dòng)干預(yù)對(duì)小鼠骨骼肌CD36總蛋白表達(dá)水平的影響 經(jīng)過(guò)較長(zhǎng)時(shí)間的耐力運(yùn)動(dòng)后，骨骼肌CD36總蛋白的表達(dá)水平呈現(xiàn)多元化的調(diào)控結(jié)果。有研究顯示，急性耐力訓(xùn)練能夠誘導(dǎo)人體骨骼肌CD36總蛋白表達(dá)水平的增加［18］。另有研究發(fā)現(xiàn)，30min骨骼肌收縮能夠引起線(xiàn)粒體CD36表達(dá)水平的增加，而骨骼肌CD36總蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯變化［19］。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組小鼠相比，經(jīng)過(guò)8周自主運(yùn)動(dòng)的小鼠骨骼肌CD36總蛋白表達(dá)水平并沒(méi)有顯著增加（P＞0.05）（圖5）。Kiens等人通過(guò)對(duì)有兩年以上耐力訓(xùn)練經(jīng)歷的受試者進(jìn)行檢測(cè)，同樣發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期的耐力訓(xùn)練并不能提高股外側(cè)肌CD36總蛋白的表達(dá)水平［20］。這可能是因?yàn)?，CD36對(duì)骨骼肌收縮所引起的適應(yīng)性變化，主要表現(xiàn)在CD36向細(xì)胞膜（或線(xiàn)粒體膜）的轉(zhuǎn)運(yùn)，而非總蛋白表達(dá)水平的變化。還可能是因?yàn)?，骨骼肌?xì)胞內(nèi)所儲(chǔ)存的CD36已經(jīng)能夠足夠滿(mǎn)足該強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)所需的脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)，無(wú)需增加更多的CD36蛋白合成。另一方面，運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的骨骼肌CD36總蛋白表達(dá)水平的不一致，反映了對(duì)CD36在運(yùn)動(dòng)過(guò)程中的作用及作用機(jī)制的研究尚不明確。比如，骨骼肌CD36蛋白表達(dá)水平的升高可能是對(duì)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練初期的一個(gè)暫時(shí)性的適應(yīng)過(guò)程，而這種適應(yīng)性的過(guò)程可能會(huì)隨著運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸消退。因此，在今后的研究中，可以選取運(yùn)動(dòng)初期、運(yùn)動(dòng)中期以及運(yùn)動(dòng)末期的多個(gè)時(shí)間點(diǎn)，從而可以更清晰地反映CD36總蛋白含量在運(yùn)動(dòng)適應(yīng)過(guò)程中的變化。

3.3.3 能量限制干預(yù)對(duì)小鼠骨骼肌CD36總蛋白表達(dá)水平的影響 Chabowski等人用AMPK的激動(dòng)劑（AICAR）對(duì)心肌細(xì)胞進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的刺激后發(fā)現(xiàn)，CD36的基因及蛋白表達(dá)水平均有顯著增加［21］。Pandke等人使用AMPK的激動(dòng)劑β胍基丙酸（β-GAP）作用心肌細(xì)胞后，同樣也發(fā)現(xiàn)CD36總蛋白及細(xì)胞膜蛋白的含量均有顯著的增加［22］。而骨骼肌中有關(guān)AMPK的激活與CD36總蛋白表達(dá)水平的關(guān)系，還鮮有報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組小鼠相比，經(jīng)過(guò)8周能量限制的小鼠骨骼肌CD36總蛋白表達(dá)水平顯著增加（P＜0.01）（圖5）。這可能是因?yàn)槟芰肯拗普T導(dǎo)的AMPK活性水平的升高是導(dǎo)致CD36總蛋白表達(dá)水平增加的原因之一。該結(jié)果表明，能量限制誘導(dǎo)的骨骼肌CD36總蛋白含量的增加可能是對(duì)長(zhǎng)時(shí)間脂肪酸攝入不足的一種代償性適應(yīng)，通過(guò)增加自身CD36的表達(dá)水平，來(lái)提高骨骼肌脂肪酸的轉(zhuǎn)運(yùn)及氧化效率，從而最大程度地減輕因脂肪酸的攝入不足對(duì)機(jī)體產(chǎn)生的影響。

3.4 小鼠骨骼肌脂肪酸氧化水平不同對(duì)CD36總蛋白含量的影響

對(duì)CD36的研究多集中在脂肪酸攝取方面，然而對(duì)CD36在脂肪酸氧化代謝方面的相關(guān)研究還較少，其作用機(jī)制也知之甚少。有學(xué)者認(rèn)為，CD36存在于線(xiàn)粒體膜上，并通過(guò)調(diào)節(jié)脂肪酸進(jìn)入線(xiàn)粒體的數(shù)量，而對(duì)脂肪酸氧化代謝進(jìn)行調(diào)控［23］。然而，這一說(shuō)法尚存爭(zhēng)議。Holloway等人認(rèn)為，CD36既不存在于線(xiàn)粒體膜上，又不能通過(guò)調(diào)節(jié)脂肪酸進(jìn)入線(xiàn)粒體的數(shù)量來(lái)對(duì)脂肪酸氧化進(jìn)行調(diào)控［24］。AMPK作為調(diào)控脂肪酸氧化代謝的關(guān)鍵蛋白，普遍認(rèn)為AMPK的激活，能夠抑制ACC的活性，并通過(guò)減少丙二酰輔酶A對(duì)CPT-1的抑制作用，來(lái)增加脂肪酸的氧化代謝。推測(cè)CD36的表達(dá)含量可能與AMPK／ACC信號(hào)通路的激活有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)組離體實(shí)驗(yàn)結(jié)果已表明，CD36作為AMPK／ACC信號(hào)通路的上游信號(hào)分子，通過(guò)調(diào)節(jié)AMPK／ACC信號(hào)通路的活性來(lái)對(duì)骨骼肌脂肪酸氧化代謝水平進(jìn)行調(diào)控（未發(fā)表）。Yoshida等人的近期研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，線(xiàn)粒體機(jī)制（線(xiàn)粒體數(shù)量及氧化酶活性）可能不是運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)骨骼肌脂肪酸氧化水平增加的唯一機(jī)制，CD36對(duì)運(yùn)動(dòng)增加骨骼肌脂肪酸氧化代謝中也起到了重要的作用［25］。然而，對(duì)CD36總蛋白含量在不同干預(yù)方式誘導(dǎo)的脂肪酸氧化水平不同的骨骼肌中是否存在差異，尚不清楚。本研究結(jié)果顯示，與高脂膳食組小鼠相比，自主運(yùn)動(dòng)組小鼠及能量限制組小鼠骨骼肌AMPK、ACC磷酸化水平均有顯著增加（P＜0.05）（圖3和圖4）。該結(jié)果表明高脂膳食誘導(dǎo)的小鼠骨骼肌脂肪酸氧化代謝水平顯著低于自主運(yùn)動(dòng)及能量限制組小鼠的骨骼肌脂肪酸氧化代謝水平。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，與高脂膳食組小鼠相比，自主運(yùn)動(dòng)及能量限制誘導(dǎo)的小鼠骨骼肌CD36總蛋白含量有顯著增加（P＜0.01）（圖5）。該結(jié)果表明，骨骼肌脂肪酸氧化水平較低的高脂膳食組小鼠CD36的總蛋白含量也顯著低于自主運(yùn)動(dòng)及能量限制組小鼠；相反，骨骼肌脂肪酸氧化水平較高的自主運(yùn)動(dòng)及能量限制組小鼠的CD36總蛋白含量也顯著高于高脂膳食組小鼠。進(jìn)一步說(shuō)明了脂肪酸氧化水平不同的骨骼肌中CD36總蛋白含量也不同。CD36總蛋白含量的差異可能是對(duì)不同小鼠骨骼肌脂肪酸氧化代謝水平的一種適應(yīng)性變化。然而，對(duì)CD36在脂肪酸氧化代謝適應(yīng)性方面的機(jī)制研究，尚需深入探討。

4 結(jié)論

通過(guò)比較3種不同干預(yù)方式對(duì)AMPK／ACC磷酸化水平和CD36總蛋白含量的影響，本研究結(jié)果表明了在骨骼肌對(duì)脂肪酸的攝取不足以滿(mǎn)足脂肪酸氧化需要時(shí)（如運(yùn)動(dòng)和熱量限制），AMPK／ACC信號(hào)通路的激活可能參與對(duì)脂肪酸氧化代謝的調(diào)控。同時(shí)，CD36總蛋白含量可能和骨骼肌脂肪酸氧化水平密切相關(guān)，這說(shuō)明CD36總蛋白含量的調(diào)節(jié)也可能參與對(duì)小鼠骨骼肌脂肪酸氧化代謝的調(diào)控。另外，CD36作為脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體，骨骼肌細(xì)胞膜上CD36的含量是反映骨骼肌對(duì)脂肪酸攝取能力的關(guān)鍵指標(biāo)之一。在今后的研究中可以繼續(xù)探討骨骼肌細(xì)胞膜CD36的表達(dá)水平對(duì)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練的適應(yīng)性調(diào)控。

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責(zé)任編輯:喬艷春

Effect of Different Intervention on AMPK／ACC Activation and CD36 Contents in Skeletal M uscles

SUN Jingyu1，2，SUN Yi1，2，DING Shuzhe1
（1.Key Laboratory of Adolescent Health Assessment and Exercise Intervention，M inistry of Education，East China Normal University，Shanghai200241，China；2.College of Physical Education and Health，East China Normal University，Shanghai200241，China）

Objective:The aim of the study was to explore the effect of oxidation level of fatty acid on CD36 content in the skeletalmuscles，aswell as the effect of different interventions on the phosphorylation levels of AMPK and ACC.Methods: 40 male C57BL／6 m ice were random ly assigned into four groups:control（N，n＝10），high fat diet（HD，n＝10），voluntary exercise（E，n＝10）and caloric restriction（CR，n＝10）w ith 10 m ice in each group.The intervention period lasted for 8 weeks and the body weight of four groupswas recorded weekly.Total content and phosphorylation levels of AMPK，phosphorylation level of ACC and total CD36 content in the four groups weremeasured by Western Blot.Results:Compared w ith the control group，the phosphorylation levels of AMPK and ACC were significantly increased in groups E（P＜0.05）and CR（P＜0.05 and＜0.01，respectively），while the AMPK and ACC phosphorylation levels were not significantly changed in group HD（P＞0.05）.When compared to group N，the total CD36 contentswere significantly decreased and increased in groups HD（P＜0.01）and CR（P＜0.01），while itwas not significantly changed in groups E（P＞0.05）.Conclusions:The phosphorylation levels of AMPK，ACC were increased in response to E or CR.The total CD36 content in the skeletalmuscle were different in HD，E and CR，which was probably related to the regulation of fatty acid oxidation.

Fatty Acids Translocase／CD36；AMPK；ACC；high fat diet；voluntary exercise；caloric restriction

G804.7

：A

：1004-0560（2014）02-0074-06

2014-02-26；

2014-03-15

國(guó)家自然科學(xué)基金:線(xiàn)粒體蛋白輸入（PIM）的運(yùn)動(dòng)適應(yīng)與調(diào)控機(jī)制研究（No.31171141）。

孫婧瑜（1985—），女，博士研究生，主要研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)適應(yīng)與線(xiàn)粒體調(diào)控。