鄧明達(dá)

（3M中國有限公司，上海 200336）

基于培養(yǎng)環(huán)境的混合狀態(tài)進(jìn)行增光處理的新型光發(fā)酵制氫工藝

鄧明達(dá)

（3M中國有限公司，上海 200336）

實(shí)驗(yàn)研究了不同培養(yǎng)環(huán)境的混合狀態(tài)下光照強(qiáng)度對(duì)光合細(xì)菌生長和光發(fā)酵產(chǎn)氫的影響，提出靜態(tài)培養(yǎng)和動(dòng)態(tài)培養(yǎng)狀態(tài)下的光飽和點(diǎn)分別為4000lux和6000lux。分析了Rhodobacter sphaeroides ZX-5培養(yǎng)環(huán)境中,光照強(qiáng)度隨菌體細(xì)胞濃度及光傳播距離增加而衰減的變化規(guī)律,得到了光在菌液傳遞過程中衰減的數(shù)學(xué)模型,即I=I0exp[-（0.4 814+0.2 991 OD660nm）·L]。首次提出了基于培養(yǎng)環(huán)境的混合狀態(tài)進(jìn)行增光處理的新型光發(fā)酵制氫策略，使得最大產(chǎn)氫速率達(dá)到161.7mlH2/lh。

生物制氫；球形紅假單胞菌；光照強(qiáng)度；產(chǎn)氫速率

隨著社會(huì)文明的不斷進(jìn)步和工業(yè)化程度的不斷提高,人類對(duì)能源的需求日益增加,有限的化石能源已經(jīng)不能滿足世界各國對(duì)能源的需求。能源短缺,環(huán)境污染是人類未來面臨的難題,尋找可再生的清潔能源已成為世界范圍內(nèi)能源界及其相關(guān)領(lǐng)域關(guān)注的焦點(diǎn)問題?；剂先紵龝r(shí)生成CHx、COx、NOx、SOx、灰塵、煙霧、焦油等有機(jī)污染物，造成了嚴(yán)重的環(huán)境污染并使全球氣候發(fā)生變化[1]。

生物制氫所用的原料是城市污水、生活垃圾、動(dòng)物糞便等有機(jī)廢物，通過發(fā)酵細(xì)菌或光合細(xì)菌的生物降解處理可以獲得氫氣，同時(shí)凈化水質(zhì)，達(dá)到保護(hù)環(huán)境的作用。因此，無論從環(huán)境保護(hù)，還是從新能源開發(fā)的角度來看，生物質(zhì)制氫都具有很大的發(fā)展前途，它不僅能給人們提供清潔的能源，又能處理有機(jī)廢物，保護(hù)環(huán)境，獲得可觀的經(jīng)濟(jì)效益，是一條可持續(xù)發(fā)展的道路[2-4]。生物制氫作為一種符合可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略的方向，已在世界上引起廣泛重視，迄今為止，國際上已有的生物制氫方法有藍(lán)細(xì)菌和綠藻光分解制氫[5]、體外酶合成制氫[6]、厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫[7-11]、光發(fā)酵產(chǎn)氫[12-14]以及厭氧-光合細(xì)菌耦合發(fā)酵產(chǎn)氫[15-17]等多種。

光合細(xì)菌簡稱PSB（Photosynthetic Bacteria），是一群能在厭氧或好氧條件下，以光源作為能源分解有機(jī)物進(jìn)行光合作用的細(xì)菌[18]。光合細(xì)菌制氫過程中，影響光合產(chǎn)氫的因素很多，主要有菌株特性、溫度、光照條件、pH值、種齡、C源、N源以及與氫代謝相關(guān)的三種酶的酶活等因素，其中最大的問題就是光的轉(zhuǎn)化效率。光在光生物反應(yīng)器（Photobioreactor，PBR）內(nèi)隨著光程的增加光強(qiáng)急劇下降，光強(qiáng)在反應(yīng)器內(nèi)部的分布很不均勻；同時(shí)，有些底物在代謝過程中，往往會(huì)產(chǎn)生顏色變化，更進(jìn)一步阻礙光的傳遞。另一方面，隨著細(xì)胞的代謝生長，PBR內(nèi)透光率隨之下降，因此賴以光能的產(chǎn)氫效率會(huì)顯著下降。這已成為PBR光合菌制氫研究中亟待解決的技術(shù)難題[19-21]。

本實(shí)驗(yàn)研究了光強(qiáng)對(duì)光合生物產(chǎn)氫的影響，模擬光在生物反應(yīng)器中的傳遞，并通過靜態(tài)培養(yǎng)和動(dòng)態(tài)培養(yǎng)的比較，指出光合細(xì)菌光飽和點(diǎn)并非固定不變的，而是隨著培養(yǎng)環(huán)境的混合狀態(tài)和菌體生理?xiàng)l件的變化而改變的，同時(shí)確立了基于培養(yǎng)環(huán)境的混合狀態(tài)進(jìn)行增光處理的新型光發(fā)酵制氫策略，大大提高光合細(xì)菌的產(chǎn)氫速率。

1 材料與方法

1.1 菌種和培養(yǎng)條件

菌種：Rhodobacter sphaeroidesZX-5。

種子培養(yǎng)：將1ml種子甘油管倒入裝有100mlRCVBN種子培養(yǎng)基[22]的250ml三角瓶中，pH=7±0.1，180rpm，30±1℃，遮光好氧培養(yǎng)，約20h接種于產(chǎn)氫培養(yǎng)基。

產(chǎn)氫培養(yǎng)：將1ml種子液加入裝有34mlRCVBN產(chǎn)氫培養(yǎng)基的38ml光合反應(yīng)器中，pH=7±0.1，30±1℃，光照厭氧培養(yǎng)，并采用60ml無菌注射器計(jì)量氫氣產(chǎn)量。

1.2 光衰減動(dòng)力學(xué)的測(cè)定

取一系列菌體濃度不同的培養(yǎng)液，注入比色皿中，并通過改變比色皿的個(gè)數(shù)模擬反應(yīng)器中光程的增加，用光照度計(jì)測(cè)量光通過不同濃度的菌液時(shí)光強(qiáng)的衰減程度；入射光的初始光強(qiáng)為7 000lux。

1.3 實(shí)驗(yàn)器材與檢測(cè)方法

光源為60W白熾燈；pH值測(cè)量采用FE20型實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)（Mettler-Toledo儀器有限公司）；生物量的測(cè)量以O(shè)D660nm表示，采用Spectrumlab22pc型分光光度計(jì)（上海棱光技術(shù)有限公司）；光照度的測(cè)量采用ZDS-10自動(dòng)量程照度計(jì)（上海市嘉定學(xué)聯(lián)儀表廠）；氣體成分及氫氣含量的測(cè)定采用尾氣質(zhì)譜分析儀（Extrel CMS Max 300-LG,USA）；動(dòng)態(tài)培養(yǎng)采用TS-1型脫色搖床（江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 光照強(qiáng)度對(duì)光合細(xì)菌生長和產(chǎn)氫性能的影響

表1 -光照強(qiáng)度對(duì)光合細(xì)菌生長和產(chǎn)氫性能的影響

實(shí)驗(yàn)研究了不同光照強(qiáng)度（分別為2 000、3 000、4 000、5 000、6 000、7 000、8 000、9 000lux）對(duì)光合細(xì)菌產(chǎn)氫能力的影響。從表1可知，隨著光照強(qiáng)度的增加，最大產(chǎn)氫速率逐漸增加，并且發(fā)酵周期由90h減少至73h，但pH幾乎不隨光強(qiáng)的變化而變化。另外，光強(qiáng)從2 000lux提高到4 000lux時(shí)，氫氣的產(chǎn)量隨之增加，當(dāng)光強(qiáng)為4 000lux時(shí)產(chǎn)量最大，達(dá)到121mlH2/34ml culture medium；繼續(xù)提高光強(qiáng)至9 000lux，氫氣產(chǎn)量反而略有下降。

通過本實(shí)驗(yàn)說明Rhodobacter sphaeroidesZX-5的最適光強(qiáng)為4 000lux，此時(shí)已達(dá)到了“光飽和”現(xiàn)象。

2.2 光衰減動(dòng)力學(xué)模型的建立

在光合細(xì)菌Rhodobacter sphaeroidesZX-5的光發(fā)酵體系中，以6 800lux為初始入射光光強(qiáng)，測(cè)量菌體濃度（以O(shè)D660nm表示）和光程距離的變化對(duì)光強(qiáng)在反應(yīng)器內(nèi)部分布的影響，結(jié)果見圖1。從圖1可以看出,在Rhodobacter sphaeroidesZX-5的光發(fā)酵體系中，隨著菌體濃度和光程距離的增加,反應(yīng)器內(nèi)部的光照強(qiáng)度迅速衰減。這說明：在反應(yīng)器內(nèi)部的同一位置，光強(qiáng)是隨著菌體濃度的增加而變化的。在光發(fā)酵初期，菌體細(xì)胞濃度較小，光衰減程度低，而到了光發(fā)酵后期，隨著菌體細(xì)胞濃度的增加，菌體細(xì)胞的遮光作用增強(qiáng)，導(dǎo)致光衰減嚴(yán)重。

圖1 光程距離和菌體濃度對(duì)光強(qiáng)衰減的影響

通過回歸分析,可得到光照強(qiáng)度在Rhodobacter sphaeroides ZX-5光發(fā)酵體系中衰減的數(shù)學(xué)模型：

其中，I為某一光程距離上的實(shí)際光強(qiáng)（lux），I0為初始入射光強(qiáng)度（lux），L為光程距離（cm），OD660nm代表菌體細(xì)胞濃度。

光發(fā)酵體系中光衰減數(shù)學(xué)模型的建立，有助于我們模擬光強(qiáng)在反應(yīng)器內(nèi)部的分布，并據(jù)此對(duì)培養(yǎng)過程中對(duì)光照不足的位置進(jìn)行增加光照處理。

2.3 培養(yǎng)環(huán)境的不同混合狀態(tài)對(duì)光發(fā)酵產(chǎn)氫的影響

實(shí)驗(yàn)2.1采用動(dòng)態(tài)培養(yǎng)的方式，在實(shí)驗(yàn)過程中，我們發(fā)現(xiàn)反應(yīng)器底部有大量菌體沉淀的現(xiàn)象。因此，我們擬采用動(dòng)態(tài)培養(yǎng)的方式將菌體細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)體系中，從而使菌液混合更加均勻，同時(shí)通過動(dòng)態(tài)培養(yǎng)使氫氣析出迅速，盡量減少底物抑制，觀察能否提高產(chǎn)氫速率。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)2.1的結(jié)果，動(dòng)態(tài)培養(yǎng)選在4000lux光強(qiáng)下進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 -不同培養(yǎng)模式對(duì)光發(fā)酵產(chǎn)氫的影響

從表2可知，動(dòng)態(tài)培養(yǎng)與靜態(tài)培養(yǎng)相比，縮短了光發(fā)酵周期，但是底物轉(zhuǎn)化率較低，僅為靜態(tài)培養(yǎng)時(shí)的78.46%。因此，能否提高動(dòng)態(tài)培養(yǎng)的底物轉(zhuǎn)化率，則直接影響是否可以大幅度提高光發(fā)酵的產(chǎn)氫速率。

由圖2可知：在光發(fā)酵過程中，動(dòng)態(tài)培養(yǎng)從第8小時(shí)開始，菌體濃度（OD660nm）始終大于靜態(tài)培養(yǎng)的菌體濃度（OD660nm），并且從第18小時(shí)開始，兩個(gè)體系的菌體濃度（OD660nm）均趨于穩(wěn)定，進(jìn)入菌體生長的穩(wěn)定期；另外，通過與圖3比較，不管是動(dòng)態(tài)培養(yǎng)還是靜態(tài)培養(yǎng)，光發(fā)酵產(chǎn)氫過程均發(fā)生在菌體細(xì)胞生長的穩(wěn)定期內(nèi)。

圖2 靜態(tài)培養(yǎng)與動(dòng)態(tài)培養(yǎng)過程中OD660nm和pH的變化曲線

圖3 靜態(tài)培養(yǎng)與動(dòng)態(tài)培養(yǎng)的光發(fā)酵產(chǎn)氫過程曲線

根據(jù)2.2得到的光衰減數(shù)學(xué)模型可知，OD660nm值大，意味著光在菌液傳遞的過程中衰減現(xiàn)象加劇。從而推斷：可能是因?yàn)榫褐泄鈴?qiáng)的不足，導(dǎo)致動(dòng)態(tài)光發(fā)酵的底物轉(zhuǎn)化率偏低。

擬設(shè)計(jì)增光實(shí)驗(yàn)，通過提高初始入射光光強(qiáng)，觀察是否可以提高動(dòng)態(tài)光發(fā)酵的底物轉(zhuǎn)化率低，從而達(dá)到提高光發(fā)酵產(chǎn)氫速率的目的。

2.4 基于混合狀態(tài)進(jìn)行增光光發(fā)酵制氫工藝策略的確定

2.4.1 實(shí)驗(yàn)原理

根據(jù)2.2得到的光衰減數(shù)學(xué)模型進(jìn)行估算：

假設(shè)初始入射光為4 000lux時(shí)，靜態(tài)培養(yǎng)結(jié)束時(shí)OD660nm為1.73，動(dòng)態(tài)培養(yǎng)結(jié)束時(shí)OD660nm為2.35，見表2。又因?yàn)閺?8小時(shí)開始，兩個(gè)體系的ODv值均趨于穩(wěn)定，見圖2，所以假定發(fā)酵結(jié)束時(shí)的OD660nm等于產(chǎn)氫過程中的OD660nm。那么，相同光強(qiáng)在動(dòng)態(tài)培養(yǎng)和靜態(tài)培養(yǎng)時(shí)菌液中的分布，見表3。通過提高初始入射光的強(qiáng)度，使得光強(qiáng)在動(dòng)態(tài)培養(yǎng)時(shí)菌液中的分布與靜態(tài)培養(yǎng)時(shí)的相當(dāng)或者優(yōu)于靜態(tài)培養(yǎng)的光照條件，觀察能否提高振蕩光發(fā)酵的底物轉(zhuǎn)化率。

表3 不同混合狀態(tài)及初始入射光強(qiáng)度對(duì)發(fā)酵液中光強(qiáng)分布的影響

與靜態(tài)培養(yǎng)相比，初始入射光光強(qiáng)同樣為4 000lux時(shí)，在動(dòng)態(tài)培養(yǎng)條件下的衰減要嚴(yán)重的多；當(dāng)把動(dòng)態(tài)培養(yǎng)條件下的初始入射光光強(qiáng)提高至6 000lux時(shí)，在光程2cm處，光強(qiáng)度幾乎與靜置發(fā)酵時(shí)一致，而在反應(yīng)器內(nèi)部則優(yōu)于靜態(tài)培養(yǎng)內(nèi)部的光強(qiáng)分布；繼續(xù)將光強(qiáng)提高到7 000lux～8 000lux時(shí)，其在反應(yīng)器內(nèi)部的光強(qiáng)分布則遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于入射光為4 000lux時(shí)的靜態(tài)培養(yǎng)內(nèi)部的光強(qiáng)分布（表3）。

2.4.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果表4可知，通過增加入射光光強(qiáng)，動(dòng)態(tài)培養(yǎng)的氫氣產(chǎn)量上升，OD660nm下降，說明反應(yīng)器內(nèi)部光照強(qiáng)度不足是導(dǎo)致動(dòng)態(tài)培養(yǎng)發(fā)酵底物轉(zhuǎn)化率低的原因之一。

表4 不同培養(yǎng)模式及不同初始入射光強(qiáng)度對(duì)光發(fā)酵產(chǎn)氫的影響

圖4 動(dòng)態(tài)培養(yǎng)模式下，不同初始入射光強(qiáng)度對(duì)底物轉(zhuǎn)化率和菌體生長（以O(shè)D660nm表示）的影響

圖5 動(dòng)態(tài)培養(yǎng)模式下，不同初始入射光強(qiáng)度對(duì)最大產(chǎn)氫速率和平均產(chǎn)氫速率的影響

由圖4知，光強(qiáng)從4 000lux增加到8 000lux過程中，OD660nm卻從2.35下降到1.86，與靜態(tài)培養(yǎng)的OD非常接近，而光強(qiáng)的增加則對(duì)pH影響不大，基本維持穩(wěn)定在pH：7.18±0.03。另外，隨著光強(qiáng)的增加，氫氣的產(chǎn)量逐漸增加。但是當(dāng)光強(qiáng)達(dá)到6 000lux時(shí)，再增加光強(qiáng)，動(dòng)態(tài)培養(yǎng)的氫氣產(chǎn)量不再增加，幾乎維持恒定，說明光強(qiáng)6 000lux為動(dòng)態(tài)光發(fā)酵條件下的光飽和點(diǎn)，這與靜態(tài)培養(yǎng)時(shí)400lux為光飽和點(diǎn)是不一致的。通過該實(shí)驗(yàn)可以得出：光合細(xì)菌的光飽和點(diǎn)是隨著外部環(huán)境條件的變化而發(fā)生變化的，并非固定不變的。

由圖5知：通過光強(qiáng)的增加，動(dòng)態(tài)培養(yǎng)的發(fā)酵周期縮短，氫氣得率提高，進(jìn)而使得平均產(chǎn)氫反應(yīng)速率和最大產(chǎn)氫速率均得到大幅度的提高。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)論和研究趨勢(shì)

3.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)論

本文研究了不同光照強(qiáng)度對(duì)光合細(xì)菌產(chǎn)氫的影響，確定了3 000lux為靜態(tài)培養(yǎng)條件下的最佳光照強(qiáng)度；同時(shí)模擬了光在菌液中的衰減情況，建立了光衰減動(dòng)力學(xué)數(shù)學(xué)模型；實(shí)驗(yàn)提出了基于培養(yǎng)環(huán)境的混合狀態(tài)進(jìn)行增光處理的新型光發(fā)酵制氫工藝，提高了光發(fā)酵的最大產(chǎn)氫速率。

3.2 研究趨勢(shì)

為了提高產(chǎn)氫速率和產(chǎn)氫量，光合細(xì)菌制氫系統(tǒng)目前還存在以下3個(gè)制約因素：(1)生物培養(yǎng)設(shè)備的太陽能轉(zhuǎn)化效率；(2) H2合成過程；(3)生物反應(yīng)器的設(shè)計(jì)和成本。

由于光合微生物制氫過程存在的厭養(yǎng)、光轉(zhuǎn)化率低、連續(xù)高效率產(chǎn)氫時(shí)間短等問題，因此，在深入進(jìn)行產(chǎn)氫生化機(jī)制研究，高產(chǎn)菌株選育的同時(shí)，應(yīng)著重以下幾個(gè)方面的研究：

(1)充分利用光合微生物及其它微生物的多樣性和互助性，采用共培養(yǎng)或分步培養(yǎng)技術(shù)，利用微生物菌群制氫，解決酶抑制，利用基質(zhì)種類單一，有機(jī)物轉(zhuǎn)化利用率低等問題。

(2)深入進(jìn)行光能吸收、轉(zhuǎn)化和利用方面的研究，用光譜耦合，光有效導(dǎo)入和控制等技術(shù)提高光轉(zhuǎn)化效率。

(3)開展多種原料利用研究，進(jìn)行不同原料下高產(chǎn)菌株的選育，及其影響因素研究，最佳工藝研究，注重利用污染源為原料的產(chǎn)氫技術(shù)研究。

(4)光合生物反應(yīng)器的研究。由于光合微生物產(chǎn)氫效率的高低與太陽光利用轉(zhuǎn)化率有直接的聯(lián)系，因此反應(yīng)器結(jié)構(gòu)研究、光照控制系統(tǒng)的研究也是制氫技術(shù)的重要課題。

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