郭書林 陳 垚 陳信忠 龔艷清 楊俊萍

（1.廈門出入境檢驗檢疫局 福建廈門 361026；2.山東正大畜禽有限公司）

奧爾森派琴蟲和北海派琴蟲ITS基因測序及同源性分析

郭書林1陳 垚2陳信忠1龔艷清1楊俊萍1

（1.廈門出入境檢驗檢疫局 福建廈門 361026；2.山東正大畜禽有限公司）

通過設(shè)計能擴增奧爾森派琴蟲和北海派琴蟲ITS序列的特異性引物，對我國東南沿海8個地區(qū)養(yǎng)殖牡蠣中常見的兩種派琴蟲相應(yīng)基因進(jìn)行擴增、克隆和測序，并進(jìn)行同源性分析。國內(nèi)不同地區(qū)奧爾森派琴蟲ITS序列的同源性超過99.3％，與國外分離株的同源性也在98.8％以上；種間同源性分析發(fā)現(xiàn)，奧爾森派琴蟲與海水派琴蟲和P.honshuensis的同源性較高，分別為94.2％和95.0％，與P.qugwadi的同源性最低，僅62.9％。深圳和三亞分離的北海派琴蟲ITS序列有18個堿基存在差異，其中ITS-1有3個堿基差異，ITS-2有15個堿基差異，而5.8S高度保守，沒有堿基差異；北海派琴蟲與其他種類之間的差異主要表現(xiàn)在ITS-1和ITS-2區(qū)域；同源性比較發(fā)現(xiàn)，北海派琴蟲的同源性在100％-97.9％之間，其中深圳北海派琴蟲的同源性較低，為97.9％。種間同源性分析表明，北海派琴蟲與奧爾森派琴蟲的同源性較高，為89.4％，其次為海水派琴蟲和P.honshuensis，與P.qugwadi同源性最低，僅71.9％。

奧爾森派琴蟲；北海派琴蟲；ITS基因；同源性分析

1 前言

派琴蟲(Perkinsosis)最先于1946年在美國墨西哥灣發(fā)病并大量死亡的美洲牡蠣(Crassostrea virginica)中被發(fā)現(xiàn)，其病原為之后命名的海水派琴蟲(Perkinsus marinus)[1]，奧爾森派琴蟲(P. olseni)是第2種被發(fā)現(xiàn)的派琴蟲。2007年，在中國東南沿海養(yǎng)殖的近江牡蠣(Crassostrea hongkongensis)體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了一種新的派琴蟲，被命名為北海派琴蟲(P. beihaiensis n.sp)，進(jìn)一步調(diào)查發(fā)現(xiàn)該地區(qū)還有其他一些牡蠣和貝類也是其易感宿主[2]。至今，國內(nèi)外較認(rèn)可的派琴蟲有7種：海水派琴蟲、奧爾森派琴蟲、北海派琴蟲、P. mediterraneus、P. qugwadi、P. honshuensis、P. chesapeaki，其中又以海水派琴蟲、奧爾森派琴蟲的流行最為廣泛[3-5]。而我國發(fā)現(xiàn)的派琴蟲則主要為奧爾森派琴蟲和北海派琴蟲，尚未發(fā)現(xiàn)海水派琴蟲[6]。派琴蟲呈世界性分布，感染牡蠣、花蛤、縊蟶、鮑魚、扇貝等多種貝類，在許多國家和地區(qū)造成了嚴(yán)重?fù)p失。1954年以來，美國切薩皮克海灣的牡蠣因為感染派琴蟲病，年產(chǎn)量由 19000 t下降至40 t[7]。

為了解派琴蟲的種類及其演化規(guī)律，近年來許多學(xué)者開展了派琴蟲種內(nèi)遺傳變異方面的研究，尤其是PCR 技術(shù)被廣泛用于派琴蟲的檢測鑒定以及分子遺傳學(xué)等方面。由于派琴蟲核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer, ITS）為非編碼基因區(qū)域，比較保守且進(jìn)化速率較快，因此可以從不太長的序列中獲得較多的信息[8]。目前在基因庫（Genbank）中已有多個派琴蟲ITS基因序列，但多數(shù)與奧爾森派琴蟲和海水派琴蟲有關(guān)，與其他種類派琴蟲ITS序列有關(guān)的資料則很少，甚至還沒有完整的ITS基因序列。本研究通過設(shè)計能擴增完整ITS序列的引物，對從我國東南沿海8個地區(qū)養(yǎng)殖牡蠣所分離的奧爾森派琴蟲和北海派琴蟲進(jìn)行擴增、克隆和測序，并進(jìn)行基因序列同源性分析。這些數(shù)據(jù)可以對派琴蟲的系統(tǒng)發(fā)生和遺傳變異提供參考，也可為發(fā)展可靠、準(zhǔn)確和敏感的分子生物學(xué)診斷技術(shù)提供依據(jù)。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 試驗樣品

2010-2011年，在福建省莆田市、泉州市、廈門市和漳州市漳浦縣，廣東省深圳市和廣州市，海南省?？谑泻腿齺喪械妊睾５貐^(qū)養(yǎng)殖太平洋牡蠣（Crassostrea gigas）中培養(yǎng)分離并進(jìn)行鑒定的陽性樣本（奧爾森派琴蟲和北海派琴蟲），保存于-70℃。

2.1.2 試劑

海洋動物組織基因組D N A提取試劑盒、2×Tap PCR MasterMix PCR試劑盒、DNA 回收試劑盒、pMG-T克隆試劑盒、DNA Marke等試劑：購自北京天根生化科技有限公司。

2.1.3 主要儀器、設(shè)備

低溫恒溫槽：寧波天恒儀器廠；低溫離心機：美國Bekman公司；PCR擴增儀：美國ABI公司；凝膠成像系統(tǒng)和電泳儀：美國Bio-Rad公司；微量核酸測定儀：德國拜發(fā)公司產(chǎn)品。

2.2 方法

2.2.1 引物的設(shè)計與合成

參照Genbank公布的派琴蟲ITS全序列，以AY305326.1、AF509333.1、AF522321.2 、AF150990.1、U07701.1、U07698.1、XM_002784213.1等為模板，通過DNAMAN比對，運用Primer5.0設(shè)計多對能擴增多種派琴蟲ITS1、ITS2和5.8S全序列的PCR通用引物。通過試驗比較，本研究最終確定的引物為：ITS-F，5'-AACAAGGTTTCCGTAGGT-3'；ITS-R，5'-ATTCAGCGGGTAATCTCA-3'。引物由上海博尚生物技術(shù)有限公司合成，稀釋至20 μM，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 樣品總DNA提取

取待檢牡蠣的鰓、外套膜、消化腺等組織共約100 mg，勻漿后根據(jù)海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行DNA的提取。DNA產(chǎn)物于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.3 PCR擴增體系及反應(yīng)條件的優(yōu)化

采用20μL反應(yīng)體系：PCR擴增體系含2×Tap PCR MasterMix 10μL，模板2.0μL，適量上下游引物ITS-F和ITS-R，補充ddH2O至20μL。

PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化：退火溫度優(yōu)化范圍為54℃-61℃，引物濃度從0.1-1μL，循環(huán)次數(shù)設(shè)置25、30、35、40次循環(huán)，確定最佳反應(yīng)條件。

2.2.4 瓊脂糖凝膠電泳分析

1.5 ％瓊脂糖凝膠，120V電壓電泳30min。凝膠于凝膠成像儀中觀察，拍照并記錄結(jié)果。

2.2.5 派琴蟲ITS 擴增產(chǎn)物回收

將派琴蟲ITS 擴增產(chǎn)物凝膠按DNA 回收試劑盒（離心柱型）操作說明回收擴增產(chǎn)物。

2.2.6 pMG-T載體的連接和轉(zhuǎn)化

按照pMG-T克隆試劑盒操作說明連接和轉(zhuǎn)化派琴蟲ITS目的PCR片段與pMG-T載體。連接體系為10μL，載體與片段的摩爾比控制在1：3-1：8。轉(zhuǎn)化后挑取白色菌落進(jìn)行搖菌擴大培養(yǎng)，PCR檢驗后對陽性克隆菌液進(jìn)行重組質(zhì)粒提取。

2.2.7 ITS基因序列測定

提取的重組質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定為陽性后，送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行測序，每個測序樣本送3份，結(jié)果相同才被采用。

2.2.8 ITS序列及同源性分析

在Genebank中搜索國內(nèi)外已經(jīng)報告的各種派琴蟲ITS全基因序列，將其與本項目獲得的派琴蟲ITS基因序列用MegAlign軟件和與DNAMAN進(jìn)行同源性分析。

3 結(jié)果與討論

3.1 ITS序列 PCR反應(yīng)條件優(yōu)化及擴增結(jié)果

通過對反應(yīng)條件的優(yōu)化，最終確定反應(yīng)條件為：ITS-F、ITS-R各0.5μL；PCR反應(yīng)程序為94℃變性5 min，然后94℃ 1 min、57℃ 1 min、72℃ 1 min，共進(jìn)行35個循環(huán)，最后72℃延伸10 min，于4℃保存。電泳結(jié)果表明，擴增產(chǎn)物長度介于750bp-1000bp之間，與實驗設(shè)計相符（見圖1）。

圖1 派琴蟲ITS電泳結(jié)果

3.2 重組質(zhì)粒測序結(jié)果

測序結(jié)果表明：所設(shè)計的引物ITS-F和ITS-R能夠有效擴增奧爾森派琴蟲和北海派琴蟲的ITS全序列，測序結(jié)果與Genbank中奧爾森派琴蟲和北海派琴蟲相應(yīng)序列比對的同源性達(dá)98％以上。

3.3 奧爾森派琴蟲的ITS序列及同源性分析

通過對福建莆田、泉州、廈門、漳浦、深圳、廣州、海口和三亞等8個沿海地區(qū)所分離到的奧爾森派琴蟲ITS序列進(jìn)行多重序列比對發(fā)現(xiàn)，其ITS序列全長713 bp，其中ITS-1為183 bp，ITS-2 為371 bp，5.8S為159 bp。經(jīng)統(tǒng)計上述地區(qū)分離的蟲株ITS序列之間合計有11個堿基存在差異，其中ITS-1堿基差異有4個，ITS-2有7個，而5.8S高度保守沒有堿基差異；將這些蟲株與其他國家和地區(qū)的派琴蟲ITS序列進(jìn)行比對發(fā)現(xiàn)，5.8S區(qū)域堿基同樣高度保守，而ITS-1和ITS-2的堿基存在較大差異，說明奧爾森派琴蟲的ITS的三段序列中5.8S具有高度的保守性。實際上，奧爾森派琴蟲與其他種類之間的差異主要表現(xiàn)在ITS-1和ITS-2區(qū)域(見圖2)。

通過種內(nèi)同源性分析，本次測序的8個地區(qū)奧爾森派琴蟲ITS序列的同源性在100％-99.3％之間，變異范圍為0.0％-0.7％；莆田和泉州，廈門和漳浦，海口和三亞奧爾森派琴蟲的ITS序列的同源性均達(dá)99.9％以上；相比而言，深圳奧爾森派琴蟲的ITS序列與其他地區(qū)的同源性較低，最低為99.3％；與世界其他國家和地區(qū)所分離的奧爾森派琴蟲ITS完整序列比較分析發(fā)現(xiàn)，廈門和漳浦的蟲株與韓國報告蟲株(AF473840)的同源性達(dá)100％，其他蟲株的種內(nèi)同源性也在98.8％以上（見圖3）；這些結(jié)果與Brown 等（2004）報道的基本一致[9]。種間同源性分析發(fā)現(xiàn)，奧爾森派琴蟲與海水派琴蟲和P. honshuensis的同源性較高，分別為91.7％-94.2％和93.8％-95.0％，與P. qugwadi的同源性最低，僅62.5％-62.9％（見表1）。

表1 各種派琴蟲之間ITS基因的同源性比較(％)

圖3 奧爾森派琴蟲 ITS基因同源性比較

3.4 北海派琴蟲的ITS序列及同源性分析

北海派琴蟲的ITS序列全長738 bp，其中ITS-1 為196 bp，ITS-2為383bp，5.8S為159bp。經(jīng)統(tǒng)計深圳和三亞的北海派琴蟲ITS序列共計有18個堿基存在差異，其中ITS-1有3個堿基差異，ITS-2有15個堿基差異，而5.8S高度保守，沒有堿基差異。與其他派琴蟲的ITS序列進(jìn)行比對后發(fā)現(xiàn)，5.8S的基因同樣高度保守，而ITS-1和ITS-2的堿基存在較大差異，也證明北海派琴蟲與其他派琴蟲之間的差異主要表現(xiàn)在ITS-1和ITS-2區(qū)域 (見圖2)。

將分離到的深圳和三亞北海派琴蟲ITS全序列與Genbank中其他國家和地區(qū)北海派琴蟲ITS序列做種內(nèi)同源性比較發(fā)現(xiàn)，各地分離的北海派琴蟲的同源性在100％-97.9％之間，同源性差異在0.0％-2.1％之間（見圖4），而深圳北海派琴蟲的同源性較低，最低為97.9％。種間同源性分析表明，北海派琴蟲與奧爾森派琴蟲的同源性較高，達(dá)87.5％-89.4％，其次為海水派琴蟲和P. honshuensis，與P. qugwadi同源性最低，僅71.1％-71.9％（見表1）。

圖 4 北海派琴蟲ITS基因同源性比較

4 結(jié)論

（1）本研究利用設(shè)計的引物成功擴增了從我國東南沿海8個地區(qū)養(yǎng)殖牡蠣所分離的奧爾森派琴蟲ITS序列。種內(nèi)同源性方面，這些地區(qū)的派琴蟲ITS基因序列同源性在100％-99.3％之間，其中深圳奧爾森派琴蟲的同源性較低（99.3％），而與其他國家和地區(qū)相比，同源性也超過98.8％；種間同源性方面，奧爾森派琴蟲與海水派琴蟲和P.honshuensis的同源性較高，與P. qugwadi的同源性較低。。

（2）利用該引物也成功擴增了在深圳和三亞分離到的北海派琴蟲的ITS全基因序列，彌補了目前基因庫中沒有北海派琴蟲ITS全基因序列的空白。種內(nèi)同源性方面，各地分離的北海派琴蟲的同源性在100％-97.9％之間，其中深圳北海派琴蟲的同源性較低（97.9％）；種間同源性方面，北海派琴蟲與奧爾森派琴蟲的同源性較高，達(dá)87.5％-89.4％，其次為海水派琴蟲和P. honshuensis，與P. qugwadi同源性最低，僅71.1％-71.9％。

（3）深圳奧爾森派琴蟲和北海派琴蟲與其他在我國分離到的奧爾森派琴蟲、北海派琴蟲相比，其同源性較低，差異性較大，估計在長期的地理隔離和不同環(huán)境的影響下，奧爾森派琴蟲和北海派琴蟲在種內(nèi)或種間形成獨特的小群遺傳品系。因此，獲得派琴蟲特定品系和位點的基因序列數(shù)據(jù)，對了解和掌握派琴蟲的種內(nèi)及種間變異情況具有重要意義。

［1］Ray S M. Historical perspective on Perkinsus marinus disease of oysters in the Gulf of Mexico[J]. Shellfish Res, 1996, 15： 9-11.

［2］Jessica A MOSS, Jie Xiao. Description of Perkinsus beihaiensis n. sp., a new Perkinsus sp. Parasite in Oysters of Southern China[J]. J Eukaryot Microbiol, 2008, 55(2)： 117-130.

［3］Ford S E. Range extension by the oyster parasite Perkinsus marinus into the North Eastern United States： response to climate change?[J]. Shellfish Res, 1996, 15： 45-56.

［4］Burreson E M, Alvarez R S, Martínez V V. Perkinsus marinus (Apicomplexa)as a potential source of oyster Crassostrea virginica mortality in coastal lagoons of Tabasco, Mexico[J]. Dis Aquat Org, 1994, 20： 77-82.

［5］Soniat T M. Epizootiology of Perkinsus marinus disease of eastern oysters in the Gulf of Mexico[J]. Shellfish Res, 1996, 15： 35-43.

［6］ 陳垚，陳信忠，郭書林. 3種牡蠣原蟲的流行情況調(diào)查及多重PCR檢測方法[J].福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報，2012，41(4)： 509-513.

［7］Ulrich P N, Ewart J W, Marsh AG. Prevalence of Perkinsus marinus, Haplosporidium nelsoni (MSX), and QPX in Bivalves of Delaware’s Inland Bays and Quantitative, High-Throughput Diagnosis of Dermo by QPCR[J]. J Eukaryot Microbiol, 2007, 54(6)： 520-526.

［8］Chu K H, Li C P, Ho H Y. The first internal transcribed spacer (ITS-1) of ribo somalDNA as smo lecularmarker for phylogenetic and population an analysis in crustacea [J]. Mar bio technol, 2001, 3：355- 361.

［9］Brown G, Hudson K L, Reece K S. Genetic variation at the ITS and ATAN loci among and within cultured isolates of Perkinsus marinus[J]. Eukaryot Microbiol, 2004, 51： 312-320.

Sequencing and Homology Analysis of ITS Gene of P. olseni and P. beihaiensis

Guo Shulin1, Chen Yao2, Chen Xinzhong1, Gong Yanqing1, Yang Junping1
(1.Xiamen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Xiamen, Fujian, 361026; 2.Shandong Zhengda Livestock Co. Ltd.)

By desiging specifi c primers which can amplify ITS sequences of P. olseni and P. beihaiensis, Crassostrea gigas coming form 8 different farming areas were detected, cloned, sequenced and homology analyzed. The results showed that the ITS sequence homology of P. olseni was higher than 99.3％ in different areas of China, and higher than 98.8％ compared with foreign isolates. The interspecific homology analysis showed, P. olseni had a higher homology with P. marinus and P. honshuensis, were 94.2％ and 95.0％ respectively, and had the lowest homology with P. qugwadi, only 62.9％. The ITS sequences of P. beihaiensis isolated from Shenzhen and Sanya had 18 base differences, ITS-1 had 3, ITS-2 had 15, and 5.8s had no differences respectively. The differences of P. beihaiensis and other Perkinsosis were showed in ITS-1 and ITS-2 mainly. P. beihaiensis isolated from Shenzhen had lower homology, only 97.9％, since the range was 100％-97.9％. The interspecifi c homology analysis showed, P. beihaiensis had a higher homology with P. olseni, was 89.4％, followed by P. marinus and P. honshuensis, and had the lowest homology with P. qugwadi, only 71.9％.

P. olseni; P. beihaiensis; ITS Gene; Homology Analysis

S944.4

福建省自然科學(xué)基金項目（2012J05065）；國家質(zhì)檢公益專項項目（201210055）