王德蓮 劉冬虹 黃宇鋒 聶炎炎 陳立堅

（廣州市質(zhì)量監(jiān)督檢測研究院 廣東廣州 510110）

大豆油中DNA提取方法及PCR檢測技術(shù)研究

王德蓮 劉冬虹 黃宇鋒 聶炎炎 陳立堅

（廣州市質(zhì)量監(jiān)督檢測研究院 廣東廣州 510110）

通過比較CTAB法、SDS法、《SN/T1203-2010》標準方法以及試劑盒法等4種方法，發(fā)現(xiàn)試劑盒方法能夠快速提取到大豆油中的DNA，并用實時熒光PCR方法成功檢測到了大豆油中的大豆內(nèi)源基因和外源基因。

大豆油；DNA提?。籔CR擴增

1 前言

自從轉(zhuǎn)基因大豆被批準種植以后，世界上每年的種植面積都在增加，至今已增加到5000多萬公頃，并且還有增加的趨勢。中國是轉(zhuǎn)基因大豆的主要進口國家之一。進口轉(zhuǎn)基因大豆多用于提取大豆油。2002年我國農(nóng)業(yè)部發(fā)布的《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物標識管理辦法》及衛(wèi)生部出臺的《轉(zhuǎn)基因食品衛(wèi)生管理辦法》規(guī)定，包括大豆、玉米、油菜、棉花、番茄5類17種產(chǎn)品以及以轉(zhuǎn)基因動植物、微生物或者其直接加工品為原料生產(chǎn)的食品和食品添加劑必須進行標識[1,2]。除此之外，食用植物油的核酸檢測技術(shù)在植物油原料成分鑒定、摻假食用油及潲水油的鑒定領(lǐng)域的需求也日顯突出[3]。人們?nèi)粘Ｊ秤玫拇蠖褂投酁榫珶挻蠖褂?，DNA提取非常困難，導致后續(xù)的轉(zhuǎn)基因檢測很難實現(xiàn)。因此，研究精煉大豆油中DNA的的提取方法，不僅對實施食品標簽和標識，保護消費者的知情權(quán)和選擇權(quán)具有重要意義，同時對食用油脂的摻假檢測也具有重要的參考意義。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 原料

本研究所用的大豆原油采自糧油加工廠，共5個樣品，散裝，均是以轉(zhuǎn)基因大豆為原料加工而成。大豆精煉油共52個樣品，其中40個購自大型和小型超市，標識顯示為轉(zhuǎn)基因大豆加工而成。12個購自于糧油市場，散裝，不確定是否為轉(zhuǎn)基因大豆加工而成。表1是部分樣品的信息。

表1 大豆原油和大豆精煉油的樣品信息

（續(xù)表）

2.1.2 主要試劑

十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）、十二烷基硫酸鈉（SDS）、氯仿，異戊醇（24：1）、TE緩沖液、異丙醇、購自Promage公司。DNA提取試劑盒：Wizard Magnetic DNA Purification System for Food 、DNA Purification Kit。PCR反應體系中的10×Exbuffer，dNTP，TaqDNA聚合酶購自TAKARA，所用引物由Invitrogen公司合成。

2.1.3 主要儀器

3-30K離心機：SIGMA公司；DK-8D電熱恒溫水槽：上海精宏實驗設(shè)備有限公司；HS501D往復式振蕩機：IKA公司；Sartorius電子天平：北京賽多利斯天平有限公司；A10超純水儀：MILLIPORE公司；Smartspecplus 核酸蛋白分析儀：BIO-RAD公司；eppendorf移液器：德國愛本德公司；ABI7300實時熒光PCR儀：美國AB公司

2.2 方法

2.2.1 大豆油DNA的提取與純化

2.2.1.1 CTAB法 見文獻[4]

所有樣品均經(jīng)過前處理后再采用參考文獻的方法進行DNA提取，前處理方法參照標準方法。樣品量分別為大豆原油500mL，精煉大豆油3L。

2.2.1.2 SDS法 見文獻[5]

所有樣品均經(jīng)過前處理后再采用參考文獻的方法進行DNA提取，前處理方法參照標準方法。樣品量分別為大豆原油500mL，精煉大豆油3L。

2.2.1.3 標準SN/T1203-2010《食用油脂中轉(zhuǎn)基因植物成分實時熒光PCR定性檢測方法》

以下簡稱標準方法。DNA前處理方法與標準一致，標準中提到的試劑盒由于已經(jīng)停產(chǎn)無法得到，而標準中提到可以用與之等效的DNA提取試劑盒，筆者采用了Promega的DNA Purification Kit進行后續(xù)的DNA提取。樣品量分別為大豆原油500mL，精煉大豆油3L。

2.2.1.4 試劑盒法

采用Promage公司的Wizard Magnetic DNA Purification System for Food試劑盒，在操作上稍作修改，具體過程如下：取40 mL待檢大豆油于50 mL離心管中，取4管，共160 mL油樣。在每個離心管中加入試劑盒中提供的Buffer A 2 mL，在振蕩器上充分震蕩混勻5min，再加入1 mL Buffer B，在振蕩器上充分震蕩混勻5 min。室溫放置10min。加入3 mL precipitation solution，振蕩混勻10min。4000r/min離心30min，棄上層油樣。如需提取更多的DNA，可在該步驟繼續(xù)加入油樣，混勻，離心后棄上層油樣，之后用移液器小心吸取水相到另外一支50 mL離心管中，加入100 μL Magnesil PMPS，混勻。再加入0.9體積的異丙醇，顛倒混勻，室溫放置1h，期間顛倒5次。DNA吸附于磁珠上，上磁力架除去液相，1min后倒掉液體，加入1 mL70％乙醇洗滌磁珠，為避免管壁上剩余油脂的干擾，將乙醇和磁珠的混合物轉(zhuǎn)移到新的1.5 mL的離心管中，之后上磁力架，1min后吸掉液體，重復此步驟兩次。65℃干燥磁珠，之后加入100 μL TE緩沖液,旋渦混勻，65℃溫浴10min，上磁力架，1min后轉(zhuǎn)移液體到另一支1.5 mL離心管中，為進一步去除影響PCR擴增的物質(zhì)，需再加入50 μL Magnesil PMPS，重復異丙醇沉淀、乙醇洗滌和磁珠吸附步驟，最后加入50 μL TE洗脫磁珠，將洗脫液轉(zhuǎn)移至0.6mL的離心管中，該管中的液體即為已經(jīng)提取好的DNA。-20℃保存該管，留待下一步PCR分析用。所有DNA提取過程均設(shè)置陽性對照、空白對照和陰性對照作為質(zhì)量控制。

2.2.2 實時熒光PCR檢測

用引物和探針包括大豆內(nèi)源基因（Lectin），外源基因（35S，NOS,EPSPS）來自文獻[6]。經(jīng)多次PCR擴增最終確定最佳反應體系（見表1）和最佳反應條件為50℃ 2min，95℃ 10min，95℃15s，58℃ 1min，40-45個循環(huán)。

表2 實時熒光PCR反應體系

3 結(jié)果與分析

3.1 DNA提取

表3 4種大豆油DNA提取方法的結(jié)果比較

本實驗室采用CTAB法、SDS法、標準方法、試劑盒法對5個大豆原油、52個大豆精煉油DNA進行提取發(fā)現(xiàn)，上述四種提取方法均能從大豆原油中提取到DNA，提取成功率為100％。其DNA提取濃度約18.2-32.6 ng/μL，DNA提取OD260/280值約為1.32-1.78,其中標準方法和試劑盒法的提取濃度高于CTAB法、SDS法, OD260/280值也高于前兩種方法。但是對于精煉大豆油DNA的提取，四種方法所提取的DNA用核酸蛋白分析儀進行測量時發(fā)現(xiàn)同一樣品的平行試驗數(shù)值差異很大，無法測得有效的DNA濃度與OD260/280值。分析認為是因為精煉大豆油是大豆原油經(jīng)過濾、脫膠、脫酸、脫色、脫臭等加工工藝的深加工產(chǎn)品，其中的核酸被嚴重降解，含量非常低[3]，且在核酸的提取過程中也會導致核酸的部分損失。導致所提取的DNA含量達不到儀器的檢測底限，無法得到穩(wěn)定的數(shù)據(jù)。但DNA的提取質(zhì)量可以在實時熒光PCR檢測時得到反映。此外CTAB法、SDS法和標準方法所用樣品量都較大(3L），且樣品在提取之前都需要進行大量的前處理工作，耗時長。試劑盒法所用樣品量少（160mL），且不需要進行大量的前處理，耗時短。

3.2 實時熒光PCR擴增

3.2.1 大豆原油實時熒光PCR擴增

圖1 大豆原油中大豆內(nèi)源基因（lectin）實時熒光PCR結(jié)果

圖2 大豆原油中大豆外源基因CP4-EPSPS的實時熒光PCR結(jié)果

針對大豆原油中的大豆內(nèi)源基因（lectin）和外源基因CP4-EPSPS的實時熒光PCR檢測結(jié)果分別見圖1與圖2。從結(jié)果中可看到4種方法從大豆原油中提出的DNA的實時熒光PCR能產(chǎn)生明顯的擴增曲線，且四種方法針對大豆原油所提取的DNA的實時熒光PCR時Tm值差異不大，其中Tm值最低的為試劑盒法所提取的DNA。

3.2.2 大豆精煉油實時熒光PCR擴增

圖3 精煉大豆油中大豆內(nèi)源基因（lectin）實時熒光PCR結(jié)果

圖4 精煉大豆油中大豆外源基因CP4-EPSPS實時熒光PCR結(jié)果

針對大豆精煉油中的大豆內(nèi)源基因（lectin）和外源基因CP4-EPSPS的實時熒光PCR檢測結(jié)果分別見圖3與圖4。可以看到，CTAB法和SDS法從精煉大豆油中提取的DNA經(jīng)實時熒光PCR均不能產(chǎn)生明顯的擴增曲線。標準方法和試劑盒法提取的DNA經(jīng)實時熒光PCR能產(chǎn)生明顯的擴增曲線。相比較，試劑盒法所提取的DNA的Tm值明顯小于標準方法所提取的DNA的Tm值，而這種差異在大豆原油的擴增結(jié)果中不明顯。

本研究采用4種核酸提取方法對52個大豆精煉油進行了DNA提取，通過實時熒光PCR檢測發(fā)現(xiàn)，CTAB法和SDS法均未能從52個樣品中提取到能用于實時熒光檢測的DNA。標準方法和試劑盒法都從部分樣品中提取到了目標DNA。其中采用標準方法從52個樣品中成功提取到了16個樣品的DNA.提取成功率為30.8％。試劑盒法從52個樣品中成功提取到了35個樣品的DNA，提取成功率為67.3％。值得注意的是35個樣品中全部檢測到了外源基因，說明這些樣品所用原料皆為轉(zhuǎn)基因大豆。其次，用試劑盒法未能提取到用于實時熒光PCR檢測的DNA的17個樣品，采用標準方法同樣也未能提取到足夠用于PCR檢測的DNA。具體信息見表4。

表4 對52個大豆精煉油采用四種DNA提取方法的實時熒光PCR結(jié)果比較

4 結(jié)論

（1）CTAB法和SDS法均能夠從大豆原油中提取到目標DNA，但是前處理復雜、費時。而且對于精煉大豆油DNA的提取上述兩種方法均不適用。

（2）標準方法和試劑盒法均能從大豆原油和大豆精煉油中提取到目標DNA，且兩種方法在大豆原油的提取中差異不明顯。在針對精煉大豆油的DNA提取中，從實時熒光PCR結(jié)果可以明顯的看到標準方法和試劑盒法所提取的DNA結(jié)果差異較大。首先，從DNA提取的成功率來看，標準方法從52個樣本中成功的提取到了16個樣本的目標DNA，提取成功率為30.8％。試劑盒法從52個樣本中成功提取到了35個樣本的目標DNA，提取成功率為67.3％，其提取成功率約為標準方法的2倍。其次，標準方法對樣品量的需求大（至少3L），前處理耗時長。試劑盒法所需樣品量小(160mL)，約為標準方法的1/20。且不需要對樣品進行前處理，提取周期短，更具有時效性。因此，筆者認為試劑盒法提取精煉大豆油的DNA明顯優(yōu)于標準方法。

（3）雖然試劑盒法在樣品檢出率方面有所提高。但該方法的提取率也未能達到100％，說明在精煉大豆油DNA提取方法上還有待進一步的研究。

（4）本研究所采用的DNA提取試劑盒法，不僅適用于精煉大豆油的DNA提取，而且適用于實時熒光PCR檢測。對食用油脂的品種鑒定和摻假檢測都具有一定的參考意義。

［1］ 農(nóng)業(yè)部. 農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物標識管理辦法. 2002.

［2］ 農(nóng)業(yè)部. 轉(zhuǎn)基因食品衛(wèi)生管理辦法. 2002.

［3］ 楊冬燕，鄧漢超，楊永存, 等，精煉食用植物油PCR檢測技術(shù)研究[J]. 中國衛(wèi)生檢驗雜志，2010,20（4）：700-702.

［4］Innocenzo Muzzalupo, Massimiliano Pellegrino, Enzo Perri. Detection of DNA in virgin olive oils[J]. Res Technol, 2007, 224：469-475.

［5］ 許冬倩，郝義波. 一種有效地油脂DNA的提取方法[J]. 食品研究與開發(fā)，2008,29（10）：42-45.

［6］SN/T 1203-2010 食用油脂中轉(zhuǎn)基因植物成分實時熒光PCR定性檢測方法[S].

DNA Extraction and PCR Amplifi cation for Soybean Oil

Wang Delian, Liu Donghong, Huang Yufeng, Nie Yanyan, Chen Lijian
(Guangzhou Quality Supervision and Testing Institute, Guangzhou, Guangdong, 510110)

Facing to the diffi culty in DNA refi ning from soybean oils, we compared 4 methods of DNA Extraction, including CTAB, SDS, SN/T1203-2010 and reagent to determine an optimized method. It was found that the reagent method was a rapid and suffi cient method for DNA extraction from soybean oil. We also detected the DNA of both endogenous and exogenous genes using real-time fl uorescent quantitative PCR.

Soybean Oil; DNA Extraction; PCR Amplifi cation

S565.1

廣州市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局科技項目（2013kj33）