蔡祖艾王 琪張 瑋李 力 尹富強

作者單位：530021 南寧 廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院婦瘤科；△廣西醫(yī)科大學研究生學院；1廣西腫瘤防治研究所實驗研究部；2廣西醫(yī)科大學醫(yī)學科學實驗中心

基礎研究

以基因通路富集法探索上皮性卵巢癌多藥耐藥相關生物學通路及功能性SNP位點

蔡祖艾△王 琪1張 瑋1李 力 尹富強2

作者單位：530021 南寧 廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院婦瘤科；△廣西醫(yī)科大學研究生學院；1廣西腫瘤防治研究所實驗研究部；2廣西醫(yī)科大學醫(yī)學科學實驗中心

目的 借助生物信息學工具探索上皮性卵巢癌多藥耐藥相關的生物學通路及SNP位點。方法 從基因表達綜合數(shù)據(jù)庫的GSE13813芯片數(shù)據(jù)中篩選出初次術后經(jīng)鉑類和紫杉醇類聯(lián)合化療的73例患者，其中22例為化療耐藥，51例為化療敏感。采用PLINK軟件進行等位基因關聯(lián)檢驗分析，對差異表達的SNP位點（P＜0.05）采用WebGestalt在線工具和DAVID進行基因通路富集分析，并篩選與上皮性卵巢癌多藥耐藥相關的共同通路。利用SciMiner工具檢索上皮性卵巢癌多藥耐藥研究相關基因，并用上述方法進行通路分析以交叉驗證。最后對通路涉及的SNP及其連鎖位點采用Snpfunc網(wǎng)站進行功能預計。結(jié)果 敏感組和耐藥組共有4 978個差異表達的SNP位點。通路分析顯示黏附分子、鈣離子信號和ErbB信號途徑與上皮性卵巢癌多藥耐藥相關。其中ErbB信號在文獻挖掘通路分析中得到交叉驗證。11個連鎖SNP可通過異常剪接、編碼非同義氨基酸等方式改變基因功能，從而影響通路在上皮性卵巢癌聯(lián)合化療中的作用。結(jié)論通過基因通路富集方法找到3個與上皮性卵巢癌多藥耐藥相關的通路及一批可能影響通路的功能性SNP位點。檢測這些位點有助于預測上皮性卵巢癌聯(lián)合化療的反應。

卵巢腫瘤；上皮性卵巢癌；多藥耐藥；單核苷酸多態(tài)性；SNP芯片；基因通路富集分析

臨床上大部分晚期上皮性卵巢癌患者對初次化療較敏感，但最終約有80%的患者對化療耐藥，5年生存率一直徘徊在30%左右［1］。腫瘤細胞的多藥耐藥（multidrug resistance，MDR）是指腫瘤細胞在接觸一種抗癌藥物后，不但對該藥產(chǎn)生耐藥，而且還對其他結(jié)構(gòu)和作用機制不同的藥物也產(chǎn)生抗藥性，出現(xiàn)交叉耐藥，多藥耐藥是造成腫瘤化學藥物治療失敗的主要原因［2］。單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）占人類基因組所有變異的90%以上，對于生物醫(yī)學研究有著極大的價值［3］。然而既往對卵巢癌耐藥相關SNP的研究結(jié)果經(jīng)常不盡一致，實驗樣本以及研究位點過少可能是其主要原因。Bolton等［4］建議加大樣本量和同時檢測多個位點如SNP芯片等方法來克服其不足。本生物信息學研究試圖利用基于SNP的基因通路富集方法，從上皮性卵巢癌聯(lián)合化療芯片數(shù)據(jù)中篩選出一批與上皮性卵巢癌多藥耐藥相關的通路及功能性SNP位點，有望為臨床預測上皮性卵巢癌聯(lián)合化療效果提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 芯片數(shù)據(jù)來源

在基因表達綜合數(shù)據(jù)庫（gene expression omnibus，GEO）采用“ovarian cancer”、“drug resistance”及“SNP array”關鍵詞檢索卵巢癌耐藥相關芯片數(shù)據(jù)。經(jīng)閱讀原文最終納入GSE13813（affymetri×50 K芯片）共73個經(jīng)鉑類和紫杉醇類聯(lián)合化療的晚期上皮性卵巢癌樣本。

1.2 芯片差異表達SNP的通路分析

1.2.1 芯片數(shù)據(jù)質(zhì)量控制及差異表達SNP的選擇

應用plink軟件采用次要等位基因頻率（minor allele frequency，MAF）0.01為標準對原始數(shù)據(jù)進行質(zhì)量控制，并刪除與性染色體相關的SNP位點。選取經(jīng)等位基因關聯(lián)檢驗（allelic test）結(jié)果中的差異SNP位點（P＜0.05）進行后續(xù)通路分析。

1.2.2 多藥耐藥相關通路的選擇 對上述差異表達SNP位點和基因分別采用WebGestalt在線工具和DAVID進行通路分析。以校正后的P＜0.05并結(jié)合文獻篩選上皮性卵巢癌多藥耐藥相關生物學通路。

1.3 文獻檢索驗證

利用SciMiner文獻挖據(jù)在線工具，采用“ovarian cancer”和“multidrug resistance”主題詞初步檢索與上皮性卵巢癌多藥耐藥相關的基因。分別采用Web-Gestalt在線工具和DAVID進行通路分析，再以校正后的P＜0.05篩選共同的生物學通路。

1.4 多藥耐藥相關通路基因的SNP位點功能預測

將上述篩選出的通路中基因包含的SNP位點及其連鎖位點采用Snpfunc網(wǎng)站（http：//snpinfo.niehs. nih.gov/cgi-bin/snpinfo/snpfunc.cgi）進行功能預測。

1.5 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件處理實驗數(shù)據(jù)并進行分析。兩個樣本均數(shù)的比較采用t檢驗，兩個樣本率的比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。采用PLINK軟件 1.07版（http：//pngu.mgh.harvard.edu/ purcell/plink/）的等位基因關聯(lián)檢驗比較各等位基因型在組間分布頻率的差異，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。采用WebGestalt和DAVID進行基因通路富集分析，校正后P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 化療敏感組和耐藥組患者臨床病理特征的比較

提取的73例標本均為無血緣關系的晚期高級別漿液性上皮性卵巢癌（high grade serous ovarian cancer，HGSOC），初次手術前無放化療史，術后接受6～8個常規(guī)療程的鉑類聯(lián)合紫杉醇類化療。術后化療完畢若疾病無復發(fā)/進展的時間大于6個月為化療敏感，小于6個月則為化療耐藥。分期采用FIGO病理分級標準，全部患者均為Ⅲ～Ⅳ期。腫瘤殘存直徑≤1 cm為手術滿意，＞1 cm則為不滿意［5］。73例中敏感組51例，中位年齡57歲，其中6例年齡數(shù)據(jù)缺失。耐藥組22例，中位年齡57歲，其中1例年齡數(shù)據(jù)缺失。以腫瘤殘存直徑1 cm為標準，敏感組中有34例為手術滿意，15例為手術不滿意，2例腫瘤殘存直徑數(shù)據(jù)缺失。耐藥組中有12例為手術滿意，8例為手術不滿意，2例腫瘤殘存直徑數(shù)據(jù)缺失。兩組臨床病理參數(shù)的差異比較無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

2.2 數(shù)據(jù)質(zhì)控及關聯(lián)分析結(jié)果

原始芯片共有58 530個SNP檢測位點，采用maf=0.01為標準并刪除性染色體相關位點后剩余53 956個SNP位點納入后續(xù)分析。等位基因關聯(lián)分析結(jié)果顯示共有4 978個SNP位點組間差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），其在染色體分布的位置如圖1。

表1 73例中化療敏感和化療耐藥患者的臨床病理特征比較

WebGestalt和DAVID分析結(jié)果顯示這些位點屬于268個不同基因。通路分析結(jié)果顯示兩者相同的生物學通路有5個，在丟棄明顯與上皮性卵巢癌耐藥無關的通路后剩余3個，包括細胞黏附分子、鈣離子信號途徑和ErbB信號途徑。見表2。

圖1 差異SNP位點曼哈頓圖注：橫軸為染色體序號，縱軸為-lgp值。

表2 芯片數(shù)據(jù)通路分析與多藥耐藥相關的通路

2.3 文獻挖據(jù)的基因通路分析結(jié)果

利用SciMiner在線工具初步挖掘出279篇可能與上皮性卵巢癌多藥耐藥相關的文獻，包括233個非重復基因。WebGestalt和DAVID分析結(jié)果顯示兩者相同的通路有33個，在丟棄明顯與上皮性卵巢癌耐藥無關的通路后剩余13個，其中ErbB信號途徑與芯片數(shù)據(jù)的通路分析結(jié)果重合。見表3。

2.4 多藥耐藥相關通路基因的SNP位點功能預測

通過上述分析最終發(fā)現(xiàn)3個可能與上皮性卵巢癌多藥耐藥相關的通路，即細胞黏附分子、鈣離子信號途徑和ErbB信號途徑，其通路和包含的基因見表4。

對各通路基因包含的SNP位點及其連鎖位點（r2≥0.8）利用Snpfunc進行功能預測，共發(fā)現(xiàn)11個功能性位點。見表5。

表3 文獻挖掘和通路分析與多藥耐藥相關的生物學通路

表4 上皮性卵巢癌多藥耐藥相關的通路及包含的非重復基因

表5 多藥耐藥相關通路的功能性SNP位點

（續(xù)表）

3 討論

自90年代以來卵巢癌5年總體生存率一直徘徊在20%～30%，臨床上對耐藥尤其是多藥耐藥治療十分棘手。SNP占人群基因組變異的90%以上，對預測個體藥物差異反應具有重要價值。經(jīng)過檢索GEO數(shù)據(jù)庫，我們選取了GSE13813芯片數(shù)據(jù)中73個與上皮性卵巢癌多藥耐藥相關高級別漿液性上皮性卵巢癌癌樣本，關聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)4 978個SNP位點在組間的差異有統(tǒng)計學意義，分別屬于268個非重復基因?；蛲贩治霭l(fā)現(xiàn)細胞黏附分子、鈣離子信號途徑和ErbB信號途徑的差異有統(tǒng)計學意義。

ErbB酪氨酸受體家族偶聯(lián)胞外生長因子配體激活胞內(nèi)信號通路調(diào)節(jié)細胞增生、分化、移動及生存。該受體家族（包括EFGR/ErbB-1/HER-1、ErbB-2/HER-2、ErbB-3/HER-3和ErbB-3/HER-3等）在激活后形成同源或異源二聚體，導致自身磷酸化激活，進而激活MAPK和PI3K等下游通路。Huang等［6］通過對比分析晚期卵巢癌患者與正常卵巢上皮的干細胞基因組的基因譜情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SP1（side population，SP1）和SP2卵巢癌中干細胞與正常上皮細胞中的干細胞相比，分別有1 349個和509個差異表達的基因。這些基因大部分與蛋白受體結(jié)合、激酶活性和化療抵抗相關，基因通路富集分析發(fā)現(xiàn)其涉及ECM、ErbB信號途徑等通路。由于卵巢癌干細胞具有多藥耐藥特性，因此推測這些關鍵通路可能也參與上皮性卵巢癌多藥耐藥過程。也有研究證實ErbB信號途徑包含的多個基因與卵巢癌多藥耐藥相關。Wu等［7］研究發(fā)現(xiàn)多藥耐藥卵巢癌C13K細胞系轉(zhuǎn)染野生型PTEN基因后，該基因表達增加進而通過降低磷酸化Akt基因的表達而恢復對順鉑藥物的敏感性。Kim等［8］研究c-myc基因表達在多藥耐藥卵巢癌中使用腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體（TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL）治療中的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)c-myc基因表達上升在逆轉(zhuǎn)卵巢癌多藥耐藥中發(fā)揮重要作用。此外該通路中其他基因如EGF、EGFR、PRKCA和SRC等也與卵巢癌多藥耐藥相關［9～12］。

本實驗通過芯片分析發(fā)現(xiàn)細胞黏附分子、鈣離子信號途徑可能與上皮性卵巢癌多藥耐藥相關。細胞黏附分子是一群表達于細胞表面的蛋白，主要包括整合素家族、免疫球蛋白超家族、選擇素及鈣黏蛋白4類，它們在細胞生成、免疫反應和炎癥等生物學過程發(fā)揮重要作用。細胞黏附介導的耐藥（cell adhesion mediated drug resistance，CAM-DR）中整合素家族研究較為廣泛。已有研究證實整合素與卵巢癌、多發(fā)性骨髓瘤、結(jié)腸癌等多個惡性腫瘤化療耐藥相關，涉及卡鉑、長春堿、5-FU等藥物［13～15］。此外，鈣黏蛋白、選擇素等家族也參與多種癌癥及耐藥的發(fā)生。

鈣離子可通過門控通道由細胞外部流入細胞內(nèi)，也可由磷酸三肌醇受體（IR3Rs）或ryanodin受體調(diào)節(jié)胞內(nèi)"鈣離子池"釋放入細胞內(nèi)。已有研究證實L型電壓門控鈣離子通道（voltage-gated calcium channel，VGCC）異?？蓪е路切〖毎伟﹣喛寺〖毎档挚苟喾N化療藥物，鈣離子通道阻斷劑維拉帕米（verapamil）則可以在一定程度上逆轉(zhuǎn)多藥耐藥［16］。

功能性SNP位點可以通過影響轉(zhuǎn)錄因子或miRNA結(jié)合、異常剪接、編碼非同義氨基酸等方式改變基因功能，從而可能影響患者對化療敏感性。雖然由于芯片檢測位點和樣本較少，導致本生物信息學探索出的上皮性卵巢癌多藥耐藥相關通路及功能性SNP位點有限，但利用芯片檢測比傳統(tǒng)方法更為高效。Meng等［17］應用SNP芯片對FGF-FGFR軸多個基因多態(tài)性位點進行研究，發(fā)現(xiàn)包括FGF18（rs3806929）在內(nèi)的4個與上皮性卵巢癌多藥耐藥相關的SNP。Liang等［18］借助芯片研究與microRNA處理相關的基因多態(tài)性位點，發(fā)現(xiàn)了包括ALDH5A1（rs12190214）等在內(nèi)的17個與上皮性卵巢癌多藥耐藥相關的功能性SNP位點。

本實驗通過基于SNP的基因通路富集分析，初步發(fā)現(xiàn)3個通路包括多個SNP位點可能與上皮性卵巢癌多藥耐藥相關。通過檢測這些多態(tài)性位點有助于從分子水平闡明上皮性卵巢癌多藥耐藥的機制，從而為預測化療敏感性及個體化治療提供理論基礎。

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［2014-04-20收稿］［2014-06-02修回］［編輯 阮萃才］

Using gene-set enrichment pathway analysis to identify signaling pathways and functional single nucleotide polymorphisms related to multi-drug resistance in epithelial ovarian cancer

CAI Zu-ai△，WANG Qi1，ZHANG Wei1，LI Li，YIN Fu-qiang2（Department of Gynecologic Oncology，Affiliated Tumor Hospital of Guangxi Medical University；△Graduate School of Guangxi Medical University；1Department of Research，Guangxi Cancer Institute；2Medical Scientific Research Centre，Guangxi Medical University，Nanning 530021，P.R.China）

YIN Fu-qiang.E-mail：yinfq@mail2.sysu.edu.cn

Objective This bioinformatics study aimed to explore signaling pathways and functional single nucleotide polymorphisms（SNPs）related to multidrug resistance（MDR）in epithelial ovarian cancer.Methods Patients with ovarian cancer treated by platinum and paclitaxel after primary surgery were selected from the SNP array（GSE13813）in the Gene Expression Omnibus（GEO）dataset. PLINK software and allelic tests were applied to identify SNPs significantly related to MDR（P＜0.05），which were further analyzed online using gene-set enrichment pathway analysis（GSEA）in WebGestalt and DAVID.SciMiner was used to search for all genes potentially related to MDR in patients with epithelial ovarian cancer，and the corresponding functional pathways were explored using WebGestalt and DAVID.Finally，the on-line software Snpfunc was used to predict functions of SNPs in MDR-related pathways as well as of their partners in linkage disequilibrium.Results GSEA of 4978 significant SNPs from 22 platinum-resistant and 51 platinumsensitive patients identified cell adhesion molecules and calcium-and ErbB-dependent signaling pathways as being potentially relatedto MDR.Literature analysis supported the association between the ErbB signaling pathway and MDR.Function prediction suggested that 11 functional SNPs may modify gene function by causing aberrant splicing or amino acid substitutions，potentially affecting response to combination chemotherapy.Conclusion Using GSEA，we identified three possible MDR-related signaling pathways and 11 functional SNPs that may help predict responses to platinum-based combination chemotherapy for epithelian ovarian cancer. These findings should be confirmed in future studies.

Ovarian neoplasm；Epithelial ovarian cancer；Multidrug resistance；Single nucleotide polymorphism；SNP array；Geneset enrichment analysis

R737.31

A

1674-5671（2014）02-06

10.3969/j.issn.1674-5671.2014.02.06

廣西醫(yī)學科學實驗中心開放基金資助項目（KFJJ2011-15）【通信作者】尹富強。E-mail：yinfq@mail2.sysu.edu.cn