田學(xué)軍

【摘 要】目的：分析聚乙二醇共價(jià)修飾藥用蛋白質(zhì)的分析方法，了解其生物意義。方法：本組主要對(duì)2011年7月至2013年7月期間聚乙二醇共價(jià)修飾藥用蛋白質(zhì)生物價(jià)值的研究資料作回顧分析。結(jié)果：液相色譜方法、電泳方法、分光光度法等較為常用，能夠清楚地了解到聚乙二醇對(duì)蛋白質(zhì)表面自由氨基的修復(fù)作用。結(jié)論：采用聚乙二醇共價(jià)修飾藥用蛋白質(zhì)，有利于降低使用藥用蛋白治療出現(xiàn)不良用藥癥狀，提高臨床療效。

【關(guān)鍵詞】聚乙二醇 液相色譜方法 電泳方法 分光光度法

聚乙二醇（polyethylene glycol ，PEG ）為高分子化合物，親水性強(qiáng)、水動(dòng)力體積大、無(wú)免疫原性，可通過(guò)對(duì)藥用蛋白修飾作用促使藥物水中溶解及生物分配特性變化、抑制酶解、促使空間屏障的產(chǎn)生，提升藥物作用效果[1]。為了解PEG修飾藥用蛋白的特點(diǎn)，本文對(duì)2011年7月至2013年7月期間聚乙二醇共價(jià)修飾藥用蛋白質(zhì)生物價(jià)值的研究資料作回顧分析，現(xiàn)報(bào)道如下。

1資料與方法

1.1臨床資料

整理分析2011年7月至2013年7月期間聚乙二醇共價(jià)修飾藥用蛋白質(zhì)生物價(jià)值的研究資料。

1.2方法

結(jié)合近年來(lái)關(guān)于聚乙二醇共價(jià)修飾藥用蛋白質(zhì)生物價(jià)值的研究資料，對(duì)PEG共價(jià)修飾藥用蛋白分析領(lǐng)域的液相色譜法、分光光度法及電泳法等特點(diǎn)及臨床價(jià)值進(jìn)行研究分析[2]。

1.3觀察指標(biāo)

觀察不同修飾分析方法下的蛋白修飾度、特定位點(diǎn)修飾程度、偶聯(lián)不同PEG數(shù)量的蛋白相對(duì)含量。

1.4臨床價(jià)值評(píng)定

分析不同修飾分析方法難度及可操作性，以了解不同修飾分析方法的臨床價(jià)值[3]。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本次數(shù)據(jù)采用SPSS16.0軟件對(duì)本研究的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)的分析，計(jì)數(shù)資料的對(duì)比應(yīng)用卡方檢驗(yàn)，而計(jì)量資料的對(duì)比應(yīng)用t檢驗(yàn)，P<0.05時(shí)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

液相色譜方法、電泳方法、分光光度法為PEG共價(jià)修飾藥用蛋白常見分析手段：

2.1 分光光度法應(yīng)用

此種分析方法源于20世紀(jì)70年代中期，由于三硝基苯磺酸和存在于蛋白表層的賴氨酸反應(yīng)所產(chǎn)生的三硝基苯衍生物可被有選擇地吸收，從而可以計(jì)算出蛋白質(zhì)有多少數(shù)量的自由氨基，PEG共價(jià)修飾藥用蛋白會(huì)使自由氨基在蛋白表面分布量減少，利用三硝基苯磺酸與蛋白質(zhì)的反應(yīng)可了解誒PEG修飾蛋白效果。此種分析法多用于對(duì)PEG修飾蛋白平均修飾度的研究中較為廣泛，但此種分析法操作中容易被沒(méi)有發(fā)生反應(yīng)的PEG分析造成干擾，因而準(zhǔn)確性一般，近年來(lái)對(duì)三硝基苯磺酸反應(yīng)的改善和甘氨酸對(duì)照方案的應(yīng)用，不僅使得操作程序更簡(jiǎn)單便捷，分析準(zhǔn)確度也明顯改善[4]。

2.2 液相色譜法應(yīng)用

有學(xué)者以分子尺寸排阻色譜將PEG所修飾白細(xì)胞介素-2分離處理，以測(cè)定得出不同分離峰的紫外折光系數(shù)、吸收值，并根據(jù)兩個(gè)參數(shù)比值大小測(cè)算PEG所修飾的蛋白組分水力學(xué)半徑、重量分?jǐn)?shù)以及修飾度數(shù)據(jù)；也有學(xué)者采用C14反相高效液相色譜對(duì)修飾SOD以及沒(méi)有修飾的SOD蛋白分離處理，或?qū)EG修飾的生長(zhǎng)激素拮抗劑以離子交換色譜分析測(cè)定，各類色譜法分析過(guò)程中始終難以得到滿意的分辨率，而且有較寬的譜帶擴(kuò)展，若分析樣品內(nèi)有PEG存在，就會(huì)直接對(duì)色譜特點(diǎn)造成干擾，減少色譜內(nèi)球狀蛋白表觀分子含量，測(cè)定結(jié)果也有首影響。因而，液相色譜法分析難度受PEG存在與否決定，此種分析法制備分離力更佳，所以一直受到廣泛應(yīng)用。

2.3 電泳法應(yīng)用

對(duì)分子量不同的PEG修飾的藥用蛋白以SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離處理和分析觀察效果滿意，此種分析法會(huì)因修飾的蛋白考馬斯亮蘭染色效果變化而存在不足，臨床研究一直致力于糾正這一缺陷，近年來(lái)的一些臨床工作者在電泳處理后對(duì)存在于蛋白表層的一些聚乙二醇予以碘化鋇染液處理、以考馬斯亮藍(lán)染色，此法PEG水力學(xué)半徑相對(duì)大而使蛋白物質(zhì)電泳遷移較慢、分離不徹底，因而最終所得表觀分子量有偏差。另有研究采用電聚焦電泳法予以分析，此種分析法分辨率不足。近年來(lái)盛行的毛細(xì)管電泳得到了滿意的生物大分子分析效果，在PEG修飾蛋白定量分析、定性分析領(lǐng)域效果均良好，有學(xué)者以改性劑使正電荷存在于毛細(xì)管柱之內(nèi)，電滲流方向發(fā)生改變；另有學(xué)者以大分子量的聚氧乙烯動(dòng)態(tài)涂柱毛細(xì)管電泳發(fā)對(duì)蛋白修飾度進(jìn)行分析，可分離出不同偶聯(lián)SOD蛋白峰，對(duì)其定量分析所得結(jié)果十分精準(zhǔn)。多數(shù)資料表示，近年來(lái)得到推廣的線形聚丙烯酰胺靜態(tài)涂柱毛細(xì)管電泳法分析藥用血紅蛋白修飾效果良好。

3討論

PEG共價(jià)修飾蛋白質(zhì)的研究在近幾十年來(lái)很多，這是由于PEG修飾的一些藥用蛋白性質(zhì)會(huì)發(fā)生有利改變，從而受到更好的臨床治療效果。例如，PEG共價(jià)修飾的藥用蛋白進(jìn)入機(jī)體后血藥半衰期得到延長(zhǎng)、異源蛋白引發(fā)的免疫排斥反應(yīng)發(fā)生率更低、蛋白在人體內(nèi)有更高的溶解度、蛋白天然活性得到很好的保持[5]。20世紀(jì)90年代初期，以PEG修飾的藥用蛋白PEG-腺苷脫氨酶首次經(jīng)美國(guó)藥品與食品管理局批準(zhǔn)上市，真正投入到臨床治療中，對(duì)嚴(yán)重兒童免疫系統(tǒng)缺陷病治療效果滿意。之后，Cetus、Enzon等全球知名藥品生產(chǎn)商陸續(xù)推進(jìn)PEG修飾藥用蛋白技術(shù)的進(jìn)展。經(jīng)過(guò)多年的臨床研究、實(shí)踐應(yīng)用，越來(lái)越多的PEG應(yīng)用于醫(yī)學(xué)臨床藥用蛋白共價(jià)修飾中，常見的產(chǎn)物有白細(xì)胞介素-2（IL-2）、牛血清白蛋白（BSA）、牛超氧化物歧化酶（SOD）、人粒細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）等。

PEG種類較多，研究中常用的為一種一端封閉的單甲氧基聚乙醇5000分子，使用此種物質(zhì)選擇性對(duì)單邊質(zhì)分子中賴氨酸側(cè)鏈的氨基結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，PEG末端醇羥基沒(méi)有活潑的化學(xué)性質(zhì)，因而需要與N-羥基琥珀酰亞胺及三氯均氰等物質(zhì)反應(yīng)以達(dá)到活化的目的，經(jīng)反應(yīng)的PEG與蛋白表面N末端氨基更易發(fā)生共價(jià)結(jié)合而形成性質(zhì)穩(wěn)定的尿烷鍵、酰胺鍵。但是，常用以對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾的PEG分子有特殊的分子量分布特點(diǎn)，有國(guó)外相關(guān)研究提出，MPEC5000分子量是5000±250道爾頓，可見，即便一類蛋白質(zhì)分子中有相同數(shù)量的PEG，也不一定有同樣的分子量。而且，藥用蛋白表面通常有較多的可修飾氨基位點(diǎn)，不同的氨基殘疾與PEG分子相結(jié)合就會(huì)形成多種復(fù)雜的修飾蛋白空間結(jié)構(gòu)。PEG和藥用蛋白修飾結(jié)合生成的是混合物，即便以同等修飾度的蛋白分子與PEG結(jié)合，也難以避免因多種修飾位點(diǎn)的影響而出現(xiàn)修飾結(jié)果的多態(tài)性。正是因?yàn)檫@種復(fù)雜的、難以掌握的多態(tài)性的出現(xiàn)，給臨床上準(zhǔn)確分析PEG修飾藥用蛋白的準(zhǔn)確度造成了困難。

采用聚乙二醇共價(jià)修飾藥用蛋白質(zhì)，有利于降低使用藥用蛋白治療出現(xiàn)不良用藥癥狀，提高臨床療效。當(dāng)前臨床高度認(rèn)可PEG修飾藥用蛋白臨床價(jià)值，認(rèn)為此種技術(shù)可同時(shí)縮短疾病治療時(shí)間、提升臨床療效。PEG修飾技術(shù)發(fā)展至今，已有十余種相關(guān)蛋白藥物在臨床得到應(yīng)用和推廣，由于PEG修飾蛋白技術(shù)及分析方法尚不成熟，臨床上還有很多相關(guān)藥物因未得到滿意的修飾效果而不能投入使用，臨床工作者應(yīng)加大PEG修飾蛋白技術(shù)的研究與開發(fā)，充分使用液相色譜方法、電泳方法、分光光度法等PEG修飾藥用蛋白分析手段，促進(jìn)多點(diǎn)隨機(jī)修飾技術(shù)逐漸向更加成熟的定點(diǎn)修飾方向發(fā)展、從相對(duì)復(fù)雜的操作模式向集成化的現(xiàn)代化操作方向改進(jìn)，進(jìn)一步改善藥用蛋白生物活性，并同時(shí)降低技術(shù)成本，真正實(shí)現(xiàn)其臨床價(jià)值[6]。

【參考文獻(xiàn)】

[1]肖錫峰，江小群，周雷激等.聚乙二醇表面改性抑制蛋白質(zhì)非特異性吸附[J].分析化學(xué)，2013，41（3）：445-453.

[2]沈濤，阮楊，丁鈴等.聚乙二醇-過(guò)氧化氫酶在小鼠心肌肥厚和損傷中的保護(hù)作用[J].中國(guó)心血管雜志，2013，18（2）：111-115.

[3]張永國(guó).蛋白質(zhì)的PEG修飾[J].海峽藥學(xué)，2013，25（1）：14-18.

[4]路娟，劉清飛，羅國(guó)安等.藥物的聚乙二醇修飾研究進(jìn)展[J].有機(jī)化學(xué)，2009，29（8）：1167-1174.

[5]董紅霞，童玥，錢曉暐等.聚乙二醇化蛋白質(zhì)多肽類藥物定點(diǎn)修飾策略[J].藥學(xué)與臨床研究，2013，21（4）：360-365.

[6]楊旭，貢濟(jì)宇.蛋白多肽類藥物聚乙二醇化修飾研究進(jìn)展[J].中國(guó)當(dāng)代醫(yī)藥，2012，19（31）：16-17，20.endprint