劉億淑 呂明莊

摘要：目的：通過(guò)觀測(cè)耳針、六味地黃丸加味丹參對(duì)D-半乳糖衰老大鼠海馬組織神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）的蛋白表達(dá)的影響，探討耳針、六味地黃丸加味丹參預(yù)防和延緩衰老的可能機(jī)理，為耳針、中藥延緩衰老在臨床上的運(yùn)用提供新的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。結(jié)果：：1、耳針組、中藥組、耳針+中藥組海馬組織NGF蛋白表達(dá)增加，與模型組相比較，差異具有顯著性（P<0.01或P<0.05）。其中耳針+中藥組與耳針組、中藥組比較，差異有顯著性（P<0.01）；耳針組與中藥組比較，差異無(wú)顯著性（P>0.05）。2、耳針組、中藥組、耳針+中藥組海馬組織BDNF蛋白表達(dá)增加，與模型組相比較，差異具有顯著性（P<0.01或P<0.05）。其中耳針+中藥組與耳針組、中藥組比較，差異有顯著性（P<0.01）；耳針組與中藥組比較，差異無(wú)顯著性（P>0.05）。結(jié)論：耳針、中藥具有延緩衰老的作用，從神經(jīng)內(nèi)分泌角度看，其可能的作用機(jī)理是：耳針、中藥促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）的表達(dá)，發(fā)揮其營(yíng)養(yǎng)、支持、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞、抑制細(xì)胞凋亡的作用，從而調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)功能最終達(dá)到延緩衰老的目的。

關(guān)鍵詞：衰老； 耳針；中藥； 海馬； 神經(jīng)生長(zhǎng)因子； 腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子

【中圖分類號(hào)】R453【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】 A【文章編號(hào)】1002-3763（2014）09-0071-02目前全球都面臨人口老齡化問(wèn)題，老年人口的增多帶來(lái)了一系列社會(huì)和經(jīng)濟(jì)問(wèn)題。因此，對(duì)衰老機(jī)制和延緩衰老的研究日益受到重視，其中神經(jīng)系統(tǒng)的老齡性退行性變化引起的疾病，如老年癡呆、帕金森病等已成為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中研究的熱點(diǎn)，受到普遍關(guān)注。本研究采用D-半乳糖致衰老的方法復(fù)制衰老大鼠模型，以海馬神經(jīng)元神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素家族成員神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）的表達(dá)以及雌鼠血清非肽類神經(jīng)生長(zhǎng)因子雌激素（E2）的含量作為檢測(cè)指標(biāo)，探討耳針、中藥預(yù)防和延緩衰老的可能途徑，探索其延緩衰老作用的新機(jī)制，為耳針、中藥延緩衰老在臨床上的運(yùn)用提供新的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料：

1.1.1 動(dòng)物：Wistar健康大鼠70只，清潔級(jí)，雌雄各半，雙耳無(wú)缺損，3～4月齡，體重250～300g（由貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），造模前在相同光照條件大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，雌雄分開，自由攝取標(biāo)準(zhǔn)飼料（由貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），飲用干凈自來(lái)水，室溫控制在15～18℃之間，濕度70%左右。

1.1.2 主要試劑和儀器：六味地黃丸：貴陽(yáng)德昌祥藥業(yè)有限公司；丹參：貴陽(yáng)阜康堂藥業(yè)公司；SOD試劑盒：南京建成生物工程有限公司；MDA試劑盒：南京建成生物工程有限公司

BDNF免疫組化試劑盒：武漢博士德生物工程有限公司；NGF免疫組化試劑盒：武漢博士德生物工程有限公司；撳針（耳針）：北京環(huán)亞醫(yī)藥器械公司；臺(tái)式高速離心機(jī)：上海醫(yī)用分析儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組：70只 Wistar健康大鼠隨機(jī)分為5組，每組14只（雌雄各半，分開飼養(yǎng)），即對(duì)照組、模型組、耳針組、中藥組、耳針+中藥組。

1.2.2 動(dòng)物模型建立[1]：Wistar大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，采用國(guó)際上公認(rèn)的D-半乳糖復(fù)制衰老模型。6周后，取大鼠靜脈血測(cè)血清超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量。模型組與對(duì)照組比較，模型組SOD活性明顯降低，MDA含量明顯增高（見表1、2），證明模型復(fù)制成功。

1.3 治療方法

1.3.1 耳針組：在造模同時(shí)進(jìn)行耳針治療，根據(jù)華興邦《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)》中及林文注[2] 、李辭蓉[3]所介紹的動(dòng)物穴位定位，選取大鼠雙側(cè)耳穴（腎穴、脾穴、肝穴）以撳針按壓后固定留置于耳上。

1.3.2 中藥組：在造模同時(shí)每日給予六味地黃丸（由熟地、山藥、山萸肉、茯苓、澤瀉、牡丹皮組成）加丹參磨制成中藥粉末，每只大鼠每日按成人劑量的10倍給藥，拌入飼料后混勻，自由攝食。

1.3.3 耳針+中藥組：造模同時(shí)進(jìn)行耳針+中藥治療，取穴及中藥喂服方法同前。以上治療時(shí)間均為6周[1]。

1.4 指標(biāo)及檢測(cè)

1.4.1 血清SOD、MDA的檢測(cè)

血清SOD、MDA的檢測(cè)均按試劑盒說(shuō)明書操作。SOD的活性采用黃嘌呤氧化酶法檢測(cè)； MDA的含量采用硫代巴比妥酸（TAB）法檢測(cè)。

1.4.2 NGF、BDNF的免疫組織化學(xué)染色，

1.4.3 免疫組化染色陽(yáng)性結(jié)果判斷：陽(yáng)性信號(hào)主要位于胞漿內(nèi)，呈棕黃色或黃色者為陽(yáng)性細(xì)胞。

1.4.4 數(shù)據(jù)處理及圖像分析：數(shù)據(jù)采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行儲(chǔ)存、整理、分析，各項(xiàng)指標(biāo)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間數(shù)據(jù)采用單因素方差分析及q檢驗(yàn)。

圖像資料采用貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院病理科Biomias99圖像分析系統(tǒng)。取視場(chǎng)面積443268um2，每張切片在顯微鏡的10×40倍目鏡下隨機(jī)選5個(gè)視場(chǎng)，通過(guò)攝像頭采集圖像進(jìn)入Biomias99圖像分析系統(tǒng)，每個(gè)視場(chǎng)內(nèi)選取5個(gè)陽(yáng)性表達(dá)區(qū)域進(jìn)行光密度（OD）測(cè)定，取其平均值即為該切片的平均光密度。所有OD值測(cè)量均在相同光學(xué)、光源條件下完成。用鼠標(biāo)點(diǎn)擊法計(jì)數(shù)陽(yáng)性（表達(dá)）細(xì)胞。記錄各組海馬區(qū)NGF和BDNF的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及其表達(dá)的平均光密度值。

2 結(jié)果

2.1 一般情況觀察結(jié)果：對(duì)照組大鼠毛發(fā)光澤、順滑，皮膚彈性好，行動(dòng)敏捷，自主活動(dòng)佳，大便成形，呈黃褐色，無(wú)腥臭。模型組大鼠毛發(fā)枯黃、無(wú)光澤，皮膚粗糙、彈性差，行動(dòng)遲緩，自主活動(dòng)明顯降低，大便較稀，較為腥臭。其余治療組大鼠上述表現(xiàn)較模型組均見良性逆轉(zhuǎn)。

2.2 各組大鼠血清超氧化物歧化酶（SOD）活性的變化（見表1）

表1 各組大鼠血清SOD活性的比較（X±S）

Tab-1 The Comparison of Serum SOD Activity among Groups（X±S）

組 別 例 數(shù) SOD（NU/ml）對(duì) 照 組13659.15±126.33模 型 組12 314.65±118.49 #耳 針 組14553.12±61.80*中 藥 組14553.02±83.38*耳針+中藥組14 606.31±73.12*△▲注：與對(duì)照組比較 # ：P<0.01 與模型組比較 * ：P<0.05

與耳針組比較 △：P<0.05 與中藥組比較 ▲：P<0.05

表2 各組大鼠血清MDA含量的比較（X±S）

Tab-2 The Comparison of Serum MDA Content among Groups（X±S）

組 別 例 數(shù) MDA（nmol/ml）對(duì) 照 組130.65±0.40模 型 組122.03±0.68#耳 針 組141.15±0.44*中 藥 組141.40±0.31*耳針+中藥組14 0.64±0.31*△▲注：與對(duì)照組比較 # ：P<0.001 與模型組比較 * ：P<0.05

與耳針組比較 △：P<0.01 與中藥組比較 ▲：P<0.01

由表2統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明：與對(duì)照組比較，模型組血清MDA含量顯著升高（P<0.001）；耳針組、中藥組、耳針+中藥組與模型組比較，血清MDA含量均有明顯降低（P<0.05）；三個(gè)治療組間兩兩比較，耳針+中藥組MDA含量低于耳針組、中藥組（P<0.01）；耳針組、中藥組間差異無(wú)顯著性（P>0.05）。

2.3 各組大鼠血清丙二醛（MDA）含量的變化（見表2）

2.4 海馬組織神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（NGF）免疫組織化學(xué)染色結(jié)果（見表3）

由表1統(tǒng)計(jì)分析表明：與對(duì)照組比較，模型組血清SOD活性顯著降低（P<0.01）；耳針組、中藥組、耳針+中藥組與模型組比較，血清SOD活性均有明顯升高（P<0.05）；三個(gè)治療組間兩兩比較，耳針+中藥組SOD活性高于耳針組、中藥組（P<0.05）；耳針組、中藥組間差異無(wú)顯著性（P>0.05）。

表3 各組NGF免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目和平均光密度比較（X±S）

Tab-3 The comparison of amount of Immunal positive cell and meaning of lingt density of NGF among groups （X±S）

組 別例 數(shù) 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù) 平均光密度對(duì) 照 組818.51±1.7288.99±3.17模 型 組82.42±1.16#185.74±9.81#耳 針 組810.89±1.18*140.60±3.44*中 藥 組810.66±1.16*140.21±3.44*耳針+中藥組816.22±1.48*△▲93.24±3.41*△▲注：與對(duì)照組比較 # ：P<0.01 與模型組比較 * ：P<0.05

與耳針組比較 △：P<0.01 與中藥組比較 ▲：P<0.01

2.5 腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BNGF）免疫組織化學(xué)染色結(jié)果（見表4）

表4 各組BDNF免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目和平均光密度比較（X±S）

Tab-4 The comparison of amount of Immunal positive cell and meaning of lingt density of BDNF among groups （X±S）

組 別例 數(shù) 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù) 平均光密度對(duì) 照 組819.6±1.5294.44±4.38模 型 組8 2.47±1.27#192.69±3.94#耳 針 組8 8.93±1.31*152.30±3.13*中 藥 組89.45±1.06*151.92±2.88*耳針+中藥組815.23±1.42*△▲116.04±2.35*△▲注：與對(duì)照組比較 # ：P<0.01 與模型組比較 * ：P<0.05

與耳針組比較 △：P<0.01 與中藥組比較 ▲：P<0.01

3 討論

衰老的神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)學(xué)說(shuō)認(rèn)為，機(jī)體在神經(jīng)系統(tǒng)的控制下，通過(guò)神經(jīng)內(nèi)分泌的調(diào)節(jié)，完成其生長(zhǎng)、發(fā)育、成熟、衰老乃至死亡這一系列生物過(guò)程。神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)各個(gè)環(huán)節(jié)的增齡性衰退變化，都將加速衰老過(guò)程。有實(shí)驗(yàn)研究顯示[4-8]，老年癡呆、帕金森病、亨廷頓氏舞蹈癥等老年性退行性疾病的發(fā)生、發(fā)展可能與缺乏神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)家族（NTs）成員如NGF、BDNF的營(yíng)養(yǎng)作用有關(guān)。

現(xiàn)代研究認(rèn)為[9]，耳針對(duì)機(jī)體的作用是神經(jīng)體液綜合調(diào)節(jié)的結(jié)果。針刺或貼壓耳穴可調(diào)節(jié)臟腑和器官功能活動(dòng)，提高機(jī)體免疫功能，改善腎虛，改善激素水平，從而達(dá)到延緩衰老的目的[10]。本研究根據(jù)辨證選穴原則，選取耳穴“腎”、“脾”、“肝”?！澳I”穴具有培補(bǔ)腎氣、填精補(bǔ)髓、培元固本的作用，“脾”穴能養(yǎng)胃健脾、益氣輸津，“肝”穴具有調(diào)暢氣機(jī)、活血化瘀的作用，三穴共奏扶正祛瘀之功，以達(dá)延緩衰老之效。

大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究發(fā)現(xiàn)，六味地黃丸具有抗氧化、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫功能、改善微循環(huán)、提高應(yīng)激能力、延長(zhǎng)機(jī)體生存壽命、延緩衰老等功能[11-14]。此外，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)還利用基因芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)[15]，六味地黃丸可調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)水平，從而調(diào)節(jié)機(jī)體功能，起到延緩衰老的作用。丹參有很強(qiáng)的抗氧化作用，能消除自由基，增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力，能保護(hù)DNA，上調(diào)bcl-2表達(dá) ，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡有明顯的抑制作用[16]。此外，丹參提取物可有效改善氧化衰老模型小鼠的免疫狀態(tài)[17]。

本研究提示耳針、中藥延緩衰老的機(jī)制可能是：耳針、中藥能促進(jìn)海馬組織內(nèi)源性NGF、BDNF表達(dá)，發(fā)揮其對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)、支持和保護(hù)作用，延緩神經(jīng)系統(tǒng)的老齡性改變，調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)功能，從而起到扶正化瘀、調(diào)節(jié)陰陽(yáng)、疏經(jīng)通絡(luò)、調(diào)整臟腑功能的作用，最終達(dá)到延緩衰老目的。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，耳針+中藥組各項(xiàng)指標(biāo)均優(yōu)于耳針組和中藥組，且差異具有顯著性，說(shuō)明耳針與中藥具有協(xié)同作用，這可能與耳針、中藥共同發(fā)揮了增強(qiáng)免疫、調(diào)節(jié)自由基、調(diào)節(jié)脂代謝、改善激素水平等功能有關(guān)。

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