劉廣洋 ,馮大偉靳志明 ,劉勝一 ,衣悅濤

(1.中國科學(xué)院 煙臺海岸帶研究所,山東 煙臺 264003;2.中國科學(xué)院大學(xué),北京 100049)

瓊膠寡糖一般是瓊脂糖經(jīng)水解后得到的聚合度為 2～10的低聚糖,包括瓊寡糖和新瓊寡糖[1]。瓊膠寡糖具有較強的抗癌、抗氧化、抗炎等生理特性[2],此外,還具有良好的生物相容性和可降解性,具有易溶、易吸收和無毒副作用等特點,是一種新型的海洋功能性低聚糖。釩是生命體的一種必需微量元素,具有降血糖、類胰島素、抗癌、抗炎、殺精子等作用。早在19世紀(jì),釩的無機鹽就被用于治療貧血、營養(yǎng)不良、肺結(jié)核等疾病[3]?？紤]到無機釩的脂溶性小、生物利用度低、毒性較高、副作用大,故對有機釩配合物的研究應(yīng)運而生。有機釩配合物多樣的生理活性特別是類胰島素效應(yīng)和抗癌作用,吸引了眾多研究者的注意。近年來研究表明[4-6],有機釩配合物在體內(nèi)、體外都表現(xiàn)出抗腫瘤活性,有潛力開發(fā)成新的抗腫瘤藥物。海藻多糖釩絡(luò)合物的降糖作用[7]已有研究,但釩氧海藻寡糖的抗氧化及抗癌活性的研究尚未見報道。

基于這樣的研究背景下,作者以具有抗癌、抗氧化、抗炎等生理特性的海洋瓊膠寡糖為原料,通過羧甲基化得到羧甲基瓊膠寡糖,再與釩氧離子絡(luò)合,首次制備了羧甲基瓊膠寡糖釩絡(luò)合物并研究其抗氧化及抑制人肝癌BEL-7402細胞增殖的活性。

1 材料和方法

1.1 儀器和藥品

TU-1810紫外可見分光光度計,北京普析通用化學(xué)有限責(zé)任公司;FTIR-4100紅外光譜儀,日本Jasco;ELAN DRC II電感耦合等離子體質(zhì)譜儀,PerkinElmer(Hong Kong)Ltd;瓊膠糖,北京康倍斯科技有限公司;DPPH,日本wako;Vc(99.7%),天津市紅巖化工廠: 其他試劑均為分析純。

1.2 羧甲基瓊膠寡糖釩絡(luò)合物的制備

瓊膠寡糖的制備: 參考文獻[8]制備瓊膠寡糖混合物,平均分子質(zhì)量的測定方法采用端基法。

羧甲基瓊膠寡糖的制備: 參考文獻[9]制備羧甲基瓊膠寡糖。

羧甲基瓊膠寡糖釩絡(luò)合物的制備: 將羧甲基瓊膠寡糖溶于NaOH稀溶液并調(diào)pH到12,30 ℃水浴下攪拌0.5 h。加入0.25 g VOSO4,反應(yīng)4～8 h至溶液變澄清透明,在整個反應(yīng)過程中始終保持溶液pH≥12。反應(yīng)液濃縮醇沉,沉淀用70 %乙醇洗滌多次。粗產(chǎn)物溶于少量水,加入丙酮沉淀,抽濾,用無水乙醇洗滌多次,45 ℃真空干燥24 h得固體產(chǎn)品。

1.3 羧甲基瓊膠寡糖釩絡(luò)合物結(jié)構(gòu)的鑒定及其釩含量的測定

取樣品1～2 mg,KBr壓片,在FTIR-4100紅外光譜儀上進行紅外分析。

按照ICP-MS水/廢水中低含量金屬離子的測定標(biāo)準(zhǔn)測定羧甲基瓊膠寡糖釩絡(luò)合物中釩的含量。

1.4 瓊膠寡糖及其衍生物抗氧化活性實驗

羥基自由基(·OH)清除率的測定: 參照文獻[10]并稍作調(diào)整,反應(yīng)體系含有 1 mL磷酸緩沖溶液(0.15 mmol/L、pH 7.4),1 mL番紅花紅(80 mg/L),1 mL H2O2(0.03%),1 mL EDTA-FeⅡ(0.945 mmol/L),0.5 mL 不同濃度的樣品溶液,混合均勻后在 37℃水浴鍋內(nèi)恒溫0.5 h,然后以蒸餾水調(diào)零測定520 nm處吸光值,每個濃度做3次平行。羥基自由基的清除率E(%)的計算公式為:

式中: A1為加入樣品溶液后的吸光值,A2為以對應(yīng)體積的蒸餾水代替樣品溶液的吸光值,A3為以對應(yīng)體積的蒸餾水代替EDTA-Fe(Ⅱ)和樣品溶液的吸光值。

DPPH自由基清除率的測定: 參照文獻[11,12]并稍作調(diào)整,用95%的乙醇配制濃度為2×10-4mol/L的DPPH溶液,取2 mL的DPPH溶液,2 mL不同濃度的樣品溶液加入10 mL比色管中。混合均勻后避光放置0.5 h,然后以95%乙醇做參比測定525 nm處吸光值,每個濃度做3次平行。DPPH自由基的清除率F(%)的計算公式為:

式中: Ai為加入樣品溶液后的吸光值,Aj為以對應(yīng)體積的95%乙醇代替DPPH溶液的吸光值,Ac為以對應(yīng)體積的95%乙醇代替樣品溶液的吸光值。

1.5 羧甲基瓊膠寡糖釩絡(luò)合物對人肝癌BEL-7402細胞增殖的影響

采用磺酰羅丹明B(sulforhodamine B SRB)蛋白染色法[13]對人肝癌細胞BEL-7402進行篩選。胰蛋白酶消化生長良好的人肝癌細胞 BEL-7402,然后用10%牛血清 1640懸浮 200 μL,調(diào)整細胞數(shù)為2×105/mL,加至 96孔板,0.1 mL/孔,將化合物稀釋成不同梯度溶液(16,63,250,1 000,4 000 mg/L)分別加入細胞孔中,每一稀釋度設(shè)4孔,37℃,5%CO2作用72 h。經(jīng)過藥物暴漏后,細胞用 12%的三氯乙酸固定,并用磺酰羅丹明B染色,然后用酶標(biāo)儀測515 nm處的OD值。抑制率(Inhibition ratio,I)計算公式如下:

式中: A1為加入樣品溶液后的OD值,A2為對照組的OD值。

2 結(jié)果與討論

2.1 羧甲基瓊膠寡糖釩絡(luò)合物結(jié)構(gòu)的鑒定

圖1為瓊膠寡糖及其衍生物的紅外光譜圖,在瓊膠寡糖紅外譜中3 424.96 cm?1處的吸收峰為羥基的伸縮振動,929.52 cm?1處吸收峰為α-3,6-內(nèi)醚-L-半乳糖的醚鍵伸縮振動,890.95 cm?1處的吸收峰為β型糖苷鍵特征峰。對比瓊膠寡糖的紅外光譜可以發(fā)現(xiàn),羧甲基瓊膠寡糖的紅外光譜中1 600.63 cm?1處的羧酸鹽的羰基非對稱伸縮振動吸收峰和1 419.35 cm?1處羧酸鹽的羰基對稱伸縮振動吸收峰均明顯變寬增強,表明瓊膠寡糖成功羧甲基化。

圖1 瓊膠寡糖及其衍生物紅外光譜圖Fig.1 IR of agaro-oligosaccharides and its derivatives

對比羧甲基瓊膠寡糖的紅外光譜可以發(fā)現(xiàn),羧甲基瓊膠寡糖釩絡(luò)合物的羥基吸收峰移向高波數(shù),可能是羥基與釩氧離子絡(luò)合,使得羥基的氫鍵締合作用減弱,羥基的吸收峰增強;羧酸鹽的羰基非對稱伸縮振動峰和羧酸鹽的羰基對稱伸縮振動峰均減弱,說明羧基中的氧原子與釩氧離子的絡(luò)合: 查閱文獻[14,15]確定在 941.09 cm?1處出現(xiàn)新的強吸收峰為V O的伸縮振動: 以上分析表明,釩氧離子與羧甲基瓊膠寡糖以化學(xué)鍵的形式結(jié)合,即成功合成了羧甲基瓊膠寡糖釩絡(luò)合物。 ICP-MS測定釩在羧甲基瓊膠寡糖釩絡(luò)合物中的含量為4.6 %。

2.2 瓊膠寡糖及其衍生物的抗氧化活性

2.2.1 瓊膠寡糖及其衍生物對羥基自由基的清除作用

多糖清除羥基自由基的機理可能是醇羥基絡(luò)合產(chǎn)生·OH 的必需金屬離子,抑制·OH 的產(chǎn)生或多糖的醇羥基的氫原子和·OH直接作用[16-17]。由圖 2可知,3種樣品的濃度與其羥基自由基清除率均成正比關(guān)系。當(dāng)樣品濃度為 0.22～ 1.11 g/L 時,瓊膠寡糖對·OH的清除率為19.6 %～ 40.9 %,羧甲基瓊膠寡糖的清除率為33.3 %～ 60.4 %,羧甲基瓊膠寡糖釩絡(luò)合物的清除率為57.8 %～ 80.5 %。釩氧絡(luò)合修飾后,羧甲基瓊膠寡糖釩絡(luò)合物清除·OH的能力得到顯著提高。這可能是由于釩是過渡金屬元素,d軌道電子容易得到或失去,羧甲基瓊膠寡糖釩絡(luò)合物中的釩元素可以在V(Ⅳ)和V(Ⅴ)兩種價態(tài)之間進行轉(zhuǎn)換[18]。釩的這種特性使得羧甲基瓊膠寡糖釩絡(luò)合物中的釩具有清除自由基的作用[19]。

圖2 瓊膠寡糖及其衍生物清除羥基自由基Fig.2 Hydroxyl radical scavenging activity of agaro-oligosaccharides and its derivatives

2.2.2 瓊膠寡糖及其衍生物對DPPH自由基的清除作用

多糖清除 DPPH自由基的機理可能與多酚類化合物清除 DPPH自由基的機理相似[20],即化合物提供氫原子或者提供單電子與 DPPH自由基配對,達到清除目的。由圖3可知,三種樣品對DPPH自由基的清除能力隨它們的濃度增大而增強。在測定濃度0.5～2.5 g/L內(nèi),瓊膠寡糖對DPPH自由基的清除率為19.5%～78.0%,羧甲基瓊膠寡糖對DPPH自由基的清除率為 24.5%～79.2%,羧甲基瓊膠寡糖釩絡(luò)合物對 DPPH自由基的清除率為 66.8%～92.2%。與羧甲基瓊膠寡糖相比,羧甲基瓊膠寡糖釩絡(luò)合物清除DPPH自由基的能力有明顯的提高。這可能是由于釩是過渡金屬元素,羧甲基瓊膠寡糖釩絡(luò)合物中釩的d軌道電子可以與DPPH自由基直接作用。

2.3 羧甲基瓊膠寡糖釩絡(luò)合物抑制人肝癌BEL-7402細胞增殖的活性

圖3 瓊膠寡糖及其衍生物清除DPPH自由基Fig.3 DPPH radical scavenging activity of agaro-oligosaccharides and its derivatives

表1 羧甲基瓊膠寡糖釩絡(luò)合物對BEL-7402細胞生長的抑制Tab.1 Antiproliferation effects of vanadyl Carboxymethyl agaro-oligosaccharides on BEL-7402 cells

由表1可知,羧甲基瓊膠寡糖釩絡(luò)合物對人肝癌BEL-7402細胞具有一定的抑制作用,當(dāng)樣品濃度為16～1 000 mg/L時,抑制率隨樣品濃度的增加而增加,有劑量依賴關(guān)系,到一定程度后,隨著樣品濃度的增加抑制率開始下降。以上分析表明,羧甲基瓊膠寡糖釩絡(luò)合物在16～1 000 mg/L濃度范圍內(nèi)有較好的抑制人肝癌BEL-7402細胞增殖的活性。

3 結(jié)論

本研究首次制備了羧甲基瓊膠寡糖釩絡(luò)合物并研究其抗氧化及抑制人肝癌 BEL-7402細胞增殖的活性。經(jīng)紅外光譜法表征,表明釩氧離子與羧甲基瓊膠寡糖以化學(xué)鍵的形式結(jié)合,利用 ICP-MS測定釩氧羧甲基瓊膠寡糖中釩含量分別為 4.6 %?？寡趸瘜嶒灡砻黥燃谆偰z寡糖絡(luò)合釩氧離子后,其清除·OH的能力和DPPH自由基的能力均得到顯著提高。經(jīng)磺酰羅丹明B蛋白染色法測試,進一步發(fā)現(xiàn)羧甲基瓊膠寡糖釩絡(luò)合物在 16～1000 mg/L濃度范圍內(nèi)對人肝癌 BEL-7402細胞的增殖有較好的抑制作用,為羧甲基瓊膠寡糖釩絡(luò)合物抗癌活性的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

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