潘 奇 朱 凱 陳萬勇 張巨波 孫惠川 王 魯 任 寧

·臨床研究與應(yīng)用·

轉(zhuǎn)錄因子Sp1表達(dá)與肝癌臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系*

潘 奇 朱 凱 陳萬勇 張巨波 孫惠川 王 魯 任 寧

目的：通過研究肝癌組織內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子Sp1的表達(dá)及其與肝癌患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，探討轉(zhuǎn)錄因子Sp1作為肝癌預(yù)后預(yù)測指標(biāo)的可行性。方法：對98例根治性切除術(shù)的肝細(xì)胞肝癌腫瘤組織芯片進行免疫組化檢測Sp1的表達(dá)情況，分析其與肝癌患者臨床病理特征及預(yù)后之間的關(guān)系。結(jié)果：免疫組化結(jié)果顯示Sp1在肝癌組織中表達(dá)明顯高于對應(yīng)正常肝臟組織，在有微血管侵犯的患者中升高尤其明顯。進一步分析顯示Sp1表達(dá)與肝癌患者術(shù)后總體生存率呈負(fù)相關(guān)，而與肝癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)率呈正相關(guān)。結(jié)論：轉(zhuǎn)錄因子Sp1在肝癌中明顯高表達(dá)，可作為肝癌患者預(yù)后的獨立預(yù)測指標(biāo)。

肝細(xì)胞肝癌 轉(zhuǎn)錄因子Sp1 預(yù)后指標(biāo) 組織芯片

肝細(xì)胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是最常見的肝臟惡性腫瘤，是世界范圍內(nèi)主要的健康問題之一［1-2］。盡管外科切除和肝移植為治愈肝癌提供了一定的機會，但由于復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移率較高，肝癌的預(yù)后仍不理想［2］。因此，尋找能指導(dǎo)預(yù)后和作為治療靶點的分子標(biāo)記對肝癌的治療非常重要。轉(zhuǎn)錄因子Sp1是序列特異性的DNA結(jié)合蛋白［3］，在多種腫瘤中表現(xiàn)為異常表達(dá)和活化，并參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、血管生成等多種生物學(xué)功能［4］。本研究通過對含98例根治性切除術(shù)后肝細(xì)胞肝癌患者腫瘤組織芯片進行免疫組化分析Sp1的表達(dá)情況及其與肝癌患者臨床特征之間的關(guān)系，探討Sp1在肝癌中的表達(dá)差異及作為肝癌術(shù)后預(yù)后預(yù)測指標(biāo)的可行性。

1 材料與方法

1.1 病例資料

本實驗使用了含98例肝細(xì)胞肝癌患者腫瘤及正常肝臟組織的組織芯片?；颊邽?999年5月到2002年12月間復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院肝外科收治的98例原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌患者，均接受了同一治療組肝臟腫瘤根治性切除手術(shù)?；颊咝g(shù)前均無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，肝功能均為Child-Pugh A，診斷均經(jīng)過病理證實。具體的臨床病理特征見表1。腫瘤分期按照2010年國際抗癌聯(lián)盟TNM分期標(biāo)準(zhǔn)。本研究由復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院研究倫理委員會審核批準(zhǔn)，并經(jīng)過研究對象或其家屬知情同意。最近隨訪時間為2013年6月15日，中位隨訪時間為44（2.0～144.0）個月。

表1 Sp1表達(dá)與肝癌肝癌患者臨床病理特征的關(guān)系 n（%）Table 1 Relationship between Sp1 expression and clinicopathologic features of HCC in patients with HCC

1.2 主要的試劑和設(shè)備

抗體：大鼠抗人Sp1（PEP2，sc59）多克隆抗體，為美國Santa Cruz公司產(chǎn)品；HRP標(biāo)記的羊抗大鼠IgG，為上?？党缮锕井a(chǎn)品。

1.3 實驗方法

1.3.1 免疫組織化學(xué)染色 將上述含98例肝細(xì)胞肝癌患者腫瘤及正常肝臟組織的組織芯片行免疫組織化學(xué)染色，組織切片二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，置入3%過氧化氫溶液中，室溫孵育10 min，消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，置入pH=6.0的檸檬酸溶液中，放入高壓鍋中煮沸，冷卻至室溫，取出切片，用PBS溶液浸洗3 min×3次。將切片用5%胎牛血清封閉，室溫15 min。甩去血清，向切片滴加一抗，4℃冰箱孵育過夜。PBS浸洗5 min×3次，向切片滴加二抗，室溫孵育15 min，PBS浸洗3 min×3次。向切片滴加鏈霉素抗生物素-過氧化物溶液（D劑），室溫下孵育10 min，PBS浸洗3 min×3次。滴加新鮮配制的DAB顯色液，顯微鏡下控制顯色時間，自來水浸洗中止顯色，蘇木素復(fù)染2 min，自來水浸洗，鹽酸酒精分化5 s，自來水水洗返藍(lán)20 min。梯度酒精脫水，二甲苯透明。中性樹膠封片，拍照觀察。

1.3.2 結(jié)果判定 Sp1陽性染色定位于細(xì)胞核內(nèi)，采用集成光學(xué)密度測定陽性染色強度。染色強度分為高低兩組（以平均吸光度［median integrated optical density，mIOD］為分界點，Sp1High為IOD＞mIOD，Sp1Low為IOD≤mIOD）。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

利用SPSS 17.0（SPSS，Chicago，IL）進行統(tǒng)計分析。Sp1表達(dá)情況與其他臨床病理特征之間關(guān)系用Pearson卡方檢驗驗證?？偵嫫冢╫verall survival，OS）定義為肝癌切除與死亡之間間隔時間，至復(fù)發(fā)時間定義為肝癌切除與影像學(xué)證實的復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移之間間隔時間。繪制總生存和復(fù)發(fā)的Kaplan-Meier生存曲線，并對其進行Log-rank檢驗。用單因素和多因素分析研究各因素對預(yù)后的影響。P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)錄因子Sp1在肝癌組織中表達(dá)明顯高于對應(yīng)正常肝臟組織

為了分析轉(zhuǎn)錄因子Sp1在肝癌組織的表達(dá)情況，選取98例根治性切除術(shù)后肝細(xì)胞肝癌患者腫瘤及正常肝臟組織，制成組織芯片，行免疫組織化學(xué)染色，免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示Sp1蛋白定位于腫瘤及正常肝組織的細(xì)胞核內(nèi)，按Sp1蛋白染色強度分為高表達(dá)組（Sp1 high）43例和低表達(dá)組（Sp1 low）55例，分別占43.9%（43/98）和56.1%（55/98）。Sp1在肝癌組織中的表達(dá)明顯高于對應(yīng)癌旁正常肝臟組織，兩者具有明顯的統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.01）。

2.2 Sp1在肝細(xì)胞癌組織中陽性表達(dá)與肝癌臨床病理特征的關(guān)系對98例根治性切除術(shù)后肝細(xì)胞肝癌患者腫瘤及正常肝臟組織進行多因素分析發(fā)現(xiàn)，影響總生存率的因素包括：有無肝硬化、腫瘤大小、有無微血管侵犯、TNM分期以及Sp1表達(dá)情況；影響腫瘤復(fù)發(fā)率的因素包括：是否感染乙肝以及Sp1表達(dá)情況。采用

Pearson卡方檢驗進一步分析Sp1過表達(dá)與肝癌臨床病理特征的關(guān)系，結(jié)果顯示Sp1表達(dá)與其他因素如年齡、性別、肝硬化、血清AFP、腫瘤大小或有無包膜之間無顯著性關(guān)系，僅與微血管侵犯密切相關(guān)（P= 0.021，表1）。這些結(jié)果提示在有微血管侵犯的患者中，腫瘤組織更容易高表達(dá)Sp1。

2.3 Sp1過度表達(dá)與肝癌術(shù)后預(yù)后的關(guān)系

應(yīng)用Kaplan-Meier生存曲線研究Sp1表達(dá)與肝癌術(shù)后患者預(yù)后的相關(guān)性，采用復(fù)診登記和電話咨詢等獲取隨訪信息，以手術(shù)日期為隨訪開始時間，最后隨訪時間為2013年6月15日，中位隨訪時間為44（2.0～144.0）個月。因肝癌復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移導(dǎo)致死亡為終點時間，持續(xù)生存或因其他原因死亡視為截尾事件。98例患者均獲得隨訪資料，Kaplan-Meier生存曲線分析顯示Sp1 high組的總生存率明顯低于Sp1 low組（P＜0.05），而肝癌腫瘤復(fù)發(fā)率Sp1 high組則明顯高于Sp1 low組（P＜0.01，圖1）。多因素分析顯示對于總生存和復(fù)發(fā)，Sp1表達(dá)是肝癌預(yù)后的重要影響因素（表2）。

圖1 Kaplan-Meier生存曲線顯示，Sp1表達(dá)升高的患者，OS（A）更短，復(fù)發(fā)率（B）更高Figure 1 Kaplan-Meier survival curves showing patients with increased expression of Sp1 had shorter OS(A)and higher recurrence rate(B)

表2 患者總生存期和腫瘤復(fù)發(fā)的多因素回歸分析Table 2 Multiple regression analysis of factors of patients with overall survival and tumor recurrence

3 討論

原發(fā)性肝癌是一種病死率很高的惡性腫瘤，是世界第三位、中國第二位的腫瘤死亡原因［1］。手術(shù)治療仍是目前肝癌最有效的治療方法，但由于術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移率較高，肝癌的預(yù)后仍不理想［2］。因此，尋找能指導(dǎo)預(yù)后的分子標(biāo)記對肝癌的治療非常重要。轉(zhuǎn)錄因子Sp1是一種序列特異性的DNA結(jié)合蛋白［3］。Sp1可能是腫瘤發(fā)展、增殖和轉(zhuǎn)移的主要調(diào)控因子。一些研究表明轉(zhuǎn)錄因子Sp1在腫瘤組織中表現(xiàn)為異常表達(dá)和活化，并且參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、血管生成等多種生物學(xué)功能［4］。近來研究已嘗試用Sp1作為腫瘤患者預(yù)后的獨立指標(biāo)，如Wang等［5］發(fā)現(xiàn)Sp1可作為胃癌患者長期生存率的指標(biāo)，F(xiàn)uchs等［6］也發(fā)現(xiàn)Sp1與EWS-ETS癌相關(guān)蛋白密切相關(guān)，是尤文氏肉瘤的獨立預(yù)后因素。國內(nèi)有些研究也發(fā)現(xiàn)Sp1與胃癌［7-8］、乳腺癌［9］、胰腺癌［10］、大腸癌［11］、惡性胸膜瘤［12］等預(yù)后密切相關(guān)。但Sp1在肝癌中的表達(dá)及其與肝癌預(yù)后的關(guān)系目前鮮見文獻報道。Sp1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性受到各種水平的調(diào)控，不僅受Sp1蛋白細(xì)胞核內(nèi)含量的影響，還受蛋白翻譯后修飾（如磷酸化、糖基化）等的調(diào)控［13-16］。

本文應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色法分析了轉(zhuǎn)錄因子Sp1在肝癌組織和正常肝組織中表達(dá)，結(jié)果說明Sp1在肝癌中高表達(dá)，在對應(yīng)正常肝臟組織中低表達(dá)，兩者具有明顯的統(tǒng)計學(xué)差異，提示Sp1在肝癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)中起到一定的調(diào)控作用。對98例根治性切除術(shù)后肝細(xì)胞肝癌患者腫瘤及正常肝臟組織進行多因素分析發(fā)現(xiàn)，患者預(yù)后與有無肝硬化、腫瘤大小、有無微血管侵犯、TNM分期、是否感染乙肝以及Sp1表達(dá)情況均有一定的關(guān)系，然而進一步分析Sp1與肝癌臨床病理特征的關(guān)系，僅觀察到Sp1過表達(dá)與微血管侵犯之間密切相關(guān)，與其他因素如年齡、性別、肝硬化、血清AFP、腫瘤大小或有無包膜之間無顯著性關(guān)系。這些結(jié)果表明在有微血管侵犯的患者中，腫瘤組織更容易高表達(dá)Sp1，進而提示Sp1可能與肝癌的血管生成密切相關(guān)，這與本文前期工作中證實轉(zhuǎn)錄因子Sp1與血管生成因子VEGF啟動子特異性結(jié)合是VEGF轉(zhuǎn)錄調(diào)控最重要的機制，可能進一步調(diào)控肝癌血管生成及轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的結(jié)論相吻合［17］，說明Sp1在肝癌中高表達(dá)，并調(diào)控VEGF高表達(dá)，進而促進肝癌血管生成，可能是肝癌血管生成調(diào)控中重要機制，Sp1是其中重要的調(diào)控因子。肝癌血管生成是肝癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的重要因素，與肝癌患者術(shù)后預(yù)后密切相關(guān)，作為血管生成重要調(diào)控因子的Sp1也與肝癌術(shù)后預(yù)后有一定相關(guān)性，應(yīng)用Kaplan-Meier生存曲線研究Sp1表達(dá)與肝癌術(shù)后患者預(yù)后的相關(guān)性，結(jié)果顯示Sp1表達(dá)與肝癌患者術(shù)后總體生存率呈負(fù)相關(guān)，而與肝癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)率呈正相關(guān)，具有統(tǒng)計學(xué)意義。多因素分析顯示對于總生存和復(fù)發(fā)，Sp1表達(dá)是肝癌預(yù)后的重要影響因素。轉(zhuǎn)錄因子Sp1的表達(dá)與肝癌術(shù)后預(yù)后和復(fù)發(fā)密切相關(guān)，可作為肝癌術(shù)后預(yù)后的獨立預(yù)測指標(biāo)。

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（2014-04-25收稿）

（2014-06-23修回）

（本文編輯：周曉穎）

Correlation of transcription factor Sp1 expression with clinical and pathological characteristics and prognosis of hepatocellular carcinoma

Qi PAN,Kai ZHU,Wanyong CHEN,Jubo ZHANG,Huichuan SUN,Lu WANG,Ning REN

Ning REN;E-mail:ren.ning@zs-hospital.sh.cn
Department of Liver Surgery,Zhongshan Hospital,Fudan University,Shanghai 200032,China
This work was supported by the National Natural Science Foundation of China(No.30600589;30801102)and Shanghai City Science and Technology Star Tracking Program(No.13QH1401000)

Objective:To explore the clinical significance of transcription factor Sp1 expression in hepatocellular carcinoma (HCC)and association between Sp1 expression and survival in HCC patients.Methods:With the use of immunoreactivity,Sp1 expression and its correlation with other clinicopathological characteristics were examined in a tissue microarray that contains samples from 98 HCC patients.Results:HCC tissues expressed markedly higher levels of Sp1 than did adjacent normal liver tissues.Sp1 expression was closely associated with microvascular invasion,which suggests that HCC with more microvascular invasion is prone to have increased Sp1 expression.Overexpression of Sp1 correlates with significantly shorter overall survival and higher recurrence rates in HCC patients after curative resection.Conclusion:Transcription factor Sp1 may be an independent prognostic factor for both overall survival and cumulative recurrence rate.

hepatocellular carcinoma,transcription factor Sp1,prognostic factor,tissue chip

10.3969/j.issn.1000-8179.20140694

復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院肝外科（上海市200032）

*本文課題受國家自然科學(xué)基金（編號：30600589、30801102）和上海市科技啟明星跟蹤計劃（編號：13QH1401000）資助

任寧 ren.ning@zs-hospital.sh.cn

潘奇 專業(yè)方向為肝癌的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移研究。

E-mail：pan.qi@zs-hospital.sh.cn