康清杰 向 征 彭旭東 鄧大煒 湯為學(xué)

鈣釋放激活鈣通道調(diào)節(jié)分子1促進結(jié)腸癌細胞系SW480的遷移和侵襲*

康清杰①向 征①彭旭東①鄧大煒①湯為學(xué)②

目的：探討鈣釋放激活鈣通道調(diào)節(jié)分子1（calcium release-activated calcium channel modulator 1，ORAI1）對SW480遷移和侵襲的影響及其機制。方法：以O(shè)RAI1干擾慢病毒感染SW480細胞，用RT-qPCR和Western blot檢測細胞中ORAI1mRNA和蛋白的表達，Transwell小室、黏附實驗、血管形成及擬態(tài)分別檢測細胞侵襲、遷移能力，同、異種細胞間黏附及血管生成能力，激光共聚焦顯微鏡檢測細胞鈣內(nèi)流（store-operated Ca2+entry，SOCE），Western blot法檢測細胞中ERK1/2、p-ERK1/2、MMP-2、VEGF和E-cadherin蛋白的表達。結(jié)果：SW480轉(zhuǎn)染ORAI1干擾慢病毒72h后，可見明顯的熒光表達；較空病毒組和（或）對照組，干擾組ORAI1的表達降低（P＜0.01）；侵襲和遷移能力減弱（P＜0.01）；同種黏附能力增強（P＜0.05）；異種黏附能力減弱（P＜0.05）；血管生成能力減弱（P＜0.01）；SOCE內(nèi)流峰值降低（P＜0.05）；p-ERK1/2、MMP-2和VEGF的表達降低（P＜0.01）、E-cadherin表達增加（P＜0.01）。結(jié)論：ORAI1可以促進SW480的遷移和侵襲，其機制可能與SOCE增加有關(guān)。

ORAI1SW480 遷移 侵襲 SOCE

腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移是決定患者預(yù)后的關(guān)鍵因素，它是指癌細胞從原發(fā)灶脫離后向周圍和（或）遠處組織擴散形成另一腫瘤的過程［1］。Ca2+作為細胞內(nèi)重要的第二信使，對細胞的黏附、遷移、運動等有重要作用［2］。胞膜蛋白ORAI1是鈣庫操縱的鈣通道（store-operated calcium channels，SOCC）的重要組成蛋白，它通過與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的基質(zhì)相互作用分子1（stromal interaction molecule 1，STIM1）相互作用，激活SOCC，引起細胞外Ca2+內(nèi)流形成SOCE，進而調(diào)節(jié)胞內(nèi)Ca2+的穩(wěn)態(tài)［3］。研究表明，ORAI1介導(dǎo)的SOCE在異常狀態(tài)時與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，如在人膠質(zhì)母細胞瘤中，ORAI1通過SOCE調(diào)節(jié)外鈣內(nèi)流，參與人膠質(zhì)母細胞瘤的侵襲［4］。但目前國內(nèi)外對于ORAI1與結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移關(guān)系的研究較少。本研究擬通過探討ORAI1對SW480轉(zhuǎn)移的影響及其機制，為結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和細胞株

人結(jié)腸癌細胞系SW480、人臍靜脈內(nèi)皮細胞HUVEC（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤實驗室提供）；Polybrene、干擾人ORAI1基因的重組慢病毒（shRNA：CGTGCACAATCTCAACTCG）和空載體慢病毒（shRNA：TTCTCCGAACGTGTCACGT）、Polybrene（上海紐恩生物科技有限公司）；Trizol、RT-PCR試劑盒、SYBY熒光定量試劑盒（大連TaKaRa寶生生物工程有限公司）；Ca2+熒光探針Rhod-2AM（美國，AAT Bioquest公司）；毒胡蘿卜素（thapsigargin，TG）、Nifedipin（美國，Sigma公司）；兔抗人MMP-2、VEGF和E-cadherin多克隆抗體（美國，santa cruz公司）；兔抗人ERK1/2和p-ERK1/2多克隆抗體（美國，immunoway公司）；兔抗人ORAI1多克隆抗體、鼠抗人β-action單克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG和羊抗鼠IgG（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）；Matrigel基質(zhì)膠（美國，BD公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 細胞用含10%胎牛血清、5%青霉素-鏈霉素雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 分組及慢病毒轉(zhuǎn)染 實驗設(shè)干擾組、空病毒組、對照組。以每孔2×105個細胞鋪6孔板，細胞貼壁，篩選最適MOI，最終2種慢病毒以MOI20感染細胞，再加入5 μg/孔Polybrene，24 h后換液，72 h后用熒光顯微鏡攝像。

1.2.3 RT-qPCR檢測細胞ORAI1 mRNA表達 細胞培養(yǎng)72h后，按說明書提取RNA、逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，再進行PCR實時擴增，條件：預(yù)變性95℃30 s，然后95℃5 s，60℃30 s，反應(yīng)40個循環(huán)，結(jié)果以2-△△Ct值表示待測樣本基因表達量相對于校準樣本基因表達量的倍數(shù)。ORAI1引物序列如下：上游：5'-GCTGCTCTGCTGGG TCAAGTT-3'，下游：5'-CGATAAAGATCAGGCCGAAG G-3'，片段長179 bp；GAPDH上游：5'-CTTTGGTATCGT GGAAGGACTC-3'，下游：5'-GTAGAGGCAGGGATGAT GTTCT-3'，片段長132 bp，實驗重復(fù)3次。

1.2.4 Transwell小室檢測細胞侵襲及遷移力 侵襲實驗：將Transwell小室（8 μm）放入24孔板，Matrigel膠用4℃無血清培養(yǎng)基（1：5）稀釋后取40 μL鋪上室，紫外線照射過夜，實驗前水化，各組取5×104個/400 μL加入上室，下室加10%胎牛血清培養(yǎng)液600 μL，常規(guī)培養(yǎng)24 h，擦去上室細胞，固定，結(jié)晶紫染色、切膜、封片、攝像，計數(shù)5個視野平均穿膜細胞數(shù)。遷移實驗：上室內(nèi)不鋪膠，余操作同前，實驗重復(fù)3次。

1.2.5 黏附實驗 取SW480細胞接種于96孔板（2× 104個/100 μL/孔）除第1、7、12列的A-D排孔，取同量HUVEC細胞接種于上述各列的E-H排孔，培養(yǎng)至細胞基本鋪滿孔板底部；取空病毒組細胞加至96孔板（3×104個/100 μL/孔）第3至7列A-H孔內(nèi)，等量干擾組細胞加入第8至12列A-H孔內(nèi)，每隔30 min吸出3、8列，4、9列，5、10列，6、11列所有孔上清液，120 min后離心，吸出2、7、12列所有孔內(nèi)上清液，吸出后每孔用PBS液輕洗，再加100 μL/孔無血清培養(yǎng)基；除D、E排外的所有孔內(nèi)加MTT（20 μL/孔），4 h后離心去上清液加DMSO（150 μL/孔），即在570 nm波長處測吸光值（A）；計算同（異）種黏附率=［同（異）種各時間段A值-同（異）種空白組A值）］/空載體組或?qū)嶒灲MA值，并隨機在熒光顯微鏡下各取5個（×200）視野觀察記錄D、E排各孔熒光細胞數(shù)，實驗重復(fù)3次。

1.2.6 血管形成實驗 細胞培養(yǎng)3天，取上清液離心備用；Matrigel膠用4℃無血清培養(yǎng)基稀釋（1：7）后鋪于96孔板（40 μL/孔），將HUVEC細胞加入上述孔（2×103個/100 μL）；分別加入上述3組細胞上清液100 μL，各孔再加100 μL無血清培養(yǎng)基。常規(guī)培養(yǎng)4天，攝像并隨機選取5處視野（×200）計錄管腔形成數(shù)（以細胞連接呈C形即為一個管腔），實驗重復(fù)3次。

1.2.7 血管擬態(tài)實驗 鋪膠同上，將3組細胞分別加入各鋪膠孔（2×103個/100 μL），各孔再加100 μL無血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)6天，攝像同上，實驗重復(fù)3次。

1.2.8 細胞Ca2+內(nèi)流的測定 細胞鋪于激光共聚焦專用培養(yǎng)皿（35 mm），待細胞生長至70%匯合，用PBS沖洗3遍，加入含5 μmol/L Rhod-2/AM的D-Hanks液（無鈣、無酚紅），37℃孵育35 min，用D-Hanks液洗去多余的Rhod-2/AM，再加入500 μL D-Hanks液孵育30 min后用激光共聚焦顯微鏡檢測，每個皿選1個視野。常規(guī)掃描30 s后加入含2 μmol/L TG和5 μmol/L Nifedipin的D-Hanks，繼續(xù)每6 s掃描1次，待細胞熒光強度基本恢復(fù)基線后，加入5 mmol/L的CaCl2，繼續(xù)掃描，以胞內(nèi)鈣熒光變化曲線的峰值評估SOCE。胞內(nèi)Ca2+濃度的變化用F/F0表示，Ca2+釋放或內(nèi)流的幅度以（Fmax-F0）與F0表示，其中F0為未作任何處理的基礎(chǔ)熒光值，F(xiàn)為任意時間點的熒光值，F(xiàn)max為最大熒光值。實驗重復(fù)3次。

1.2.9 Western blot檢 測 細 胞 ORAI1、ERK1/2、p-ERK1/2、MMP-2、VEGF和E-cadherin蛋白表達分別收集各組細胞，加RIPA裂解液（含1%PMSF），冰浴下碎解，低溫離心10 min，取上清液，用BCA法定量。每孔加等量蛋白樣品，進行SDS-PAGE凝膠電泳，然后電轉(zhuǎn)至PVDF膜、封閉，加入Anti-ORAI1（1：500）、Anti-ERK1/2（1：800）、Anti-p-ERK1/2（1：800）、Anti-MMP-2（1：1 000）、Anti-VEGF（1：800）、Anti-E-cadherin（1：1 000）和Anti-β-actin（1：2 000），4℃過夜，TBST洗膜，加入對應(yīng)二抗（1：2 500），室溫1.5 h，TBST漂洗3次后用ECL發(fā)光試劑盒顯影。凝膠成像系統(tǒng)掃描分析，以目的蛋白與β-actin的灰度值比值代表目的蛋白的表達水平，實驗重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 重組慢病毒轉(zhuǎn)染SW480的情況

熒光顯微鏡觀察顯示，干擾慢病毒和空載體慢病毒感染SW480的效率均達90%以上（圖1）。

2.2 ORAI1表達的變化

干擾組ORAI1 mRNA的表達量約為對照組的0.21倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；ORAI1蛋白的表達量約為對照組的0.39倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，圖2）。

2.3 侵襲和遷移力變化

在侵襲實驗中，干擾組穿膜細胞數(shù)（20.13±4.87）明顯少于對照組（40.33±6.13）和空病毒組（37.73± 5.42），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。在遷移實驗中，干擾組穿膜細胞數(shù)（28.20±7.23）明顯少于對照組（48.93±3.95）和空病毒組（51.73±5.19），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，圖3，4）。

2.4 黏附率變化

在同種細胞黏附實驗中，120 min時，干擾組黏附的熒光細胞數(shù)（52.93±4.12）明顯多于空病毒組（29.53±4.74），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；而在異種細胞黏附實驗中：120 min時，干擾組黏附的熒光細胞數(shù)（75.13±7.29）明顯少于空病毒組（163.8±9.04），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。計算各時段細胞間黏附率顯示：干擾組同種細胞間黏附率明顯高于空病毒組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；而異種細胞間黏附率明顯低于空病毒組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，表1）。

2.5 血管形成與血管擬態(tài)變化

實驗結(jié)果顯示：干擾組血管形成數(shù)和血管擬態(tài)數(shù)均明顯少于對照組和空病毒組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，表2）。

圖1 重組慢病毒感染SW480的熒光圖像 （×200）Figure 1 Fluoroscopic image of SW480 infected with recombinant lentivirus（×200）

圖2 3組細胞ORAI1表達變化Figure 2 Expression change of ORAI1 in the three groups of cells

2.6 外鈣內(nèi)流（SOCE）的變化

激光共聚焦結(jié)果顯示，各組細胞均成功標(biāo)記Ca2+熒光探針Rhod-2AM（圖5），與對照組和空病毒組相比，干擾組的SOCE上升最大幅度明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。SOCE曲線所代表的是不同時間點同一培養(yǎng)皿同一視野下多個細胞熒光比值的平均值（F/F0，圖6）。

2.7 Western blot檢測ERK1/2、p-ERK1/2、MMP-2、VEGF和E-cadherin蛋白的表達

3組細胞之間總ERK1/2的表達量沒有統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），干擾組p-ERK1/2、MMP-2和VEGF蛋白表達量分別為對照組的0.34、0.38和0.44倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），E-cadherin蛋白表達量為對照組2.44倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，圖7）。

表1 同種及異種細胞間黏附率的比較 （±s）Table 1 Comparison between the intercellular adhesion rates of the homogeneous and heterogeneous cells（±s）

*P＜0.05 vs.empty virus group；**P＜0.01 vs.empty virus group

Categorie Homogeneous cell adhesion Adhesion rate Heterogeneous cell adhesion Group Empty virus group Interference group Empty virus group Interference group 30 min 0.067±0.014 0.072±0.003 0.422±0.031 0.380±0.023 60 min 0.098±0.015 0.128±0.004* 0.613±0.095 0.441±0.046* 90 min 0.122±0.013 0.166±0.014* 0.720±0.048 0.553±0.070* 120 min 0.149±0.017 0.212±0.018* 0.889±0.057 0.594±0.072**

表2 各組間血管形成與血管擬態(tài)比較 （±s）Table 2 Comparison of angiogenesis and vascular mimicry among the groups（±s）

表2 各組間血管形成與血管擬態(tài)比較 （±s）Table 2 Comparison of angiogenesis and vascular mimicry among the groups（±s）

**P＜0.01，compared with control group

Group Control group Empty virus group Interference group Angiogenesis 29.87±5.11 33.40±3.42 11.73±2.25** Vascular mimicry 38.67±5.75 44.20±4.70 19.27±2.86**

圖6 3組細胞實時Ca2+熒光強度變化Figure 6 Changes in real-time Ca2+fluorescence intensity of three groups of cells

圖5 轉(zhuǎn)染細胞標(biāo)記鈣離子探針Rhod-2AM的熒光圖像（×400）Figure 5 Fluoroscopic image of infected cells marked by Ca2+indicator Rhod-2Am（× 400）

圖7 各組細胞ERK1/2、p-ERK1/2、MMP-2、VEGF和E-cadherin蛋白的表達變化Figure 7 Changes in protein expression of ERK1/2，P-ERK1/2，MMP-2，VEGF，and E-cadherin among the groups

3 討論

侵襲與轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤最主要的生物學(xué)行為，它與細胞的黏附、運動、血管生成等密切相關(guān)［5］。SOCC介導(dǎo)的SOCE是非興奮細胞產(chǎn)生Ca2+內(nèi)流的主要方式，它通過調(diào)節(jié)胞內(nèi)Ca2+的濃度，參與細胞的黏附、運動、增殖等過程［2］。Yang等［6］發(fā)現(xiàn)在乳腺癌動物模型中抑制STIM1和ORAI1蛋白的表達后，可以降低腫瘤細胞的遠處轉(zhuǎn)移能力，并且發(fā)現(xiàn)抑制0RAI1表達后腫瘤細胞的侵襲能力抑制更明顯。所以本文選取ORAI1作為研究靶標(biāo)。

本實驗沉默SW480細胞ORAI1的表達后。通過Transwell侵襲和遷移實驗、黏附實驗、血管形成和血管擬態(tài)實驗發(fā)現(xiàn)，干擾組細胞侵襲、遷移能力減弱；血管形成及血管擬態(tài)能力減弱；同種細胞間黏附力增強，而異種細胞間黏附力減弱。結(jié)果說明，ORAI1能促進SW480細胞的侵襲和遷移、促進細胞脫落與異種組織黏附、提升腫瘤新生血管的能力，最終誘導(dǎo)腫瘤轉(zhuǎn)移。

腫瘤細胞發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，必須要克服黏附分子介導(dǎo)的細胞間黏附力而從原發(fā)灶脫離。上皮鈣黏蛋白（E-cadherin）通過維持同質(zhì)細胞間的黏附來降低細胞的侵襲性［7］。Hu等［8］在研究SOCE與乳腺癌細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的關(guān)系時發(fā)現(xiàn)，Ca2+內(nèi)流可以通過誘導(dǎo)E-cadherin表達降低參與乳腺癌MCF-7細胞系EMT的發(fā)生。這與本研究結(jié)果有相同之處，沉默ORAI1的表達后，細胞Ca2+內(nèi)流降低，E-cadherin表達增加，細胞間粘附增強。由此推測，在SW480中ORAI1通過調(diào)節(jié)外鈣內(nèi)流控制細胞間的粘附。

腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過程涉及到細胞外基質(zhì)（ECM）的降解?；|(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）是一類能降解ECM的酶類，MMP2是其中最重要的成員之一［9］。Ca2+可以直接通過與CaM（鈣調(diào)蛋白）結(jié)合激活Ras，再通過激活raf、MEK級聯(lián)激活ERK1/2［10］?；罨腅RK1/2則通過誘導(dǎo)MMP2的表達參與腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移［11-12］。本實驗同樣發(fā)現(xiàn)：干擾組細胞內(nèi)磷酸化ERK1/2減少，MMP2表達降低。結(jié)果說明Ca2+可能通過促進了SW480細胞內(nèi)ERK1/ 2活化及MMP2的表達參與其侵襲轉(zhuǎn)移的調(diào)控。

腫瘤的浸潤與轉(zhuǎn)移還依賴于腫瘤血管形成，腫瘤細胞可以通過產(chǎn)生并分泌VEGF促進血管內(nèi)皮細胞增殖，導(dǎo)致血管生成［13］。研究發(fā)現(xiàn)，Ca2+內(nèi)流可以刺激腫瘤細胞釋放VEGF［14］。這與本實驗結(jié)果相同，干擾組細胞內(nèi)VEGF表達明顯降低。結(jié)果說明Ca2+促進了SW480細胞VEGF的表達。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)在SW480細胞中，ORAI1可能通過介導(dǎo)SOCE促進胞外Ca2+內(nèi)流，引起ERK1/2磷酸化、MMP2、VEGF表達的增加，E-cadherin表達降低，最終促進SW480細胞的轉(zhuǎn)移。本研究首次探討了ORAI1調(diào)控結(jié)腸癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移的可能機制，是對Ca2+促進細胞轉(zhuǎn)移機制的重要補充，后續(xù)將通過體內(nèi)實驗進一步驗證。

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（2014-06-07收稿）

（2014-07-20修回）

（本文編輯：賈樹明）

Calcium release-activated calcium channel modulator 1 promotes the migration and invasion of SW480 colon cancer cell line

Qingjie KANG1,Zheng XIANG1,Xudong PENG1,Dawei DENG1,Weixue TANG2

Zheng XIANG;E-mail:xzly@medmail.com.cn
1Department of Gastrointestinal Surgery,The First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University,Chongqing 400016, China;2Research Institute of The FirstAffiliated Hospital of Chongqing Medical University,Chongqing 400016,China
This work was supported by grants from Chongqing Municipal Key Scientific Project(No.cstc2012gg-yyjs10044)and the Science and Technology Project of Yuzhong District,Chongqing(No.20130120)

Objective:To explore the effect of calcium release-activated calcium channel modulator 1(ORAI1)on the migration and invasion of colon cancer cell line SW480 and its mechanism.Methods:The SW480 cells were infected with ORAI interference lentivirus.The expression of ORAI1 mRNA and protein was confirmed by quantitative real-time polymerase chain reaction and Western blot.Transwell chamber,adhesion,angiogenesis,and vasculogenic mimicry experiments were conducted to detect the ability of cell invasion,migration,and angiogenesis and the intercellular adhesion of homogeneous and heterogeneous cells among each group. Confocal microscopy was employed to detect the difference of store-operated Ca2+entry(SOCE)in each group.Western blott was used to detect the expression of ERK1/2,p-ERK1/2,MMP-2,VEGF,and E-cadherin protein.Results:After the infection of SW480 with the ORAI1 interference lentivirus for 72 h,significant fluorescence expression was observed.Compared with the empty vector group and control group,the expression of ORAI1 was lower in the interference group(P＜0.01).Invasion and migration ability decreased(P＜0.01);the intercellular adhesion ability of homogeneous cells increased(P＜0.05);the intercellular adhesion ability of heterogeneous cells decreased(P＜0.05);the angiogenesi and vasculogenic mimicry were enhanced(P＜0.01);the internal flow peak of SOCE was low (P＜0.05);the expression of p-ERK1/2,MMP-2,and VEGF proteins decreased(P＜0.01);and the expression of E-cadherin protein increased(P＜0.01).Conclusion:ORAI1 may promote the migration and invasion of SW480.This mechanism may be associated with the increase of SOCE.

ORAI1,SW480,migration,invasion,SOCE

10.3969/j.issn.1000-8179.20140964

①重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院胃腸外科（重慶市400016）；②實驗研究中心

*本文課題受重慶市科技攻關(guān)項目（編號：cstc2012gg-yyjs10044）和重慶市渝中區(qū)科技項目（編號：20130120）資助

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康清杰 專業(yè)方向為胃腸道腫瘤臨床與基礎(chǔ)研究。

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