呂嘉櫪， 張彪燕， 葛成源, 胡翠翠

(1.陜西科技大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院， 陜西 西安 710021; 2.北京博勝經(jīng)緯科技有限公司， 北京 100071)

0 引言

近年來，新型益生菌發(fā)酵飼料越來越受到養(yǎng)殖企業(yè)的重視，經(jīng)益生菌發(fā)酵后的飼糧營養(yǎng)價(jià)值顯著提高，活性益生菌還能促進(jìn)消化吸收，使動物對飼料的吸收利用更充分[1].另外，菌體蛋白帶有一種特殊香味，可刺激、增進(jìn)畜禽食欲，提高畜禽的采食量[2].我國蘋果產(chǎn)量居世界前列，同時(shí)產(chǎn)出大量果渣[3,4]，蘋果渣的合理利用也是近年來比較熱門的研究課題[5-8]，利用蘋果渣培養(yǎng)有益菌群可對蘋果渣進(jìn)行有效利用[9-11].本研究以蘋果鮮渣為原料，補(bǔ)加合適的碳源、氮源、生長因子，同時(shí)運(yùn)用正交試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵條件，培養(yǎng)酵母菌MB菌株，為蘋果渣的有效利用提供基礎(chǔ).

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)菌種

釀酒酵母MB(Saccharomyces cerevisiae MB),由陜西科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院微生物教研室提供.

1.2 材料

蘋果鮮渣，由陜西天佑果蔬制品有限責(zé)任公司提供.碳源：蔗糖、糖蜜、玉米粉.氮源：硫酸銨、乳清粉、玉米漿.生長因子：白蘿卜、芹菜、青椒.

1.3 檢測指標(biāo)

pH值：發(fā)酵液經(jīng)濾紙過濾后用酸度計(jì)PB-10測定.

活菌數(shù)：血球計(jì)數(shù)板直接計(jì)數(shù)[12]，稀釋平板法計(jì)菌落數(shù)[13].

菌體形態(tài)：顯微鏡下直接觀察.

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 單因素實(shí)驗(yàn)

由于蘋果渣中微生物可直接利用的單糖含量并不高，含氮量較低[9,14,15]，不能滿足微生物生長所需，故需在基礎(chǔ)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加一定量的碳源和氮源，生長因子的添加則可促進(jìn)微生物更好地生長.將蘋果渣與水以1∶10的比例混合，分別添加碳源(蔗糖、糖蜜、玉米粉)、氮源(硫酸銨、乳清粉、玉米漿)、生長因子(白蘿卜、芹菜、青椒)，設(shè)置不同濃度進(jìn)行單因素試驗(yàn).接種量2%，28℃發(fā)酵，記錄發(fā)酵過程中活菌數(shù)、pH的變化，并觀察發(fā)酵液中菌體形態(tài).

1.4.2 正交試驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取合適的碳源、氮源、生長因子，采用L9(34)正交試驗(yàn)對發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)酵時(shí)間為5天，記錄發(fā)酵過程中活菌數(shù)、pH的變化.

2 結(jié)果與討論

2.1 添加不同碳源對酵母菌MB的影響

2.1.1 蔗糖添加量對發(fā)酵液中活菌數(shù)和pH的影響

由圖1、圖2可知，在蘋果渣發(fā)酵液中添加蔗糖，對起始點(diǎn)pH的影響較小，培養(yǎng)兩天之后pH趨于穩(wěn)定.活菌數(shù)有較大幅度的增加，但最高活菌數(shù)僅為5.75×107cfu/mL，因此蔗糖不是要補(bǔ)加的理想碳源.

圖1 酵母菌在不同蔗糖 濃度下活菌數(shù)變化曲線

圖2 酵母菌在不同蔗糖 濃度下pH變化曲線

2.1.2 糖蜜添加量對發(fā)酵液中活菌數(shù)和pH的影響

圖3 酵母菌在不同糖蜜濃度下 活菌數(shù)變化曲線

由圖3、圖4可知，在蘋果渣發(fā)酵液中添加糖蜜，起始點(diǎn)pH略有降低，活菌數(shù)明顯增加，最高活菌數(shù)為7.5×107cfu/mL，且菌體形態(tài)較好，因此在蘋果渣發(fā)酵液中添加糖蜜比蔗糖好.

圖4 酵母菌在不同糖蜜 濃度下pH變化曲線

2.1.3 玉米粉添加量對發(fā)酵液中活菌數(shù)和pH的影響

圖5 酵母菌在不同玉米粉濃度下 活菌數(shù)變化曲線

圖6 酵母菌在不同玉米粉 濃度下pH變化曲線

由圖5、圖6可知，在蘋果渣發(fā)酵液中添加玉米粉，起始點(diǎn)pH有所升高，但活菌數(shù)增加較少，活菌數(shù)最大值僅為1.4×107cfu/mL，因此玉米粉不是理想碳源.

因此，在蘋果渣發(fā)酵液中補(bǔ)加的碳源，效果依次為糖蜜>蔗糖>玉米粉.

2.2 添加不同氮源對酵母菌MB的影響

2.2.1 硫酸銨添加量對發(fā)酵液中活菌數(shù)和pH的影響

圖7 酵母菌在不同硫酸銨濃度下 活菌數(shù)變化曲線

圖8 酵母菌在不同硫酸銨 濃度下pH變化曲線

由圖7、圖8可知，在蘋果渣發(fā)酵液中添加硫酸銨，初始pH略有降低，酵母菌生長較差，隨著濃度的增大，菌體生長受到抑制.

2.2.2 乳清粉添加量對發(fā)酵液中活菌數(shù)和pH的影響

圖9 酵母菌在不同乳清粉 濃度下活菌數(shù)變化曲線

圖10 酵母菌在不同乳清粉 濃度下pH變化曲線

由圖9、圖10可知，在蘋果渣發(fā)酵液中添加乳清粉，隨著濃度的增加，初始pH逐漸升高，菌體增長不明顯.

2.2.3 玉米漿添加量對發(fā)酵液中活菌數(shù)和pH的影響

圖11 酵母菌在不同玉米漿 濃度下活菌數(shù)變化曲線

圖12 酵母菌在不同玉米漿 濃度下pH變化曲線

由圖11、圖12可知，在蘋果渣發(fā)酵液中添加玉米漿，隨著濃度的增加，初始pH逐漸升高，活菌數(shù)最高為2.2×107cfu/mL，比乳清粉效果好.

在蘋果渣發(fā)酵液中補(bǔ)加氮源，酵母菌生長均不太明顯，原因可能是碳氮比不均衡.

2.3 添加不同生長因子對酵母菌MB的影響

2.3.1 白蘿卜添加量對發(fā)酵液中活菌數(shù)和pH的影響

圖13 酵母菌在不同白蘿卜添加量 下活菌數(shù)變化曲線

圖14 酵母菌在不同白蘿卜 添加量下pH變化曲線

由圖13、圖14可知，在蘋果渣發(fā)酵液中添加白蘿卜，pH小幅度波動，活菌數(shù)最高為3.8×107cfu/mL.鏡檢觀察，菌體形態(tài)良好.

2.3.2 芹菜添加量對發(fā)酵液中活菌數(shù)和pH的影響

圖15 酵母菌在不同芹菜添 加量下活菌數(shù)變化曲線

圖16 酵母菌在不同芹菜添 加量下pH變化曲線

由圖15、圖16可知，在蘋果渣發(fā)酵液中添加芹菜，初始pH升高，活菌數(shù)最高為2.1×107cfu/mL.

2.3.3 青椒添加量對發(fā)酵液中活菌數(shù)和pH的影響

圖17 酵母菌在不同青椒添 加量下活菌數(shù)變化曲線

圖18 酵母菌在不同青椒 添加量下pH變化曲線

由圖17、圖18可知，在蘋果渣發(fā)酵液中添加青椒，初始pH升高，活菌數(shù)最高為2.8×107cfu/mL.

添加這3種蔬菜，發(fā)酵前后pH變化幅度均較小，對活菌數(shù)的影響效果依次為白蘿卜>青椒>芹菜，且添加白蘿卜的發(fā)酵液中菌體形態(tài)最好.

2.4 正交設(shè)計(jì)優(yōu)化發(fā)酵工藝

根據(jù)單因素試驗(yàn)，選取糖蜜、玉米漿、白蘿卜分別作碳源、氮源、生長因子，進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，以發(fā)酵過程中測得的最大活菌數(shù)為試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行正交數(shù)據(jù)分析，見表1.發(fā)酵過程中pH變化見圖19.

表1 正交試驗(yàn)結(jié)果和直觀分析表

由表1可知，3個(gè)因素對酵母菌發(fā)酵效果的影響順序依次是A>B>C，即糖蜜>玉米漿>白蘿卜.發(fā)酵的最佳條件為A3B2C1，即添加糖蜜5%，玉米漿0.5%，白蘿卜5%.

圖19 正交試驗(yàn)發(fā)酵過程中pH變化曲線

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn)

按A3B2C1條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，活菌數(shù)最高可達(dá)1.22×108cfu/mL.表明該條件具有可行性.

3 結(jié)論

將蘋果渣與水以1∶10的比例混合，在添加碳源(蔗糖、糖蜜、玉米粉)、氮源(硫酸銨、乳清粉、玉米漿)、生長因子(白蘿卜、芹菜、青椒)進(jìn)行單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上選取合適的碳源、氮源、生長因子進(jìn)行正交試驗(yàn)，以活菌數(shù)作為主要指標(biāo)，得出對酵母

菌MB菌株生長較好的營養(yǎng)物組合為：糖蜜5%，玉米漿0.5%，白蘿卜5%.在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，活菌數(shù)可達(dá)1.22×108cfu/mL.說明利用蘋果渣培養(yǎng)酵母菌MB菌株確實(shí)可行.

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