錢衛(wèi)東， 趙德志， 付云芳，陳雪峰， 毛培宏，周穎欣， 常 凱, 謝海艷

(1.陜西科技大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院， 陜西 西安 710021； 2.新疆大學(xué) 物理科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 離子束生物技術(shù)中心， 新疆 烏魯木齊 830046)

0 引言

龍膽苦苷(Gentiopicroside)，別名龍膽苦甙，分子式為C16H20O9，分子量為356.11，為裂環(huán)環(huán)烯萜苷類化合物，屬于倍半萜類物質(zhì)，是藥用植物秦艽(Gentianamacrophylla)的主要藥用成分[1].近年來的研究表明，龍膽苦苷具有鎮(zhèn)痛、抗炎、抗菌、抗病毒、抗氧化、保肝利膽、健胃抗?jié)兊茸饔?，如作為國家一類新藥注射用秦龍苦素，為秦艽提取物龍膽苦苷的凍干粉針，用于黃疸型病毒性肝炎的治療[2-4].隨著人們對龍膽苦苷藥用價(jià)值的肯定，開發(fā)和生產(chǎn)以龍膽苦苷為原料的藥品越來越多，使得臨床上對龍膽苦苷的需求量日益增加.

龍膽苦苷多來源于龍膽科多年生草本植物秦艽.值得注意的是，秦艽藥材由于使用范圍不斷擴(kuò)大，市場需求量逐年增加，致使野生資源急劇下降，已被列入國家三級保護(hù)野生藥材[5].又因?yàn)榍剀创嬖谶m生地窄、栽培困難、生長周期長等問題，造成目前市場上秦艽資源短缺，供需矛盾非常突出.

與國外相比而言，國內(nèi)近年來對龍膽苦苷來源的研究相對較多.Tiwari和Zhang 等運(yùn)用發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobaeteriumrhizogenes)誘導(dǎo)出秦艽毛狀根，但未篩選出產(chǎn)龍膽苦苷的毛狀根[6-7].齊香君等運(yùn)用秦艽懸浮細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)龍膽苦苷，產(chǎn)量僅為0.242 mg/g[8].上述結(jié)果表明，利用毛狀根或懸浮細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)龍膽苦苷目前都未能獲得理想的結(jié)果.

因此，研究和開發(fā)秦艽新資源、解決龍膽苦苷來源短缺問題亟需尋求其它藥源途徑和新的研究方法.近年來，代謝工程因其在尋求新型藥源和藥源種質(zhì)改良方面具有獨(dú)特優(yōu)勢，已經(jīng)逐漸成為當(dāng)今國際生藥學(xué)界的研究熱點(diǎn)之一[9-12].

目前，關(guān)于秦艽藥用成分龍膽苦苷的生物合成相關(guān)基因的研究報(bào)道較少.趙鵬等分離克隆了3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A 還原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoAreductase，HMGR)基因家族的兩條基因和G10H 基因家族的一條基因，但其僅對HMGR和G10H 基因進(jìn)行了序列分析，而沒有利用基因敲除/遺傳互補(bǔ)方法在體內(nèi)進(jìn)行功能鑒定.在龍膽苦苷生物合成基因尚未闡明前，亟需尋求新思路構(gòu)建產(chǎn)天然產(chǎn)物工程菌.近年來，由我國學(xué)者自主開發(fā)的離子束介導(dǎo)藥用植物基因組總DNA轉(zhuǎn)化微生物、構(gòu)建產(chǎn)藥用植物天然藥用成分重組菌株的技術(shù)，為利用微生物合成龍膽苦苷提供了技術(shù)支持[13，14].

1 材料和方法

1.1 菌種

多形漢遜酵母(HansenulapolymorphaH.polymorpha) DL-1菌株(來源為ATCC No.26012).

1.2 培養(yǎng)基

(1)YPD固體培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20 g，酵母膏10 g，蛋白胨20 g，瓊脂粉15 g，pH 6.5.

(2)種子液培養(yǎng)基(g/L) ：葡萄糖20 g，蛋白胨20 g，酵母膏10 g，pH 6.5.

(3)發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)： 丙三醇15 g，(NH4)2SO415 g，K2HPO40.24 g，MgSO4·7H2O 1.8 g,CaCl20.28 g，NaCl 0.6 g，NaNO30.58 g，F(xiàn)eCl3SO4·6H2O 0.006 g，硫胺素鹽酸鹽0.004 g,微量元素母液1 mL.

其中，微量元素母液(mg/L):Na2MoO4·2H2O 484 mg，MnSO4·H2O 176 mg，KI 207.5，CuSO4·5H2O 40 mg,ZnSO4·7H2O 40 mg，pH為6.5.

1.3 主要試劑和儀器

龍膽苦苷標(biāo)準(zhǔn)品(美國Sigma公司)；酵母浸粉、蛋白胨、葡萄糖、瓊脂粉、CMC-Na、硅膠GF254、香草醛、醋酸鋰等(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；Tris-Hcl、十二烷基硫酸鈉(SDS) 、EDTA 、Tris飽和酚等(拜爾迪公司).

臺式冷凍離心機(jī)(Sigma);高效液相色譜儀(美國Waters);Ddevic 1多功能離子注入機(jī)(IBB).

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 秦艽的基因組DNA的提取

秦艽新鮮葉片采自陜西省太白縣秦艽種植基地.取其新鮮葉片約5 g置于研缽中，用液氮冷凍研磨至粉末，加入3.5 mL、2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、65 ℃預(yù)熱的CTAB抽提緩沖液，輕輕搖勻后分裝在1.5 mL EP管中(約1 mL/管)，置于65 ℃的水浴鍋中溫育，每隔10 min輕搖一次，溫育40 min.取出后，冷卻2 min，加入0.5 mL氯仿-異戊醇(24∶1，v/v)，漩渦振蕩2 min，然后，10,000 r/min離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移至裝有600μL異丙醇的EP管中，將離心管上下輕輕搖動30 s，使異丙醇與水層充分混合.

10,000 r/min離心2 min后，去掉上清液，自然風(fēng)干，然后加入720μL的75%乙醇及80μL 5 mol/L的醋酸鈉，輕輕搖勻；10,000 r/min離心1 min后，倒掉上清液，加入800μL 75%(體積分?jǐn)?shù))的乙醇，輕輕搖勻后，10,000 r/min離心30 s后，倒掉上清液，將離心管自然風(fēng)干；再加入50μL 0.5×TE(含RNase)緩沖液，使DNA溶解，置于37 ℃恒溫箱約15 h.置于-20 ℃保存、備用.

1.4.2 酵母菌膜的制備

取酵母菌母液100μL轉(zhuǎn)接到裝有2 mL YPD液體培養(yǎng)基的試管中，37 ℃，110 r/min培養(yǎng)16～18 h,取菌體用保護(hù)液(葡萄糖0.5%+可溶性淀粉0.5%)稀釋，采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法確定稀釋倍數(shù)，稀釋至細(xì)胞濃度為1.0×106CFU/mL，并取0.1 mL菌體稀釋液將其均勻涂布于直徑90 mm的無菌平皿中央，用無菌風(fēng)吹干制成菌膜.

1.4.3 最佳離子注入能量和劑量的探索

根據(jù)試驗(yàn)需要，設(shè)置不同的離子注入能量與劑量的組合，進(jìn)行多次重復(fù)試驗(yàn)，探索最佳的離子注入?yún)?shù)，參數(shù)設(shè)計(jì)為：能量分別是a:30 keV；b:25 keV；c:20 keV，注入劑量(ions/cm2)如表1所示.

表1 試驗(yàn)中N+注入劑量

將菌膜平皿置于離子注入機(jī)真空靶室中央進(jìn)行N+注入,按照a、b、c的能量和表1中的低能離子注入劑量注入.注入結(jié)束后，立即將2 mL不含基因組的TE溶液迅速倒入注入過的菌膜平皿中，置于 37 ℃恒溫箱中溫育2 h；然后用無菌刮鏟將菌全部刮下，取0.1 mL菌液均勻涂布于YPD固體培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)18 h.對照菌株做同樣處理，計(jì)算存活率.以低能注入劑量為橫坐標(biāo)，存活率為縱坐標(biāo)，制備注入曲線，獲得最佳的離子注入能量和劑量.

1.4.4 構(gòu)建產(chǎn)龍膽苦苷工程菌株

(1)低能離子注入酵母

利用上述獲得的最佳低能離子注入能量和劑量進(jìn)行注入.注入完畢后，立即將2 mL含有秦艽基因組的TE溶液迅速加入經(jīng)低能離子注入過的菌膜平皿中，經(jīng)TE浸泡、溫育、涂固體培養(yǎng)基，在 37 ℃恒溫培養(yǎng)18 h.取出放入4 ℃冰箱，以備初篩.

(2)重組菌株的初篩

將YPD培養(yǎng)基上生長的單菌落接入裝有5 mL YPD液體培養(yǎng)基的試管中，放入37 ℃，160 r/min搖床上培養(yǎng)90 h得發(fā)酵液，將發(fā)酵液7,000 r/min離心15 min，收集上清液用于發(fā)酵產(chǎn)物檢測.由于龍膽苦苷是環(huán)烯醚萜苷類物質(zhì)，因此，主要采用Molish反應(yīng)、香草醛反應(yīng).其操作步驟如下：

①M(fèi)olish反應(yīng).100 ℃下濃縮發(fā)酵液后，加入甲醇10 mL，過濾.取濾液3 mL放入干凈試管中，加入兩滴Molish試劑(10%的α-萘酚醇溶液)搖勻，然后沿試管壁緩慢加入約1 mL濃硫酸，靜置，觀察兩層液面交界處的顏色變化.

②香草醛反應(yīng).取樣品濃縮液1 mL加入試管中，再加入0.5 mL、5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的香草醛濃硫酸溶液，65 ℃水浴2 min,觀察溶液顏色變化.

(3)重組菌株的復(fù)篩

將初篩所得菌株接種于裝有200 mL YPD液體培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，37 ℃，160 r/min，恒溫培養(yǎng)90 h后，7,000 r/min離心15 min，收集上清液80 ℃濃縮至40 mL，加入20 mL預(yù)冷丙酮萃取，萃取3次，將收集的萃取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在40 ℃下蒸干，然后加入5 mL甲醇溶解，獲得樣品溶液，用薄層層析法和高效液相色譜法對產(chǎn)物進(jìn)行定性和定量分析.

①薄層層析法(TLC)定性檢測.將薄層層析用GF254硅膠板放入干燥箱，105 ℃活化30 min.用微量進(jìn)樣器點(diǎn)樣，在展開劑氯仿-甲醇(4∶1v/v)中展開，結(jié)束后揮發(fā)干展開劑，在紫外燈下觀察，記錄斑點(diǎn)，并計(jì)算其Rf值.

②高效液相色譜法(HPLC)定量檢測.色譜條件：色譜柱,Diamonsil C18柱(4.6 ×250 mm，5μm)；流動相,乙腈：水(40∶60，V/V)；紫外檢測器,Waters 2487；檢測波長,274 nm；進(jìn)樣量,20μL；流速,1.0 mL/min；柱溫,25 ℃.

1.4.5 遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)

將重組菌株依次劃線傳代培養(yǎng)8代，將各代菌株活化后,接種于裝有200 mL YPD培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，160 r/min ，37 ℃，恒溫培養(yǎng)90 h后，經(jīng)離心、濃縮、萃取、蒸發(fā)、溶解，制備樣品溶液.對樣品溶液經(jīng)過HPLC進(jìn)行定量檢測，比較產(chǎn)量.

2 結(jié)果與討論

2.1 最佳低能離子注入能量和劑量

分別在a、b、c三種能量下，按照表1中的N+注入劑量進(jìn)行注入.注入后，立即在每個平皿中加入2 mL不含秦艽DNA的TE溶液，37 ℃溫育2 h，用無菌刮鏟刮下薄膜后，經(jīng)平板培養(yǎng)18 h計(jì)算存活率,其結(jié)果如表2所示.

試驗(yàn)a各組經(jīng)平板培養(yǎng)后，除空白對照組外，都未長出菌落；試驗(yàn)b平面培養(yǎng)后，除對照組菌落過多之外，其余各組菌落數(shù)均有不同程度地減少，且出現(xiàn)隨著劑量的增加菌落數(shù)呈現(xiàn)先增加后減少的現(xiàn)象；試驗(yàn)c經(jīng)平面培養(yǎng)后，出現(xiàn)各組菌落數(shù)均有一定程度減少，但減少幅度較小.

產(chǎn)生上述結(jié)果的主要原因是：試驗(yàn)a是由于能量過大在對DNA產(chǎn)生更大傷害的同時(shí)，對細(xì)胞壁及細(xì)胞質(zhì)的刻蝕過于嚴(yán)重，產(chǎn)生不可逆的損傷，導(dǎo)致細(xì)胞死亡.

試驗(yàn)b當(dāng)以能量為25 keV劑量較低時(shí)，注入N+只對細(xì)胞表面進(jìn)行損傷和刻蝕，損傷程度低，易于修復(fù),因此，存活率較高.隨著注入劑量的增加，細(xì)胞表面刻蝕嚴(yán)重，離子損傷及細(xì)胞內(nèi)部產(chǎn)生大量自由基和軟射線等，致使存活率急劇下降；當(dāng)注入劑量達(dá)到20×1015ions/cm2時(shí),存活率下降到最低.隨著注入劑量的增加，可能激活細(xì)胞內(nèi)某個修復(fù)機(jī)制，導(dǎo)致存活率有小幅度回升，之后隨著離子注入劑量的增加存活率再一次下降(如圖1所示)，這一結(jié)論與毛培宏提出的離子注入與生物體的相互作用機(jī)理[15]一致.

試驗(yàn)c由于能量低，離子對細(xì)胞表面損傷和刻蝕程度較輕，經(jīng)過細(xì)胞的自我修復(fù)，存活率隨著劑量的增加雖有一定程度地降低，但幅度較小.

表2 菌落存活數(shù)

經(jīng)過上述試驗(yàn)確定，N+注入技術(shù)轉(zhuǎn)化H.polymorphaDL-1的最佳條件為：低能離子注入能量，25 keV；劑量，25×1015ions/cm2.10-3真空條件下，脈沖注入10 s，間隔10 s.

圖1 低能N+注入多形漢遜酵母的存活率曲線

2.2 初篩結(jié)果分析

在能量25 keV、注入劑量25×1015ions/cm2、10-3Pa真空條件下，注入后，加入2 mL含秦艽基因組的TE溶液浸泡.37 ℃溫育2 h，將刮下來的菌液接種到Y(jié)PD固體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)18 h，取單菌落活化后接種到100 mL YPD液體培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，對發(fā)酵產(chǎn)物采用Molish反應(yīng)、香草醛反應(yīng).

結(jié)果顯示：在2,000多株備選菌株中，有313株的發(fā)酵液在Molish反應(yīng)中有紫環(huán)產(chǎn)生；有173株的發(fā)酵液在香草醛反應(yīng)中試管底部出現(xiàn)棕色或紅色；同時(shí)在兩種顏色反應(yīng)中均有相應(yīng)顏色出現(xiàn)的僅有54株.在真空條件下未經(jīng)離子注入的酵母菌在導(dǎo)入秦艽基因組DNA的處理中，未獲得糖苷類或環(huán)烯醚萜類物質(zhì)陽性反應(yīng)的菌株.由此可說明，用低能N+介導(dǎo)將秦艽基因組導(dǎo)入酵母的方法初步認(rèn)為是可行的，同時(shí)也說明了導(dǎo)入外源DNA大分子轉(zhuǎn)化的隨機(jī)性和重組菌株的遺傳多樣性.

2.3 復(fù)篩結(jié)果分析

經(jīng)過初篩獲得了54株備選菌株，通過發(fā)酵培養(yǎng)、濃縮等，制備樣品溶液.取20 μL各樣品溶液在薄層層析展板上點(diǎn)樣、風(fēng)干.在展開劑氯仿-甲醇(4∶1，V/V)中展開，結(jié)束后揮發(fā)干展開劑，在紫外燈下觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)一株的發(fā)酵液斑點(diǎn)與龍膽苦苷的標(biāo)準(zhǔn)品在同一直線上，其Rf值完全相同，均為0.30(如圖2所示)，由此可以初步斷定，該菌株為目標(biāo)重組菌.

取Rf值一致的樣品溶液0.5 mL，用0.45μm微孔濾膜過濾，以20μL的進(jìn)樣量，25 ℃柱溫，270 nm波長，1 mL/min流速，進(jìn)行高效液相色譜(HPLC)分析檢測.對出峰時(shí)間和峰面積進(jìn)行記錄分析，其結(jié)果如圖3所示.重組菌株的發(fā)酵液在高效液相色譜中的出峰時(shí)間為12.377 min，與龍膽苦苷標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間12.370 min基本一致，而出發(fā)菌株的發(fā)酵液在該位置未出現(xiàn)峰.

由上述試驗(yàn)結(jié)果分析，可以確定該重組菌株為目標(biāo)菌株，即可以發(fā)酵生產(chǎn)龍膽苦苷的酵母重組菌株.

1：出發(fā)菌株的發(fā)酵液；2：龍膽苦苷標(biāo)準(zhǔn)品；3：重組菌株的發(fā)酵液圖2 菌株發(fā)酵液的薄層層析圖譜

(a) 龍膽苦苷標(biāo)準(zhǔn)品HPLC圖譜

(b) 重組菌株發(fā)酵液HPLC圖譜

(c) 出發(fā)菌株發(fā)酵液HPLC圖譜圖3 菌株發(fā)酵液的HPLC圖譜

2.4 產(chǎn)龍膽苦苷的重組菌株的傳代穩(wěn)定性試驗(yàn)

將復(fù)篩篩選出的重組菌株活化后接入5 mL YPD培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18 h，用甘油保藏菌種，同時(shí)傳代培養(yǎng)，斜面?zhèn)髦?代，分別對8代菌株進(jìn)行活化、發(fā)酵培養(yǎng)，對發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行高效液相色譜分析，比較產(chǎn)量.其結(jié)果如表3所示,各代產(chǎn)量略有變化，但整體基本保持不變.這說明該菌株傳代穩(wěn)定性較好.

表3 重組菌株的遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)

3 結(jié)論

本試驗(yàn)利用低能N+注入對多形漢遜酵母進(jìn)行直接注入誘變，通過存活率繪制出劑量-效應(yīng)曲線，即“馬鞍型”曲線，獲得最佳低能離子注入能量和劑量.利用最佳的低能離子注入能量和劑量注入介導(dǎo)秦艽基因組隨機(jī)轉(zhuǎn)化酵母，經(jīng)Molish反應(yīng)和香草醛反應(yīng)對轉(zhuǎn)化子進(jìn)行初篩，接著利用薄層層析法和高效液相色譜法等對初篩獲得的候選菌株進(jìn)行復(fù)篩，再結(jié)合遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)，獲得了1株遺傳穩(wěn)定能生物合成龍膽苦苷的酵母重組菌.

本試驗(yàn)結(jié)果表明，利用低能離子注入技術(shù)構(gòu)建產(chǎn)天然產(chǎn)物重組酵母菌株，具有如下優(yōu)點(diǎn)：即在事先不清楚天然產(chǎn)物生物合成途徑及其相關(guān)基因或無需克隆相關(guān)基因構(gòu)建重組質(zhì)粒的情況下，可以實(shí)現(xiàn)“一步”構(gòu)建產(chǎn)天然產(chǎn)物的重組酵母菌，為天然產(chǎn)物新藥源的開發(fā)提供了新思路、新方法.另外，人們還可以利用“逆向思維”,將獲得的產(chǎn)天然產(chǎn)物酵母重組菌作為研究對象，依托操作簡便的酵母遺傳操作平臺，深入研究天然產(chǎn)物的生物合成途徑及其相關(guān)基因的功能.

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