吳超柱，徐凡，郜炎龍，姜和，2

(1.重慶理工大學(xué)藥學(xué)與生物工程學(xué)院，重慶 400050;

2.重慶前沿生物技術(shù)有限公司，重慶 400041)

熒光標(biāo)記技術(shù)在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用

吳超柱1，徐凡1，郜炎龍1，姜和1，2

(1.重慶理工大學(xué)藥學(xué)與生物工程學(xué)院，重慶 400050;

2.重慶前沿生物技術(shù)有限公司，重慶 400041)

熒光標(biāo)記作為一種非放射性標(biāo)記技術(shù)，已成為現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)研究中不可或缺的方法之一。綜述了熒光標(biāo)記中常用的標(biāo)記試劑、檢測技術(shù)以及熒光標(biāo)記技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用進展，并展望了熒光標(biāo)記技術(shù)的未來研究趨勢和應(yīng)用前景。

熒光標(biāo)記;熒光染料;量子點

熒光標(biāo)記技術(shù)起源于20世紀(jì)40年代，最初用于標(biāo)記抗體以檢測相應(yīng)的抗原。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)、生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，新型熒光標(biāo)記試劑的發(fā)現(xiàn)以及各種先進熒光檢測技術(shù)和儀器(如流式細胞儀(FCM)、激光掃描共聚焦顯微鏡(LSCM)等的應(yīng)用，熒光標(biāo)記技術(shù)作為一種非放射性的標(biāo)記技術(shù)開始受到重視并得到發(fā)展。熒光標(biāo)記具有非放射性、操作簡便、穩(wěn)定性高、靈敏度高和選擇性好等特點，可廣泛應(yīng)用于細胞內(nèi)外物質(zhì)檢測、組織及活體動物標(biāo)記成像、藥物分析、病理模型研究及疾病早期診斷等，在生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域里發(fā)揮著重要的作用［1－2］。

1 熒光標(biāo)記的基本原理及常用試劑

熒光是指一種光致發(fā)光的冷發(fā)光現(xiàn)象。當(dāng)某種常溫物質(zhì)經(jīng)某種波長的入射光照射，該物質(zhì)吸收光能后進入激發(fā)態(tài)，并且立即退激發(fā)并發(fā)出比入射光的波長更長的出射光(通常波長在可見光波段);一旦停止入射光照射，發(fā)光現(xiàn)象也立即消失。具有這種性質(zhì)的出射光即為熒光。

熒光標(biāo)記技術(shù)是指將能發(fā)射熒光的物質(zhì)通過共價結(jié)合或物理吸附等方式標(biāo)記于所研究分子的某個基團上，用它的熒光特性來反映研究對象的信息。利用熒光標(biāo)記試劑與被研究對象(核酸、蛋白、多肽等)吸附或共價結(jié)合后其熒光特性發(fā)生改變，從而反映出有關(guān)研究對象性能的信息。

1.1 熒光素類染料

熒光素類標(biāo)記試劑包括標(biāo)準(zhǔn)熒光素及其衍生物，如異硫氰酸熒光素(FITC)、羥基熒光素(FAM)、四氯熒光素(TET)等。其中異硫氰酸熒光素(FITC)是目前應(yīng)用最為廣泛的一種熒光素衍生物，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光。熒光素類標(biāo)記試劑的主要結(jié)構(gòu)如圖1(左)所示，因苯環(huán)上有較大的羧基，使芳香環(huán)保持在垂直于生色團的位置，熒光量子產(chǎn)率提高。FITC(如圖1(右))是在熒光素的基礎(chǔ)上通過化學(xué)反應(yīng)引入硫氰酸基團得到的。硫氰酸基團通過和被標(biāo)記物如蛋白質(zhì)上的伯胺基團反應(yīng)形成硫脲鍵，從而實現(xiàn)對其的熒光標(biāo)記。FITC主要用于各種抗體蛋白標(biāo)記，還用于雜交探針、Edman降解蛋白質(zhì)測序等。FAM、TET主要用于DNA自動測序和核酸探針等。但是熒光素類衍生物普遍存在著光淬滅率高、對pH值敏感和發(fā)射波譜寬等缺點［3］。

圖1 熒光素類標(biāo)記試劑的主要結(jié)構(gòu)(左)和FITC的分子結(jié)構(gòu)(右)

1.2 羅丹明類染料

羅丹明類染料［4］(Rhodamine dye)是以氧雜蒽為母體的堿性呫噸染料，是生物醫(yī)學(xué)中常用的一類熒光染料，主要包括R101、四乙基羅丹明(RB200)和羧基四甲基羅丹明(TAMRA)等。羅丹明類染料相對于其他常用染料的優(yōu)點在于:它具有更強的光穩(wěn)定性、較高的熒光產(chǎn)量以及更低的pH值敏感性。圖2為羅丹明類的主要結(jié)構(gòu)，其中R2、R3是活性基團，主要為－NCS、－SO2X等。它們通過與被標(biāo)記物的氨基結(jié)合實現(xiàn)標(biāo)記。

近年來，報道了一些新型羅丹明類熒光染料通過增加分子共平面性、結(jié)構(gòu)剛性以及在芳環(huán)進行取代等一系列結(jié)構(gòu)修飾來彌補羅丹明類的某些功能缺陷，提高了其靈敏度、選擇性和可靠性。

圖2 羅丹明類的主要結(jié)構(gòu)

1.3 菁染料

菁染料是一種比較特殊的染料，在光照下不穩(wěn)定，但具有摩爾消光系數(shù)高、光譜范圍廣且光量子產(chǎn)率高等優(yōu)良特性［5］。菁染料的一般結(jié)構(gòu)通式如圖3所示，其兩端為吲哚、喹啉、噻唑、吡啶、吡咯等雜環(huán)，而含吲哚環(huán)的菁染料相對其他菁染料有著更好的溶解性、寫入靈敏度、反射率以及穩(wěn)定性等。目前研究較熱門的菁染料有噻唑(TO)、噁唑橙(YO)系列以及多甲川系列。菁染料主要用于標(biāo)記核酸，將菁染料與寡核苷酸探針同時使用，可顯示和定量分析細胞中的特定核酸序列。隨著相關(guān)技術(shù)的迅速發(fā)展，菁染料已經(jīng)成為核酸和蛋白質(zhì)分析的主要熒光探針之一［6］。

圖3 菁染料的一般結(jié)構(gòu)通式

1.4 其他染料

如二苯乙烯、香豆素類、吖啶類、芘類等，主要用于蛋白質(zhì)標(biāo)記;菲啶類、哌洛寧、色素酶A3等，主要用于核酸標(biāo)記。另外，以硼酸鹽為基質(zhì)的無機發(fā)光材料因具有合成溫度低、熒光亮度高、容易制備等特點被認為是很有研究和應(yīng)用價值的發(fā)光材料。稀土硼酸鹽(M2B4O7:Eu3+)也引起了人們的廣泛關(guān)注和研究［7］。

1.5 新型熒光標(biāo)記物

1.5.1 量子點

量子點(quantum dots)［8－10］是一類由Ⅱ－Ⅵ族或III－V族元素組成的能夠接受激發(fā)光產(chǎn)生熒光的半導(dǎo)體納米顆粒(semiconductor nanocrystals)。1998年Chan和Nie［11］及Bruchez等［12］首次成功用量子點標(biāo)記了HeLa細胞和3T3成纖維細胞，標(biāo)志著量子點在生物學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用開始起步。目前研究較多的主要是CdX(X為S，Se，Te)。它是一種以CdSe為核心、以ZnS為外殼的核殼結(jié)構(gòu)，因具有較高的發(fā)光產(chǎn)率且光化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定成為研究熱點。量子點的體積大小決定著它的光吸收和發(fā)射特征，其晶體的電子能級是其粒子尺寸的函數(shù)，晶粒直徑越小，其HOMO－LUMO能級差越大，則在電子躍遷發(fā)射熒光時光能越大，波長越短。例如，從2～8 nm不同直徑的CdSe/ZnS量子點發(fā)射的熒光波長范圍幾乎能夠涵蓋整個可見光區(qū)。

量子點熒光強度高且持續(xù)時間長，光化學(xué)性質(zhì)非常穩(wěn)定，不易發(fā)生光漂白，可經(jīng)受反復(fù)多次的激發(fā)，這為研究生物細胞內(nèi)分子之間的長時間作用提供了有力的工具。量子點激發(fā)光譜寬而連續(xù);熒光發(fā)射峰窄而對稱，吸光系數(shù)大，無長波拖尾。因此，同時使用不同光譜特征的量子點時其發(fā)射光譜不交疊，可實現(xiàn)一元激發(fā)多元發(fā)射的同時標(biāo)記以及多組分同時檢測。

量子點有著諸多優(yōu)良的熒光特性，使其有望作為一種理想的新型熱點熒光標(biāo)記物應(yīng)用于分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的實時動態(tài)、高靈敏、多色和多組分檢測。研究表明:量子點對大多數(shù)生物細胞無不良影響，但是否有長期毒性還有待研究。有研究稱:用脂質(zhì)體包裹量子點后可以降低其生物毒性，提高生物相容性和光穩(wěn)定性。量子點在腫瘤早期診斷及追蹤轉(zhuǎn)移性腫瘤可能性上的應(yīng)用已成為許多研究者關(guān)注的焦點。

1.5.2 綠色熒光蛋白

綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)是由下村修等于1962年在一種學(xué)名為Aequorea victoria的水母中發(fā)現(xiàn)的。GFP熒光極其穩(wěn)定，在激發(fā)光照射下，GFP抗光漂白能力比熒光素強，特別是在450～490 nm藍光波長下更穩(wěn)定。GFP融合蛋白的熒光靈敏度遠比熒光素標(biāo)記的熒光抗體高，因此更適用于定量測定與分析。但GFP不是酶，熒光信號沒有酶學(xué)的放大效果，因此GFP靈敏度可能低于某些酶類報告蛋白。GFP產(chǎn)生熒光是生物細胞的自主功能，不需要任何外源反應(yīng)底物，因此GFP可作為一種廣泛應(yīng)用的活體報告蛋白。該特點是任何酶類報告蛋白無法比擬的。2008年10月8日，日本科學(xué)家下村修、美國科學(xué)家馬丁·查爾菲和錢永健因發(fā)現(xiàn)和改造綠色熒光蛋白而獲得了當(dāng)年的諾貝爾化學(xué)獎。此后，綠色熒光蛋白被廣泛用于骨架和細胞分裂、泡囊運輸發(fā)育、腫瘤發(fā)病機制及信號傳導(dǎo)等研究領(lǐng)域［13－14］。

2 熒光標(biāo)記中常用的檢測技術(shù)

2.1 熒光顯微鏡

熒光顯微鏡(fluorescence microscope)是最常用的熒光檢測技術(shù)設(shè)備之一。它是通過紫外線照射被檢物體，使之發(fā)出熒光，然后在顯微鏡下觀察被檢物的形態(tài)及其分布，主要用于對熒光標(biāo)記的物質(zhì)進行觀察與初步定位。但是普通熒光顯微鏡靈敏度較低，不能定量地給出圖像發(fā)光的強度數(shù)值。微熒光分光光度檢測系統(tǒng)在原有普通熒光顯微鏡基礎(chǔ)上增加了光子檢測系統(tǒng)和計算機處理系統(tǒng)，能夠?qū)悠愤M行原位熒光光譜分析，即將熒光顯微鏡獲得的熒光圖像經(jīng)過光譜融合處理后得到光譜圖像，其中每一點都記錄著生物體在不同波長激發(fā)下的全部熒光信息，可用于研究生物體中的細微變化［15］。

2.2 激光掃描共聚焦顯微鏡成像技術(shù)

激光掃描共聚焦顯微鏡(laser scanning confocal microscope，LSCM)在普通熒光顯微鏡的基礎(chǔ)上配置了激光掃描裝置，通過逐點、逐行、逐面快速掃描成像。系統(tǒng)每次調(diào)焦即掃描樣品的一個平面。通過改變調(diào)焦深度來獲得樣品不同深度層次的圖像，并將圖像信息存儲于計算機內(nèi)，再通過計算機對圖像信息進行處理，就能顯示細胞樣品立體結(jié)構(gòu)的熒光圖像。目前，激光掃描共聚焦顯微技術(shù)已應(yīng)用于細胞形態(tài)定位、動態(tài)變化過程和立體結(jié)構(gòu)重組等研究，還可用于定量熒光測定和定量圖像分析［16］。

2.3 流式細胞術(shù)

流式細胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)是20世紀(jì)70年代發(fā)展起來的能快速對單細胞定量分析和分選檢測的一種新技術(shù)。它融合了熒光標(biāo)記技術(shù)、激光技術(shù)、單抗技術(shù)和計算機技術(shù)。與傳統(tǒng)熒光鏡檢技術(shù)相比，F(xiàn)CM具有極高的檢測速度與統(tǒng)計精確度［17］。流式細胞儀主要由細胞流動室、激光聚焦區(qū)、檢測系統(tǒng)、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)等4個部分組成。其工作原理是將待測細胞制成單細胞懸液，染色后進入流動室。流動室里充滿了流動的鞘液，當(dāng)鞘液壓力與樣品壓力差異達到一定程度時，鞘液包被著的樣品流入細胞并排成單列逐個經(jīng)過激光檢測區(qū)。細胞中感興趣的部分是特異性的熒光標(biāo)記。在細胞通過激光檢測區(qū)時則會產(chǎn)生特定波長的熒光，再通過信號的轉(zhuǎn)換、放大及其他處理，就可以在計算機上直觀地統(tǒng)計染上不同熒光染料的細胞各自的百分率。選擇不同的單克隆抗體及熒光染料，可以利用流式細胞儀同時測定一個細胞上的多個參數(shù)。流式細胞術(shù)為生物醫(yī)學(xué)研究提供了全新的視角和技術(shù)手段，已普遍應(yīng)用于免疫學(xué)、血液學(xué)、腫瘤學(xué)、細胞生物學(xué)等領(lǐng)域［18－20］。

2.4 熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)

熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)(fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET)是指2個熒光發(fā)色基團在足夠靠近時(距離在10 nm以內(nèi))，當(dāng)供體熒光分子的發(fā)射光譜與受體熒光分子的吸收光譜重疊時，能量向鄰近的受體分子轉(zhuǎn)移，即發(fā)生能量共振轉(zhuǎn)移的技術(shù)。共振程度與供、受體分子之間的空間距離密切相關(guān)，隨著距離延長，共振顯著減弱。利用FRET成像能夠克服熒光顯微鏡本身空間分辨率低的局限，為蛋白質(zhì)等生物大分子構(gòu)象變化和相互作用的實時動態(tài)研究提供了技術(shù)支持［21－22］。

2.5 雙光子激發(fā)熒光成像技術(shù)

雙光子激發(fā)熒光成像［23］是一種新型的三維熒光成像技術(shù)。雙光子激發(fā)是指基態(tài)熒光分子或原子在激光照射下同時吸收2個光子而成激發(fā)態(tài)的過程。雙光子激發(fā)熒光的光漂白小、光毒性小，能對細胞中熒光標(biāo)記的生物大分子進行長時間四維(空間三維、時間一維)動態(tài)觀察，因此可以作為研究細胞內(nèi)生命過程的有效手段。該方法可用于探測熒光標(biāo)記的生物大分子形態(tài)、質(zhì)量的變化以及所處的微觀環(huán)境的流動性等。

除上述檢測技術(shù)外，在實驗研究中常需要結(jié)合一些其他學(xué)科的相關(guān)原理和技術(shù)(如高效液相色譜技術(shù)、毛細管電泳技術(shù)、分光光度法等)來實現(xiàn)對熒光標(biāo)記全過程更有效的監(jiān)測［24－25］。

3 熒光標(biāo)記在生物醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用

3.1 熒光標(biāo)記應(yīng)用于細胞內(nèi)外物質(zhì)檢測

熒光標(biāo)記技術(shù)與激光掃描共聚焦顯微技術(shù)、流式細胞術(shù)等檢測技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用，可以直接動態(tài)地檢測活細胞中生物分子的位置、運動狀況及與其他分子的相互作用。

張春陽等［26］用量子點通過共價交聯(lián)方式標(biāo)記天花粉蛋白(TCS)，形成QDs－TCS，并對其質(zhì)粒DNA進行酶切反應(yīng)，通過雙光子激發(fā)掃描熒光顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)QDs－TCS能進入JAR細胞，其機制與TCS進入細胞方式相似。標(biāo)記后的QDs－TCS吸收偶極發(fā)生改變，但不影響TCS的活性，因此該實驗對研究TCS在JAR細胞內(nèi)的分布和準(zhǔn)確定位有很好的作用。

宋偉等［27］提取受試者外周血單核細胞分化為人巨噬細胞，體外培養(yǎng)人單核細胞系THP－1和鼠單核細胞系J774，以不同濃度的NBD熒光基團標(biāo)記膽固醇孵育THP－1細胞，在3種細胞中觀察膽固醇濃度和孵育時間對細胞攝取膽固醇的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn):NBD－膽固醇孵育細胞后迅速分布于細胞器中，且細胞對NBD－膽固醇的攝取具有濃度依賴性。NBD－膽固醇外流率在各種巨噬細胞中比較相似。用同位素標(biāo)記的3H－膽固醇外流率與熒光標(biāo)記的NBD－膽固醇外流率顯著相關(guān)。此研究利用了比同位素標(biāo)記法更為有效和環(huán)保的熒光標(biāo)記法測定人巨噬細胞膽固醇外流。

András Balogh等［28］用PKH26熒光染料標(biāo)記雞新城病毒，用激光掃描共焦顯微鏡對標(biāo)記病毒顆粒進行可視化定量追蹤;通過細胞凋亡、PCR以及Western印記3種方法檢測標(biāo)記的特異性，提出了通過被感染細胞分析吸附和包膜病毒細胞內(nèi)化的一種廉價、敏感和快速的方法。

3.2 熒光標(biāo)記應(yīng)用于組織及活體動物標(biāo)記成像

2002 年，Akerman［29］首次報道了巰基化靶向多肽修飾量子點用于老鼠的活體組織癌癥檢測。將巰基化靶向多肽修飾量子點復(fù)合體靜脈注射到相關(guān)癌癥老鼠體內(nèi)，5 min之后取出相應(yīng)癌變組織器官做切片并進行熒光成像觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)老鼠相應(yīng)的癌變組織內(nèi)富集著大量靶向性多肽修飾的量子點。

秦帥等［30］利用分子克隆、顯微注射等方法構(gòu)建并篩選出綠色熒光蛋白穩(wěn)定表達的轉(zhuǎn)基因斑馬魚。通過切割尾部構(gòu)建了巨噬細胞向尾部聚集的炎癥模型，并通過熒光顯微鏡活體攝像觀察了巨噬細胞的遷移過程。結(jié)果顯示:切割后斑馬魚尾部巨噬細胞數(shù)目隨時間推移而增加，6 h后數(shù)目最多。這為研究巨噬細胞的遷移行為以及炎癥藥物的高通量篩選奠定了基礎(chǔ)。

喬璐等［31］用二甲基亞砜(DMSO)溶解細胞膜，將綠色熒光分子探針加至脂質(zhì)凍干粉內(nèi)并與溶媒液相溶，通過高速振蕩制成了熒光標(biāo)記的脂質(zhì)微泡。將其經(jīng)耳緣靜脈注射入6只隨機選取的體重相似的雄性新西蘭大白兔，動態(tài)觀察微泡在兔肝臟實質(zhì)上的顯影效果;然后通過手術(shù)切除兔子的部分肝臟，在熒光顯微鏡下觀察切片中熒光素的分布情況。結(jié)果顯示:熒光標(biāo)記的脂質(zhì)微泡大小均一，粒徑大小達到進入肺循環(huán)的標(biāo)準(zhǔn)，在兔肝臟內(nèi)顯影效果顯著。

3.3 熒光標(biāo)記應(yīng)用于藥物分析領(lǐng)域

通常藥物進入體內(nèi)之后將處于復(fù)雜的生物介質(zhì)中，濃度水平低且呈現(xiàn)動態(tài)變化。許多檢測方法因檢測限量的關(guān)系而無法用于其體內(nèi)含量的測定，因此，為測定所采集的生物樣本還需要經(jīng)過適當(dāng)?shù)念A(yù)處理。熒光標(biāo)記技術(shù)以其靈敏度高、檢測限低、操作方便等諸多優(yōu)勢成為很好的輔助技術(shù)，并在藥物分析領(lǐng)域得到了較廣泛的應(yīng)用［32］。

康迪等［33］利用海膽黃多糖(SEP)具有還原性末端的特點，在其半縮醛基的還原氨化中引入易與FITC反應(yīng)的仲氨基，并以熒光標(biāo)記SEP(SEPTyr－FITC)樣品，研究其在鼠體內(nèi)藥代動力學(xué)。此方法的定量下限為0.02 mg/mL，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍為0.02～1.0 mg/mL，相對回收率均在85%～115%。

熒光標(biāo)記除用于檢測體外樣本中的藥物外，也可用于藥物在體內(nèi)的實時監(jiān)測。如Ramjiawan等［34］用近紅外染料Cy5.5.18標(biāo)記抗腫瘤抗體片段NovoMab－G2－scFv，并對其在裸鼠體內(nèi)的藥動學(xué)進行了研究。近紅外熒光成像顯示標(biāo)記后的抗體片段進入裸鼠體內(nèi)后主要分布在肝臟、腎臟和腫瘤中。此外，實驗還獲得了抗體片段在腫瘤組織內(nèi)的有關(guān)動力學(xué)參數(shù)。

3.4 熒光標(biāo)記應(yīng)用于病理模型研究

熒光標(biāo)記成像具有照射能量低、靈敏度高、安全環(huán)保以及成像系統(tǒng)價格低的優(yōu)點，這使得熒光標(biāo)記技術(shù)廣泛應(yīng)用于組織及動物病理模型的研究中，尤其在腫瘤模型方面。

高苒等［35］將紅色熒光蛋白(DsRed)標(biāo)記的B16腫瘤細胞分別接種到野生型C57小鼠和綠色熒光蛋白(GFP)轉(zhuǎn)基因小鼠皮下，建立了熒光標(biāo)記的小鼠B16腫瘤模型。在該模型基礎(chǔ)上，利用活體熒光成像儀和熒光顯微鏡可高靈敏度動態(tài)地觀察腫瘤的生長狀況及與宿主之間的相互作用等。李小穎等［36］制備并篩選得到了穩(wěn)定高表達的綠色熒光蛋白的人結(jié)腸腺癌細胞。通過熒光成像技術(shù)，無創(chuàng)傷性地對HCT－8腫瘤細胞在裸鼠體內(nèi)生長和瘤體形成過程進行了連續(xù)且多次重復(fù)地觀察。此研究建立了一種新的腫瘤動物模型，對體內(nèi)監(jiān)測腫瘤的早期生長有著重要意義。黃偉謙等［37］用含逆轉(zhuǎn)錄病毒pLNCX－DsRed－2的PT67包裝細胞轉(zhuǎn)染人骨肉瘤細胞系143B，將其原位接種到裸鼠脛骨近端使之成瘤，再通過活體熒光成像觀察骨肉瘤的生長和肺轉(zhuǎn)移情況，建立了原位骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移裸鼠模型，為骨肉瘤體內(nèi)監(jiān)測和抗腫瘤藥物藥效評價提供了理想的動物模型和參考依據(jù)。

3.5 熒光標(biāo)記應(yīng)用于疾病早期診斷。

免疫熒光法廣泛用于病毒、細菌、立克次體、原生動物以及真菌和抗各種微生物抗體的檢測中，對相關(guān)疾病早期診斷起著重要作用［38］。李鐘擇等［39］用乙腦病毒感染BHK21傳代細胞固定后作為間接免疫熒光染色的抗原底物，對60例血清學(xué)常規(guī)檢測確診為乙腦病人的急性期血清進行了檢測，結(jié)果顯示57例為陽性。同時，對26例非乙腦病人和32例健康人血清的檢測均未發(fā)現(xiàn)特異性IgM抗體。由于抗乙腦病毒IgM抗體只有乙腦病人才具備，因此可認為此檢測技術(shù)對乙腦病的診斷具有特異性和可靠性，為乙腦病人的早期特異性診斷提供了一個較好的方法。施強等［40］聯(lián)合聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和免疫熒光法(IF)2種方法診斷急性肺炎衣原體感染取得了較好的效果。用PCR法檢測肺炎衣原體DNA，用免疫熒光法檢測靜脈血中IgG和IgM抗體。結(jié)果表明:76個病例中，2種方法單獨檢測同為陽性的有6例;只有PCR顯示陽性的有3例;只有血清抗體為陽性的有1例;聯(lián)合使用2種方法，檢出結(jié)果的陽性率均高于單獨使用的任何一種方法檢出的陽性率。

此外，伴隨基因突變檢測技術(shù)的發(fā)展以及許多遺傳疾病相關(guān)基因的研究，利用熒光標(biāo)記核酸探針技術(shù)逐漸成為相關(guān)遺傳病的有效診斷手段。阿爾茨海默病(Alzheimer，AD)是老年人中常見的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，它嚴(yán)重影響著患者的認知功能和生活質(zhì)量。楊華靜等［41］使用量子點與AD病相關(guān)基因ApoEE4等位基因特異性寡核苷酸反應(yīng)合成探針，用以檢測陽性標(biāo)本和陰性標(biāo)本的ApoE的基因型。結(jié)果顯示:新型熒光探針檢測結(jié)果與標(biāo)本基因型一致。因此，量子點標(biāo)記探針在Alzheimer病相關(guān)基因檢測中相比傳統(tǒng)方法表現(xiàn)出更優(yōu)良的特性。

同樣，針對病原微生物的已知部分核酸序列設(shè)計探針，用熒光原位雜交的方法可以實現(xiàn)對其檢測診斷。

4 展望

在現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中，研究和探索有效、安全、高靈敏度的非同位素檢測方法一直是各國研究者共同努力的方向。熒光標(biāo)記技術(shù)自面世以來以其獨特的優(yōu)勢和特性在生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域獲得了極為廣泛的應(yīng)用。新出現(xiàn)的熒光標(biāo)記物將發(fā)揮更多的優(yōu)勢，特別是量子點更是顯示了無可限量的研究價值和應(yīng)用前景。隨著流式細胞儀、激光掃描共聚焦顯微鏡等先進熒光檢測儀器和計算機技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，以及對新型熒光染料的不斷探索，熒光標(biāo)記技術(shù)必將作為一種強有力的研究工具，在人類探索生命科學(xué)的過程中發(fā)揮巨大的作用。

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(責(zé)任編輯 何杰玲)

Application of Fluorescent Labeling Technique in the Research of Biology and Medicine

WU Chao－zhu1，XU Fan1，GAO Yan－long1，JIANG He1，2
(1.School of Pharmacy and Bioengineering，Chongqing University of Technology，Chongqing 400054，China;2.Chongqing Frontier Biotechnologies Co，Chongqing 400041，China)

In recent years，the technique of fluorescent labeling and detection has achieved rapid development and wide application.Fluorescent labeling as a non－radioactive labeling technique has become one of the indispensable methods in modern biomedical research.In this paper，commonly used fluorescent labeling reagents，detection technology，advances in applications of fluorescent labeling in biomedical research and the future prospects of the fluorescent labeling technology are briefly reviewed.

fluorescent labeling;fluorescent dye;quantum dot

R318.51

A

1674－8425(2014)05－0055－08

10.3969/j.issn.1674－8425(z).2014.05.012

2014－01－28

國家科技重大專項“重大新藥創(chuàng)制”(2009ZX09401－004)

吳超柱(1987—)，男，湖北人，碩士研究生，主要從事多肽相合成與抗HIV藥物研究。

吳超柱，徐凡，郜炎龍，等.熒光標(biāo)記技術(shù)在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用［J］.重慶理工大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2014(5):55－62.

format:WU Chao－zhu，XU Fan，GAO Yan－long，et al.Application of Fluorescent Labeling Technique in the Research of Biology and Medicine［J］.Journal of Chongqing University of Technology:Natural Science，2014 (5):55－62.