王博文，徐兆慧，杜 勇，陳 勝，劉芳娥

(第四軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，陜西西安 710032)

睡眠是維持機(jī)體生理活動(dòng)和心理活動(dòng)正常運(yùn)行的重要保證。睡眠剝奪(sleep deprivation, SD)是指由于各種原因引起的機(jī)體睡眠量不足的狀態(tài)[1]。隨著社會(huì)節(jié)奏的加速、競(jìng)爭(zhēng)壓力的加大、網(wǎng)絡(luò)的普及、持續(xù)性加班、不健康的生活方式等，致使越來(lái)越多的人處于不同程度的睡眠剝奪狀態(tài)，尤其是某些特殊職業(yè)，如醫(yī)務(wù)人員、執(zhí)勤人員、航空航海乘務(wù)人員，或在某些極端情況下，如災(zāi)害救援、物資搶運(yùn)、戰(zhàn)時(shí)狀態(tài)等，睡眠剝奪現(xiàn)象就會(huì)時(shí)常發(fā)生。睡眠可影響動(dòng)物的行為和生理功能，如學(xué)習(xí)記憶和認(rèn)知能力[2]。研究證實(shí)睡眠剝奪的大鼠學(xué)習(xí)記憶能力明顯下降[3-4]。睡眠剝奪對(duì)腦功能以及學(xué)習(xí)記憶的影響顯著，并且已經(jīng)得到公認(rèn)。因此，研究在不可避免的睡眠剝奪情況下，怎樣減少睡眠剝奪對(duì)腦功能以及學(xué)習(xí)記憶的影響，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。但是，目前鮮見(jiàn)這方面的研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)擬觀(guān)察不同的睡眠剝奪方式對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力和行為的影響，為減少睡眠剝奪對(duì)腦功能以及學(xué)習(xí)記憶的影響提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)；同時(shí)檢測(cè)大鼠大腦皮層、海馬以及血漿中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和乙酰膽堿酯酶(TChE)的含量，探討其可能的發(fā)生機(jī)制。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物上海產(chǎn)Sprague Dawley大鼠24只，成年、雄性、健康，體質(zhì)量(300±30)g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2藥品與儀器Morris水迷宮、曠場(chǎng)反應(yīng)箱(成都泰盟科技有限公司)；SOD、MDA和TChE試劑盒(南京建成生物技術(shù)公司)；離心機(jī)，721型分光光度計(jì)，恒溫水浴鍋等。

1.3方法

1.3.1動(dòng)物分組及不同方式睡眠剝奪模型的建立 將24只大鼠適應(yīng)環(huán)境7 d后隨機(jī)分為4組，每組6只：空白組(不做任何處理，正常睡眠)，對(duì)照組(連續(xù)睡眠剝奪120 h)，實(shí)驗(yàn)1組(睡眠剝奪共計(jì)120 h，分3次進(jìn)行，每次40 h；間歇2次，每次10 h，共間歇20 h)，實(shí)驗(yàn)2組(睡眠剝奪共計(jì)120 h，分6次進(jìn)行，每次20 h；間歇5次，每次4 h，共間歇20 h)，見(jiàn)圖1。

1.3.2采用改良多平臺(tái)法建立大鼠的睡眠剝奪模型 睡眠剝奪箱中央放置4個(gè)高15 cm圓形平臺(tái)，直徑6 cm，平臺(tái)向中間凹陷，僅夠大鼠在平臺(tái)上站立。剝奪箱內(nèi)注有水，水高5 cm，水溫保持恒定。大鼠進(jìn)入睡眠時(shí)，由于骨骼肌的松弛使大鼠掉入水中而驚醒，又跳上平臺(tái)，造成睡眠剝奪?？瞻捉M大鼠平臺(tái)直徑15 cm，大鼠可以在平臺(tái)上睡眠，其余與實(shí)驗(yàn)組環(huán)境相同。

圖1 各組大鼠不同睡眠剝奪方式模型的建立

1.3.3行為檢測(cè) 用曠場(chǎng)反應(yīng)箱測(cè)試大鼠行為的變化，將曠場(chǎng)反應(yīng)箱放置在一個(gè)較封閉的屋內(nèi)。曠場(chǎng)反應(yīng)箱為一個(gè)底部面積為100 cm×100 cm，高30 cm的方形容器，曠場(chǎng)正上方有一個(gè)攝像頭監(jiān)視大鼠活動(dòng)，并可以將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和圖像信息輸入計(jì)算機(jī)。觀(guān)察大鼠在曠場(chǎng)反應(yīng)箱中5 min內(nèi)的運(yùn)動(dòng)。靜止總時(shí)間(total still time, TST)表示大鼠在曠場(chǎng)反應(yīng)箱中5 min內(nèi)靜止的總時(shí)間，運(yùn)動(dòng)總距離(total movement distance, TMD)表示大鼠在曠場(chǎng)反應(yīng)箱中5 min內(nèi)運(yùn)動(dòng)的總距離。中心逗留時(shí)間(center stay time, CET)表示大鼠在曠場(chǎng)反應(yīng)箱中5 min內(nèi)在內(nèi)環(huán)的停留時(shí)間，角落逗留時(shí)間(corner stay time, COT)表示大鼠在曠場(chǎng)反應(yīng)箱中5 min內(nèi)在曠場(chǎng)四角的停留時(shí)間。內(nèi)環(huán)是指以曠場(chǎng)中心點(diǎn)為圓心，以10 cm為半徑的圓。

1.3.4學(xué)習(xí)記憶能力的測(cè)試 用Morris水迷宮法進(jìn)行大鼠學(xué)習(xí)記憶的訓(xùn)練與測(cè)試，其主要測(cè)試大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力。水迷宮為一直徑120 cm、高50 cm的圓形水池，池內(nèi)水深25 cm，水池按方位平均分為4個(gè)象限，設(shè)定4個(gè)入水點(diǎn)。在一個(gè)象限內(nèi)置一個(gè)直徑7 cm、高23 cm的白色平臺(tái)，平臺(tái)沒(méi)于水面下2 cm。水溫保持在20 ℃左右。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中水池及周?chē)h(huán)境保持不變。實(shí)驗(yàn)時(shí)，將大鼠面向池壁從4個(gè)入水點(diǎn)分別放入水池，用秒表記錄大鼠的逃避潛伏期[即從大鼠入水到找到水下隱蔽平臺(tái)并站立于其上所需時(shí)間(s)]，大鼠找到平臺(tái)后，讓其在平臺(tái)上站立10 s。若入水后60 s大鼠未能找到平臺(tái)，則將其輕輕從水中拖上平臺(tái)，并停留10s，然后進(jìn)行下一次實(shí)驗(yàn)。將每只大鼠從4個(gè)入水點(diǎn)分別放入水池為1輪訓(xùn)練，1輪訓(xùn)練進(jìn)行4次，訓(xùn)練2輪，共訓(xùn)練8次，每次60 s，2次訓(xùn)練之間間隔30 s。訓(xùn)練成功的標(biāo)志是大鼠在60 s內(nèi)能夠找到平臺(tái)，淘汰訓(xùn)練未成功的大鼠。記錄每只大鼠逃避潛伏期(escape latency, EL)的時(shí)間。

行為檢測(cè)后對(duì)大鼠進(jìn)行學(xué)習(xí)記憶的訓(xùn)練，訓(xùn)練成功后，即開(kāi)始實(shí)驗(yàn)監(jiān)測(cè)。實(shí)驗(yàn)時(shí)，將大鼠面向池壁從4個(gè)入水點(diǎn)分別放入的逃避潛伏期(s)取均數(shù)，作為測(cè)試成績(jī)，若大鼠在60 s內(nèi)未找到平臺(tái)，則以60 s計(jì)。

1.3.5血漿SOD和MDA的測(cè)定 各組大鼠在水迷宮測(cè)量后，立即用200 g/L的烏拉坦進(jìn)行腹腔注射，每只大鼠2 mL。然后斷頭處死大鼠，取血5 mL(每毫升全血加肝素100 U)，靜置30 min，3 000 r/min離心10 min，取血漿置于-20 ℃凍存待測(cè)。根據(jù)試劑盒的操作步驟，采用羥胺法檢測(cè)SOD活力，TBA法檢測(cè)MDA含量。

1.3.6海馬和大腦皮層內(nèi)SOD、MDA和TChE的測(cè)定 于冰浴中取出海馬與大腦皮層，分析天平稱(chēng)質(zhì)量，按質(zhì)量海馬和大腦皮層分別加冰冷的100 mmol/L PBS溶液(pH 7.0)稀釋至100 g/L，并以玻璃勻漿器勻漿，離心3 min(3 000 r/min)后沉淀，取上清液待測(cè)。根據(jù)試劑盒的操作步驟，采用羥胺法檢測(cè)SOD活力，TBA法檢測(cè)MDA含量，比色法檢測(cè)TChE含量。

2結(jié)果

2.1不同方式睡眠剝奪對(duì)大鼠行為興奮性、探索性和學(xué)習(xí)記憶能力的影響曠場(chǎng)反應(yīng)測(cè)試結(jié)果顯示，對(duì)于TST、CET和COT，實(shí)驗(yàn)組時(shí)間均較空白組長(zhǎng)(P<0.01)，而較對(duì)照組短(P<0.01)，而且實(shí)驗(yàn)2組較實(shí)驗(yàn)1組時(shí)間短(P<0.01)；而對(duì)于TMD，實(shí)驗(yàn)組較空白組短(P<0.01)，而較對(duì)照組長(zhǎng)(P<0.01)，且實(shí)驗(yàn)2組較實(shí)驗(yàn)1組長(zhǎng)(P<0.01)。

水迷宮中逃避潛伏期的測(cè)試，實(shí)驗(yàn)組均較空白組延長(zhǎng)(P<0.01)，而較對(duì)照組縮短(P<0.01)，而且實(shí)驗(yàn)2組較實(shí)驗(yàn)1組縮短(P<0.01，表1)。

表1 各組大鼠行為和學(xué)習(xí)記憶能力的比較

與空白組比較，*P<0.01；與對(duì)照組比較，△P<0.01；與實(shí)驗(yàn)1組比較，▲P<0.01，#P<0.05。

2.2不同方式睡眠剝奪大鼠血漿、海馬和大腦皮層內(nèi)SOD和MDA含量的變化大鼠血漿、海馬和大腦皮層組織中SOD含量，實(shí)驗(yàn)組較空白組低(P<0.01)，較對(duì)照組高(P<0.01)，而且實(shí)驗(yàn)2組較實(shí)驗(yàn)1組高(P<0.01，表2)；而血漿、海馬和大腦皮層組織中MDA含量，實(shí)驗(yàn)組較空白組高(P<0.01)，較對(duì)照組低(P<0.01)，而且實(shí)驗(yàn)2組較實(shí)驗(yàn)1組低(P<0.01，表3)。

2.3不同方式睡眠剝奪大鼠海馬和大腦皮層內(nèi)TChE含量的變化大鼠海馬和大腦皮層中TChE含量，實(shí)驗(yàn)組較空白組高(P<0.01)，較對(duì)照組低(P<0.01)，而且實(shí)驗(yàn)2組較實(shí)驗(yàn)1組高(P<0.01，表4)。

表2 血漿、海馬和大腦皮層內(nèi)SOD含量的比較

與空白組比較，*P<0.01；與對(duì)照組比較，△P<0.01，▲P<0.05；與實(shí)驗(yàn)1組比較，#P<0.01。

3討論

研究證明，睡眠剝奪對(duì)學(xué)習(xí)記憶有損傷作用[4-5]。我們希望通過(guò)構(gòu)建不同方式睡眠剝奪的大鼠模型來(lái)研究在不可避免的睡眠剝奪情況下，怎樣減少睡眠剝奪對(duì)腦功能以及學(xué)習(xí)記憶的影響，提高工作和學(xué)習(xí)效率。因此，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)2個(gè)實(shí)驗(yàn)組給予不同的間斷性睡眠剝奪方式，并且設(shè)計(jì)一個(gè)空白組和一個(gè)完全睡眠剝奪的對(duì)照組，以此來(lái)模擬現(xiàn)實(shí)情況，并且每組大鼠睡眠剝奪總時(shí)間一樣，間斷總時(shí)間也一樣，增加了每組之間的可比性。

表3 血漿、海馬和大腦皮層內(nèi)MDA含量的比較

與空白組比較，*P<0.01；對(duì)照組比較，△P<0.01；與實(shí)驗(yàn)1組比較，▲P<0.01。

表4 海馬和大腦皮層內(nèi)TChE含量的比較

與空白組比較，*P<0.01；與對(duì)照組比較，△P<0.01；與實(shí)驗(yàn)1組較，▲P<0.01。

曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中用靜止總時(shí)間和運(yùn)動(dòng)總距離指標(biāo)考察大鼠的興奮性狀態(tài)。大鼠在曠場(chǎng)反應(yīng)箱中，由于環(huán)境陌生，基本上處于運(yùn)動(dòng)狀態(tài)[6]。本研究結(jié)果顯示，睡眠剝奪期間的間歇次數(shù)多，一次性間歇時(shí)間短的大鼠相比而言，運(yùn)動(dòng)能力較強(qiáng)，說(shuō)明間歇次數(shù)多的大鼠運(yùn)動(dòng)減弱程度低。實(shí)驗(yàn)用中心逗留時(shí)間和角落逗留時(shí)間兩個(gè)指標(biāo)考察大鼠的探索性行為，動(dòng)物在情緒興奮時(shí)，更容易向空曠的地方進(jìn)行探索。因此，在曠場(chǎng)中間逗留時(shí)間較長(zhǎng)，反之則會(huì)在角落逗留時(shí)間較長(zhǎng)[7]。在水迷宮實(shí)驗(yàn)中用逃避潛伏期來(lái)考察大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力[8]，學(xué)習(xí)記憶能力強(qiáng)的大鼠逃避潛伏期短[9]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，間歇次數(shù)多、每次間歇時(shí)間短的大鼠，學(xué)習(xí)記憶能力和興奮性較強(qiáng)，逃避潛伏期短，說(shuō)明睡眠剝奪總時(shí)間雖然一樣，但是有間歇的大鼠學(xué)習(xí)記憶能力明顯比連續(xù)睡眠剝奪的對(duì)照組減弱程度稍低；間歇總時(shí)間一樣，但是間歇次數(shù)越多，大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的減弱程度就越低。

SOD是重要的金屬酶，為機(jī)體直接清除自由基的重要酶類(lèi)，通過(guò)歧化反應(yīng)清除H2O2和OH·的前身O2，從而保護(hù)細(xì)胞免受毒性氧自由基的損壞[10]。睡眠剝奪后腦組織SOD活性降低，提示腦內(nèi)氧自由基的含量升高，由此推測(cè)氧自由基增加及被清除能力減弱可能是睡眠剝奪后腦功能損害、學(xué)習(xí)記憶能力下降的重要原因之一[11]。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化物的分解產(chǎn)物，為一種重要的生物大分子交聯(lián)劑，它能交聯(lián)蛋白質(zhì)與核酸，使DNA發(fā)生突變，影響信息傳遞、轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成能力下降或合成蛋白質(zhì)功能紊亂，從而表現(xiàn)出記憶力和智力下降，故其含量間接地反映了自由基的損害程度[12-14]。睡眠期間的很多神經(jīng)遞質(zhì)影響學(xué)習(xí)記憶，乙酰膽堿(ACh)就是其中之一。TChE是腦內(nèi)與學(xué)習(xí)記憶相關(guān)的重要酶類(lèi)之一，可分解突觸間隙的神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿，使乙酰膽堿含量降低；TChE活性增加會(huì)導(dǎo)致腦內(nèi)學(xué)習(xí)記憶活動(dòng)障礙[14]。通過(guò)測(cè)量TChE含量可以間接反應(yīng)大鼠大腦中ACh含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，睡眠剝奪間歇次數(shù)多、一次性間歇時(shí)間短的大鼠SOD含量較高，MDA和TChE含量較低；睡眠剝奪總時(shí)間雖然一樣，但是有間歇的大鼠SOD含量明顯比連續(xù)睡眠剝奪的對(duì)照組減少程度低，MDA和TChE含量明顯比連續(xù)睡眠剝奪的對(duì)照組增高程度低；間歇總時(shí)間一樣，但是間歇次數(shù)越多，大鼠SOD含量越高，MDA和TChE含量越低，大鼠大腦功能損傷較輕，學(xué)習(xí)記憶能力越強(qiáng)，進(jìn)一步驗(yàn)證了行為學(xué)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。

總之，與睡眠剝奪間歇次數(shù)多的大鼠相比，間歇次數(shù)少的大鼠行為興奮性和學(xué)習(xí)記憶能力較強(qiáng)；同時(shí)，大鼠血漿、海馬和大腦皮層內(nèi)MDA、TChE含量較低， SOD的活性較高。說(shuō)明間斷性睡眠剝奪增強(qiáng)大鼠抗自由基和抗過(guò)氧化損傷能力，減少大鼠大腦內(nèi)ACh的含量降低可能是增強(qiáng)學(xué)習(xí)記憶能力的重要機(jī)制之一。因此，在一些由于緊急情況而不可避免造成睡眠剝奪的情況下，盡可能安排多次少量的間歇休息時(shí)間，以減少睡眠剝奪對(duì)機(jī)體學(xué)習(xí)記憶和行為的影響，提高工作效率。

參考文獻(xiàn)：

[1] 孫慧，姚明輝，等. 睡眠不足及奪眠引起機(jī)體生理功能的變化[J]. 世界臨床藥物，2009, 30(4):233-236.

[2] VILLALOBOS C, ANDRADE R. Visinin-like neuronal calcium sensor proteins regulate the slow calcium-activated after-hyperpolarizing current in the rat cerebral cortex[J]. Neurosci, 2010, 30:14361-14365.

[3] COLLINS MA, TAJUDDIN N, NEAFSEY EJ. Effect of adolescent/adult binge-pattern ethanol exposure on rat brain aquaporin-4 and phospholipase A2 levels[J]. Soc Neurosci Abstr, 2011, 37:256.

[4] ZADOR Z, STIVER S, WANG V, et al. Role of aquaporin-4 in cerebral edema and stroke. In: Handbook of experimental pharmacology[J]. Berlin, 2009 190:159-170.

[5] HERATH S, LILLY ST, FISCHER DP, et al. Bacterial lipopolysaccharide induces an endocrine switch from prostaglandin F2alpha to prostaglandin E2 in bovine endometrium[J]. Endocrinology, 2009, 150:1912-1920.

[6] CUI W, DARBY-KING A, GRIMES MT,et al. Odor preference learning and memory modify GluA1 phosphorylation and GluA1 distribution in the neonate rat olfactory bulb: Testing the AMPA receptor hypothesis in an appetitive learning model[J]. Learn Mem, 2011, 18: 283-291.

[7] VAN DORT CJ．BAGHDOYAN HA．LYDIC R．Adenosine A(1)and A(2A)receptors in mouse prefrontal cortex modulate acetylcholine release and behavioral arousal[J]. Neurosci, 2009, 29:871-881.

[8] LIM S, STRAHL T, THORNER J, et al. Structure of a Ca2+—myristoyl switch protein that controls activation of a phosphatidylinositol 4-kinase in fission yeast[J]. Biol Chem, 2011, 286: 12565-12577.

[9] JO J, SON GH, WINTERS BL, et al. Muscarinic receptors induce LTD of NMDAR EPSCs via a mechanism involving hippocalcin, AP2 and PSD-95[J]. Nat Neurosci, 2010, 13:1216-1224.

[10] ALIKUNJU S, ABDUL MUNEER PM, ZHANG Y,et al. The inflammatory footprints of alcohol-induced oxidative damage in neurovascular components[J]. Brain Behav Immun, 2011, 25(Suppl 1):S129-S136.

[11] JOLITHA AB, SUBRAMANYAM MV, ASHA DEVI S. Age-related responses of the rat cerebral cortex: influence of vitamin E and exercise on the cholinergic system[J]. Biogerontology, 2009, 10:53-63.

[12] NIIJIMA F, SAITO H, MURAI S, et a1. Effects of atomoxetine on levels of monoamines and related substances in discrete brain regions in mice intermittently deprived of rapid eye movement sleep[J]. Biol Pharm Bull, 2010, 33:617-621.

[13] BLURTON-JONES M, KITAZAWA M, MARTINEZ-CORIA H, et al. Neural stem cells improve cognition via BDNF in a transgenic model of Alzheimer disease[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2009, 106:13594-13599.

[14] BRINTON RD. Estrogen-induced plasticity from cells to circuits: predictions for cognitive function[J]. Trends in Pharmacological Sciences, 2009, 30(4):212-222.